響應面法優化非達霉素發酵培養基及中試應用

摘要：目的 篩選非達霉素游動放線菌FD-13-194，優化發酵培養基組分，提高非達霉素發酵產量，為其工業化生產奠定基礎。方法 基于單因素實驗結果，通過Plackett-Burman實驗、最陡爬坡實驗和響應面法，進行產非達霉素發酵培養基配方的優選。結果 產非達霉素的最優發酵培養基配方為：葡萄糖30 g/L、糊精60.4 g/L、玉米蛋白粉10 g/L、黃豆餅粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、NaCl 2.3 g/L、Tween-80 2 g/L和CaCO3 4 g/L。使用該配方，在2 T罐中非達霉素的平均發酵產量達到3501 mg/L，比原配方提高了36.1%，同時有效去除了副產物雜質1和2，雜質3的比例降低10%以上，中試放大效果良好。結論 采用響應面法優化菌株FD-13-194的發酵培養基，在實驗室和中試生產中顯著提高了非達霉素的發酵產量，展現出極大的工業應用潛力。

關鍵詞：非達霉素；游動放線菌；響應面法；中試發酵

中圖分類號：R978 文獻標志碼：A

Optimizing the fermentation medium of fidaxomicin by response surface methodology and its pilot application

Zhang Li， Mi Guandong， Wang Ang， Ren Fengzhi， Lin Yang， and Li Xiaolu

（ National Engineering Research Center of Microbial Medicine， Hebei Industry Microbial Metabolic Technology Innovation Centre， New Drug Research amp; Development Company of NCPC， Shijiazhuang 052165）

Abstract Objective To screen the high-yield strain Actinoplanes deccanensis FD-13-194， optimize the composition of the fermentation mediums， improve the fermentation yield， and lay the foundation for its industrial production. Methods Based on the results of single factor tests， the composition of the fermentation medium was optimized by the Plackett-Burman test， the steepest climbing test， and the response surface method. Results The optimal fermentation medium formula for high production of fidaxomicin included： Glucose 30 g/L， dextrin 60.4 g/L，

corn protein powder 10 g/L， soybean powder 10 g/L， peptone 20 g/L， NaCl 2.3 g/L， Tween-80 2 g/L， and CaCO3 4 g/L.

Using this formula， the average yield of fidaxomicin reached 3501 mg/L by the 2 T fermentor tank， 36.1% higher than that in the original formula. Simultaneously， the by-product impurities 1 and 2 were effectively removed， and the proportion of impurity 3 was reduced by more than 10%. The amplification effect of the pilot scale was good. Conclusion The optimization of the fermentation medium composition of strain FD-13-194 by response surface significantly improved the fidaxomicin yield at both the lab and the polit plant， and this showed the great potential for its industrial application.

Key words Fidaxomicin; Actinoplanes deccanensis; Response surface method; Pilot fermentation

非達霉素是一種新型的大環內酯類抗生素（圖1），通過抑制RNA聚合酶而對艱難梭菌產生明顯的抗感染作用[1]。2011年首次被美國FDA批準用于治療成人艱難梭菌感染引發的相關性腹瀉。臨床應用與甲硝唑和萬古霉素等傳統廣譜藥物相比，非達霉素能提高艱難梭菌的整體治愈率并降低復發率，而且其窄譜活性對腸道微生物菌群影響較小，有助于減輕治療過程中交叉耐藥帶來的風險[2-4]。歐洲和美國傳染病學會在2021年發布的有關艱難梭菌結腸炎治療的新指南中，建議將非達霉素作為一線治療用藥，市場前景廣闊[5]。

近幾年，通過高產菌株的篩選和發酵工藝的優化，在提高非霉素產量方面取得了重大進展。李季峰[6]通過對構建的非達霉素高表達工程菌，進行發酵工藝優化，在5 L和15 L發酵罐上的產量分別達到930和670 μg/mL。楊振江等[7]對桔橙指孢囊菌進行誘變和抗性篩選以及培養基組分的優化，在5 L罐中發酵產量為3343 mg/L。許睿等[8]以游動放線菌為基礎，通過優化發酵培養基，使構建的非達霉素工程菌在10 L罐上發酵產量達到3930 mg/L。但是這些研究僅為小試規模，距離工業化生產還有一定差距。本研究以實驗室前期篩選的高產非達霉素菌株FD-13-194[9]為基礎，通過單因素實驗、Plackett-Burman設計、最陡爬坡實驗和響應面法，優化出產非霉素的最適發酵培養基，并在2 T罐上進行了放大驗證，穩定提高了非達霉素發酵液的產量及質量，為其工業化生產提供了重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

游動放線菌A. deccanensis FD-13-194，本實驗室保藏。

1.1.2 培養基

種子培養基：淀粉20 g/L，葡萄糖5 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L。

初始發酵培養基：葡萄糖40 g/L，黃豆餅粉15 g/L，牛肉膏10 g/L，NaCl 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L。

1.1.3 儀器

超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；搖床（Eppendorf公司）；高速離心機（賽默飛世爾科技有限公司）；2 T發酵罐（邯鄲新興石油化工機械廠）；高壓液相色譜儀（島津公司）。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶培養條件

將培養好的游動放線菌株FD-13-194接種于種子培養基中，28 ℃、220 r/min搖床培養48 h，然后以5%的接種量轉接至發酵培養基（裝量：40 mL/250 mL）

中，28 ℃和220 r/min發酵培養7 d。

1.2.2 測定分析方法

菌體濃度 （packed mycelial volume，PMV）及發酵液中非達霉素含量的測定方法，參照文獻[9-10]。

1.2.3 培養基單因素實驗

以初始發酵培養基為基礎，氮源不變，分別對不同濃度的速效碳源進行優選；并在最優速效碳源基礎上篩選最適遲效碳源；以初始發酵培養基為基礎，碳源不變，對不同濃度的速效氮源進行優選，并在最優速效氮源基礎上進行遲效氮源最適篩選；然后以優化后的發酵培養基為對照，進一步篩選最適無機鹽和最適氧載體及其添加濃度對非達霉素產量的影響。

1.2.4 Plackett-Burman實驗設計

Plackett-Burman（PB）是一種用于篩選關鍵變量的快速有效方法。根據單因素實驗結果，以非達霉素產量作為響應值，進行PB實驗設計，篩選影響非達霉素產量的顯著因素，每個因素取高（+1）、低（-1）兩個水平。

1.2.5 最陡爬坡實驗

根據PB實驗結果，采用最陡爬坡實驗得到各個顯著因素的最佳質量濃度，確定最大響應值的區域。

1.2.6 響應面設計

采用Box-Behnken設計法，對PB實驗選出的3個主要影響因素和最陡爬坡實驗確定的濃度，進行響應面實驗設計和解析，并繪制各顯著因素間相互關系的響應面圖和等高線圖，以獲得其最佳培養基配比。

1.2.7 2 T發酵罐中試放大

種子液制備：將培養好的搖瓶種子液以0.5%接種量移種至種子罐（裝液量：200 L/500 L，消泡劑 0.1%）中，轉速300 r/min，通氣量20 m3/h，28 ℃培養40 h后轉接2 T發酵罐。

2 T發酵罐中試培養：培養好的種子罐種子液以10%接種量接入2 T發酵罐（按響應面實驗優化后的發酵培養基配方配制，裝液量：1.4 T/2 T，消泡劑 0.1%），初始轉速250 r/min，通氣量80 m3/h，28 ℃培養7～9 d。

2 結果與分析

2.1 培養基單因素實驗

2.1.1 碳源種類的優化

以初始發酵培養基為基礎，氮源不變，對不同濃度的速效碳源（葡萄糖、甘油、乳糖）進行優選（圖2）。結果顯示，以30 g/L葡萄糖作為單一碳源的培養基，非達霉素的產量最高達到1406 mg/L。然而單一速效碳源易造成發酵前期菌體大量生長，導致產物合成期由于缺乏營養物質而產量較低。因此，進一步考察30 g/L葡萄糖與不同濃度遲效碳源組合對非達霉素產量的影響（圖3），結果發現，30 g/L葡萄糖與

40 g/L糊精組合成復合碳源時，非達霉素發酵產量最高可達1850 mg/L。

2.1.2 氮源種類的優化

氮源與碳源相同，發酵過程中同樣需要遲效氮源與速效氮源的共同作用以滿足菌體的不同需求。以初始發酵培養基為基礎，碳源不變，首先考察不同濃度速效氮源對非達霉素產量的影響（圖4）。結果顯示，20 g/L蛋白胨對非達霉素合成有較大的促進作用。以此為基礎，進一步考察遲效氮源對非達霉素產量的影響（圖5）。結果顯示，蛋白胨分別與黃豆餅粉和玉米蛋白粉組合時的發酵產量相對較高。由于兩種遲效氮源對產量均有影響，進一步對二者的共同作用進行濃度優選（表1），在20 g/L蛋白胨和10 g/L黃豆餅粉組合的基礎上添加10 g/L玉米蛋白粉作為復合氮源，非達霉素的發酵產量最高為1723 mg/L。

2.1.3 無機鹽的優選

以優化后的碳、氮源為基礎，以不加無機鹽的培養基為對照，考察不同濃度的無機鹽對非達霉素產量的影響（圖6）；并以此為基礎，進一步考察CaCO3對非達霉素產量的影響（圖7）。與對照相比，添加NaCl和CaCO3促進了非達霉素的合成。這是由于非達霉素屬于含氯的代謝產物，在其生物合成過程中需要鹵化酶的參與[11]。添加NaCl，不僅能維持細胞內外的滲透壓平衡，還作為鹵化酶的催化底物參與非達霉素芳香環支鏈上氯原子的合成過程。而CaCO3又為菌株的生長代謝提供了穩定的PH環境。因此，根據圖6～7實驗結果，無機鹽最佳用量選擇

2 g/L的NaCl和4 g/L的CaCO3。

2.1.4 氧載體的選擇及其添加量的優選

非達霉素屬于好氧微生物發酵，隨著發酵的進行，體系中的菌體和非達霉素產量不斷增加，致使發酵液的黏度增大，易造成氧傳遞系數的降低。而氧載體體系，利用氧氣在其中的高溶解度特性，來提高發酵培養基中的溶氧水平，同時還能避免通過增加攪拌和通風對菌絲帶來的破壞。但是氧載體用于微生物好氧發酵、改善發酵液流體特性以及增加溶氧的前提是不能作為碳源被菌體利用[12]。所以首先要考察不同氧載體對非達霉素產生菌細胞生長的影響，以不添加氧載體作為對照（圖8）。由圖8可知，只有添加Tween-80組和對照組菌體濃度基本相當，說明非達霉素產生菌不以Tween-80作為碳源進行生長繁殖，而添加豆油和油酸均對菌體產生了明顯的抑制作用。進一步優化了Tween-80的最適添加量為

2 g/L（圖9），此時發酵水平較對照提高了16.54%。因此選取2 g/L Tween-80作為最適氧載體。

綜上單因素實驗優化發酵培養基：葡萄糖30 g/L，

糊精40 g/L，蛋白胨 20 g/L，黃豆餅粉10 g/L，玉米蛋白粉10 g/L，NaCl 2 g/L，CaCO3" 4 g/L，Tween-80 2 g/L。

2.2 Plackett-Burman實驗設計

基于單因素實驗的優選，以非達霉素產量作為響應值，利用軟件Minitab 17.0進行PB實驗設計（表2～3），并對各因素進行方差分析（表4）。由實驗顯著性分析結果可知，對非達霉素產量影響顯著的因素依次為F NaCl（P=0.002）、E糊精（P=0.003）、D蛋白胨（P=0.027），后續對篩選出的這3個顯著影響因素進行爬坡實驗。而其他5個因素的P值均大于0.05，對產量沒有顯著的影響。將實驗所得的數據回歸分析后得多元一次方程為：非達霉素產量=1780.7+16.2A+59.5B+55.0C+93.2D+206.2E-227.0F+14.2G+14.7H，R2=0.9859。

2.3 最陡爬坡實驗

由PB設計實驗結果得到的多元一次回歸方程各因素系數可知，糊精和蛋白胨與非達霉素產量呈正相關，在最陡爬坡實驗中需增加其濃度；NaCl與非達霉素產量呈負相關，在最陡爬坡實驗中需減少其濃度。對這3個顯著因素進行最陡爬坡實驗，結果（表5）表明，第3組非達霉素產量最高，這意味著關鍵變量的最佳值在第3組附近，即A（糊精）60 g/L，B（蛋白胨）20 g/L，C（NaCl）2 g/L，故將第3組的條件作為響應面實驗的中心點。

2.4 響應面設計

根據最陡爬坡實驗結果，以A（糊精）60 g/L，B（蛋白胨）20 g/L，C（NaCl）2 g/L作為響應面實驗設計的中心點，采用Box-Behnken設計對這3個顯著因素的濃度進行優化，實驗設計與結果見表6～7。

應用Design expert 12軟件對表7中的實驗數據進行回歸擬合，得到二次多項回歸方程：非達霉素產量=3007.60+38.75A+37.25B+76.75C-136.75AB-109.75AC-127.25BC-147.93A2-185.43B2-145.92C2。

Box-Behnken實驗方差分析見表8。P=0.0001＜0.05，模型顯著性較高，R2=0.9871，說明該模型方程與實際擬合度較高；失擬項P=0.0525gt;0.05，不顯著，說明殘差由隨機誤差引起；信噪比Adeq precision=21.916（gt;4） ，表明模型受外界因素干擾小，能真實地反映實驗結果；C.V%=1.22%lt;10%，說明模型偏差程度極小。因此，該模型可信度高，可有效預測非達霉素發酵培養基的最優組合。

各因素交互作用對非達霉素生物合成影響的響應曲面圖及等高線圖見圖10。由圖10可知，糊精、蛋白胨和NaCl的交互作用的響應面開口都朝下，說明在考察的區域范圍內存在最大值，且等高線呈橢圓形，說明三者的交互作用對非達霉素產量均具有顯著性。與表4方差分析結果一致。

2.5 模型驗證

根據響應面實驗結果，利用Design Expert 12軟件預測模型各因素水平理論值為：糊精60.4 g/L、蛋白胨20 g/L、NaCl 2.3 g/L。在此條件下，非達霉素發酵產量預測最大值為3018 mg/L。通過3批搖瓶驗證實驗，非達霉素搖瓶實際發酵產量為3002 mg/L，與預測的效價相當，證明該模型預測結果準確、可靠。

2.6 2 T發酵罐中試放大

根據搖瓶優化的結果，以初始發酵配方為對照，應用優化后的配方在2 T發酵罐中進行了連續3批中試放大。結果顯示，非達霉素發酵產量穩定，平均達到3501 mg/L，較原配方提高了36.1%（表9）。由發酵培養基優化前后代謝過程的菌體濃度 （PMV）、非達霉素產量變化曲線（圖11）可知，采用優化后的配方，發酵代謝周期縮短了一天，無論是菌體濃度還是產量的漲幅，均優于對照。由發酵液HPLC檢測結果（圖12）可知，有效去除了副產物雜質1和2，雜質3的比例降低10%以上，發酵液的質量得到了明顯改善。綜上，說明優化后的發酵培養基配方在非達霉素的中試應用中是可行的。

3 結論與討論

微生物發酵是一種復雜的體系，發酵水平不僅受菌株自身特性的制約，而且不同菌株的最適發酵條件存在較大差異。不同的培養基組分及組分間交互作用對于提高抗生素產量、充分發揮其生產能力至關重要[13]。響應面法作為一種快速、高效的培養基優化方法，具有所需試驗次數相對較少、預測性能精度較高、能研究多個變量之間交互作用等優勢，并在lipstatin、達巴萬星等多個品種的培養基優化中得到成功運用[14-15]。本研究以非達霉素產量為響應值，利用單因素實驗和響應面實驗，得到菌株FD-13-194產非達霉素的最優發酵培養基配方為：玉米蛋白粉10 g/L，葡萄糖30 g/L，黃豆餅粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，糊精60.4 g/L，NaCl 2.3 g/L，Tween-80 2 g/L，CaCO3 4 g/L。采用優化后的發酵培養基，較為全面地滿足了不同發酵階段菌株向非達霉素合成的營養需求，使非達霉素產量在搖瓶水平上達到3002 mg/L；在2 T罐中平均發酵產量達到3501 mg/L，

較優化前提高36.1%，驗證了響應面法優化的發酵配方在工業生產中的可行性。

非達霉素屬于臺勾霉素類藥物，在發酵過程中易產生許多非達霉素的結構類似物，這些結構類似物不但影響目標產物的純度，而且還會增加分離純化的難度[16]。本文應用優化后的發酵培養基，在提高非達霉素發酵產量的同時，有效降低了副產物的生成，對簡化分離純化步驟和提高產品品質具有重要意義。后續還將通過發酵罐培養條件、關鍵工藝控制參數的優化，進一步提升發酵產率和降低生產成本，進而推動非達霉素的產業化。

參 考 文 獻

Cruz M P. Fidaxomicin （Dificid）， a novel oral macrocyclic antibacterial agent for the treatment of Clostridium difficile-associated diarrhea in adults[J]. Pharm Ther， 2012， 37（5）： 278-281.

Giacobbe D R， Vena A， Falcone M， et al. Fidaxomicin for the treatment of Clostridioides difficile infection in adult patients： An update on results from randomized controlled trials[J]. Antibiotics （Basel）， 2022， 11（10）： 1365.

胥騰， 黃海輝. 艱難梭菌抗菌藥物耐藥機制研究進展[J]. 遺傳， 2023， 45（11）： 1028-1038.

馬培奇. 美FDA咨詢委員會推薦批準非達霉素治療艱難梭菌感染[J]. 醫藥論壇， 2011， 32（5）： 235.

郭銀莉， 洪守強， 陳渺渺， 等. 艱難梭菌感染的臨床治療策略及新藥物研究進展[J]. 中國抗生素雜志， 2023， 48（10）： 1105-1117.

李季峰. 非達霉素高產菌株構建及其發酵工藝優化研究[D]. 杭州： 浙江大學碩士學位論文， 2021.

楊振江， 吳遠杰， 張柯， 等. 非達霉素的菌種選育及發酵工藝優化[J]. 中國醫藥工業雜志， 2016， 47（12）： 1519-1521.

許睿， 高萍， 閔濤玲， 等. 高產量非達霉素工程菌的構建及其發酵優化[J]. 中國醫藥工業雜志， 2020， 51（2）： 204-210.

關亞鵬， 張莉， 米貫東， 等. 應用常壓室溫等離子體誘變技術選育非達霉素高產菌株[J]. 中國抗生素雜志， 2017， 42（8）： 643-646.

林旸， 王月， 王海燕， 等. 非達霉素的HPLC快速檢測方法[J]. 化學與生物工程， 2020， 37（5）： 61-64.

肖毅， 李蘇梅， 馬亮， 等. 臺勾霉素生產菌指孢囊菌NRRL 18085遺傳操作體系的建立[J]. 微生物學報， 2010， 50（8）： 1014-1022.

王爽， 周巍， 劉紅冉， 等. 幾種氧載體對納他霉素發酵的影響[J]. 食品科學， 2015， 36（9）： 102-107.

嚴凌斌， 張祝蘭， 陳洲琴， 等. 響應面法優化毒三素鏈霉菌 FIM-17-16 產Lipstatin發酵培養基[J]．生物技術， 2021， 31（ 1）： 82-88．

項仁鑫， 孫鵬， 楊小虎， 等. PF1022A產生菌的菌種選育及培養基優化[J]. 中國抗生素雜志， 2023， 48（9）： 1017-1023.

李文科， 張仁文， 萬傳星， 等. 野野村放線菌DB-3-04產達巴萬星前體A-40926 B0發酵培養基優化[J]. 中國抗生素雜志， 2023， 48（12）： 1353-1361.

田小杏. 臺勾霉素鹵化酶缺失突變株ΔtiaM及一株海洋來源放線菌抗菌活性成分研究[D]. 開封： 河南大學， 2017.

收稿日期：2023-12-08

基金項目：河北省科技研發平臺建設專項（No. 22567651H）

作者簡介：張莉，女， 生于1974年，高級工程師，主要從事微生物育種和發酵工藝研究，E-mail： 2896747391@qq.com

*通信作者，E-mail： luncpc@163.com