彝族醫(yī)藥靈通清肺湯通過調(diào)控c-Fos表達緩解內(nèi)毒素介導(dǎo)的大鼠肺毛細血管滲漏

摘要：目的 研究彝醫(yī)藥靈通清肺湯（Lingtong Qingfei Decoction， LTQFD）改善脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）介導(dǎo)大鼠肺毛細血管滲漏（capillary leakage， CL）的潛在分子機制。方法 用LTQFD干預(yù)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷（acute lung injury， ALI）大鼠，進行肺組織基因芯片分析及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，檢測肺炎性狀態(tài)、CL指標和氣道指標、呼吸功能和病理改變；進而用正常大鼠LTQFD含藥血清預(yù)處理LPS干預(yù)的大鼠肺靜脈內(nèi)皮細胞（rat pulmonary vein endothelial cells， RPPVECs），檢測促炎細胞因子釋放、跨膜電阻和細胞旁滲漏及樞紐蛋白c-Fos的表達。結(jié)果 LTQFD抑制了LPS介導(dǎo)的Toll樣受體級聯(lián)激活和c-Fos高表達，改善了過激的炎性反應(yīng)，緩解了肺和RPPVECs的CL，從而改善了ALI的肺病理改變、氣道指標和呼吸功能。結(jié)論 LTQFD可能通過逆轉(zhuǎn)LPS介導(dǎo)的Toll樣受體級聯(lián)激活和c-Fos高表達來改善ALI肺CL、病理學改變、氣道指標和呼吸功能。

關(guān)鍵詞：靈通清肺湯；彝族藥物；急性肺損傷；毛細血管滲漏；炎性反應(yīng)；c-FOS

中圖分類號：R966 文獻標志碼：A

Yi nationality medicine Lingtong Qingfei Decoction improving lipopolysaccharide-mediated pulmonary capillary leakage in rats via regulating c-Fos expression

Wu Wei1，2，" Wu Junxi3，" Geng Fuchang2，" Liu Bin2，" Zhao Shan1， Fan Qingfeng1， Yin Hongyin1， and Yang Yi1

（1 Research Institute of Medicine and Herbs of Yi Nationality amp; Gastroenterology Department， Liangshan Prefecture Integrated Traditional and Western Medicine Hospital， Xichang 615000; 2 Good Doctor Pharmaceutical Group Co， Ltd. Chengdu 610073; 3 School" of" Medicalnbsp; and" Life Science， Chengdu University of TCM， Chengdu 610000）

Abstract Objective To investigate the potential molecular mechanism of Lingtong Qingfei Decoction （LTQFD） in ameliorating lipopolysaccharide （LPS）-induced pulmonary capillary leakage in rats. Methods Rats with LPS-induced acute lung injury （ALI） were treated with LTQFD. Lung tissue gene chip analysis and the construction of a protein interaction network were conducted. Subsequently， assessments were made on pneumonia status， capillary leakage， airway indicators， respiratory function， and pathological changes. LPS-intervened rat pulmonary vein endothelial cells （RPPVECs） were pre-treatment with LTQFD （normal rat serum containing medication） to evaluate pro-inflammatory cytokine release， transepithelial electrical resistance， paracellular leakage， and hub protein c-Fos expression. Results LTQFD inhibited LPS-mediated Toll-like receptor cascade activation and high expression of c-Fos， improved the excessive inflammatory response， relieved capillary leakage in the lungs and RPPVECs， and thus improved lung pathological changes， airway indicators， and respiratory function in ALI（Plt;0.05）. Conclusion LTQFD might improve pulmonary capillary leakage， pathological changes， airway indicators， and respiratory function in ALI by reversing LPS-mediated Toll-like receptor cascade activation and high expression of c-Fos.

Key words Lingtong Qingfei Decoction; Yi nationality medicine; Acute lung injury; Capillary leakage; Inflammatory response;" c-FOS

重癥肺炎可能導(dǎo)致人體內(nèi)革蘭陰性菌細胞壁成分內(nèi)毒素釋放入血，形成內(nèi)毒素血癥[1]。前期研究表明內(nèi)毒素血癥誘發(fā)免疫細胞的基因和蛋白表達譜持續(xù)性促炎改變，這將觸發(fā)炎性級聯(lián)反應(yīng)[2]。由于肺毛細血管網(wǎng)絡(luò)極度豐富，內(nèi)毒素血癥介導(dǎo)的炎性級聯(lián)反應(yīng)將導(dǎo)致肺毛細血管內(nèi)皮屏障嚴重損傷[3]。內(nèi)皮屏障損傷的細胞病理機制主要包括緊密連接和黏附連接的解組裝、細胞骨架重構(gòu)和細胞凋亡等，這將導(dǎo)致毛細血管滲漏[4]。其中，白蛋白跨毛細血管滲漏起著至關(guān)重要的作用，將大幅介導(dǎo)水液大量外漏至肺間質(zhì)及肺泡隔室，引發(fā)急性肺損傷（acute lung injury， ALI），最終導(dǎo)致呼吸衰竭[5]。并且，高分子量的白蛋白是主要依賴于旁細胞漏的方式漏過毛細血管內(nèi)皮屏障[6]。肺泡白蛋白滲漏增加被認為是肺毛細血管內(nèi)皮屏障損傷的重要特征[7]。因此，減輕肺毛細血管滲漏是治療重癥肺炎內(nèi)毒素血癥誘發(fā)ALI的關(guān)鍵目標。

中醫(yī)清法輔助治療重癥肺炎較單純西醫(yī)方案具備更優(yōu)的臨床優(yōu)勢和療效[8]。涼山州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院采用協(xié)定方清肺湯結(jié)合西醫(yī)治療重癥肺炎，能明顯改善ALI和縮短病程[9]。根據(jù)彝族醫(yī)藥古籍及驗方分析，在清肺湯的基礎(chǔ)上加減化裁，形成靈通清肺湯（Lingtong Qingfei Decoction， LTQFD），由臭靈丹10 g、通關(guān)藤10 g、桑白皮10 g、葶藶子10 g、陳皮10 g、石菖蒲6 g、天冬6 g、苦杏仁6 g和百部6 g組成。筆者推測 LTQFD可能通過抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)來減輕毛細血管滲漏，從而發(fā)揮治療重癥肺炎內(nèi)毒素血癥誘發(fā)ALI的效能。

在本研究中，將應(yīng)用基因芯片、Western blot等方法來揭示LTQFD減輕脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）誘導(dǎo)大鼠ALI引發(fā)的肺毛細血管滲漏的潛在分子機制。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

成年健康SD大鼠60只，雌雄兼用，體重250～

300 g，購自四川大學華西醫(yī)學中心實驗動物中心（成都，中國），合格證號：SCXK（川）2021-03。在四川大學基礎(chǔ)醫(yī)學院動物實驗室飼養(yǎng)。本研究中所有動物實驗均遵守道德和法律要求，經(jīng)涼山彝族自治州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。所有過程符合實驗動物管理規(guī)定。

1.1.2 藥品、細胞、試劑和設(shè)備

臭靈丹（批號：Y-202104-02）、通關(guān)藤（批號：Y-202104-01）、桑白皮（批號：Y-202104-01）、葶藶子（批號：Y-202104-02）、陳皮（批號：Y-202103-01）、石菖蒲（批號：Y-202102-01）、天冬（批號：Y-202103-01）、苦杏仁（批號：Y-202103-10）和百部（批號：Y-202104-10）飲片（四川藍天藥業(yè)有限公司）；脂多糖（貨號：YT1318）、伊文思藍染色液（0.5%）（貨號：SY2400）（北京伊塔生物科技有限公司）；Rat OneArray?Plus Microarray（中國臺灣Phalanx Biotech）大鼠肺靜脈內(nèi)皮細胞（Rat pulmonary vein endothelial cells，RPPVECs）（南京萬木春生物科技有限公司）；10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素和DMEM培養(yǎng)液（美國Sigma-Aldrich）；ELISA 試劑盒：大鼠單核細胞趨化蛋白1（CCL2）（貨號：YD11633）、大鼠CXC趨化因子配體1（CXCL1）（貨號：YEF18133）、大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）（貨號：YD17076）、大鼠白介素1β（IL-1β）（貨號 ：YD17070）、大鼠白介素6（IL-6）（貨號 ：YD17073）（上海羽哚生物科技有限公司）；c-Fos和GAPDH抗體（深圳欣博盛生物科技有限公司）；加熱石蠟包埋系統(tǒng)（型號：G1150H）、生物光學顯微鏡（型號：DM3000）（德國 Leica公司）； 酶標分析儀（型號：DNM-9606）（北京普朗新技術(shù)有限公司）；蛋白制膠、電泳與轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（4膠/4膜）（型號：MiniProGelTM）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；0.4 μm多孔無菌聚酯薄膜細胞培養(yǎng)插件（美國Corning公司）；4 mm Transwell?（美國Corning公司）；Millicell?電阻儀（美國Millipore公司）；大鼠的c-Fos的小干擾RNA（Stealth siRNA） （RSS320772）（美國Thermo Fisher公司）；Immobilon? PVDF membranes（美國Sigma-Aldrich公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗設(shè)計

體內(nèi)實驗，將大鼠隨機分為正常對照組（Normal， N）、ALI模型組（ALI， M）和靈通清肺湯組（LTQFD， L），每組20只。通過經(jīng)尾靜脈注射0.05 mL/kg油酸，30 min后注射2.5 mg/kg的LPS制作ALI模型。手術(shù)結(jié)束后1 h，L組大鼠經(jīng)胃灌服LTQFD（15 mg/kg×2 次/d×3 d）。N組和M組經(jīng)胃灌服同等劑量的生理鹽水。體內(nèi)實驗結(jié)束前1 h，每組隨機選取10只存活大鼠，尾靜脈注射2%的伊文思藍（EB）（2 mL/kg） 。體內(nèi)實驗結(jié)束時，收集血液樣本檢測；然后使用輸液泵（Fresenius Vial S.A， France）將肺循環(huán)中的血液沖洗干凈，收集肺邊緣0.5 cm處的組織。在體外試驗中，根據(jù)研究目標，將RPPVECs分為以下幾組：① Normal組（10%體積分數(shù)的正常大鼠空白血清100 μL預(yù)處理1 h，加入10%FBS孵育24 h）；②LPS組（正常大鼠空白血清預(yù)處理1 h，加入1 μmol/L LPS孵育24 h）；③LTQFD組（10%體積分數(shù)的正常大鼠LTQFD含藥血清100 μL預(yù)處理1 h，加入1 μmol/L LPS 孵育24 h）； ④c-Fos siRNA組（正常大鼠空白血清+轉(zhuǎn)染c-Fos siRNAs進行預(yù)處理，加入1 μmol/L LPS 孵育 24 h）。

1.2.2 LTQFD制備方法

處方中所有藥材均經(jīng)鑒定，全部符合《中國藥典（2020版）》一部有關(guān)各項的規(guī)定。方中九味藥按比例加水煎煮兩次，1.5 h/次，煎液濾過，與回流液合并，減壓濃縮成浸膏，備用。

1.2.3 微陣列分析

使用Rat OneArray? Plus Microarray（中國臺灣Phalanx Biotech）進行各樣本肺組織的基因表達譜分析。根據(jù)OneArray? protocol，陣列圖像和探針密度通過Agilent 0.1 XDR?和GenePix?4生成。使用Rosetta Resolver? System（Rosetta Biosoftware）， Annotation ROA2 release 1.0（databasese： NCBI RefSeq release 65 and Ensembl release 76 cDNA sequences Rnor 5.0 annotations）和R 3.0.3 software （http：//www.r-project.org）對大鼠OneArray?Plus數(shù)據(jù)進行分析。以|log2（Ratio）≥0.585和r＜0.05確定差異基因（DEGs）。相關(guān)基因的KEGG_pathways的功能富集分析通過WebGestalt生成（r＜0.05 and entitles≥3）。

1.2.4 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)建立和樞紐蛋白的確定

根據(jù)研究目的選擇的差異表達基因列表被輸入Network Analyst software（Hancock Lab，Canada）。優(yōu)先差異基因編碼的種子蛋白被作為種子蛋白，與其他必需蛋白共同構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。具有最高的連接度和介數(shù)的節(jié)點被確定為樞紐蛋白。

1.2.5 測定白蛋白經(jīng)毛細血管逸出率（transcapillary escape rate， TER）

EB將與大鼠血清白蛋白緊密結(jié)合，并作為白蛋白泄漏的超敏標志物[13]。從每組大鼠中隨機抽取5只，尾靜脈注射EB（濃度1 mg/mL） 0.2 mg/kg。在620和740 nm的吸光度檢測，建立標準曲線，測定計算EB的TER值。

1.2.6 肺EB含量和水含量的測定

組織中的EB含量與泄露的白蛋白量正相關(guān)[10]。取EB注射大鼠的右肺組織，浸泡在N，N-二甲基甲酰胺。孵育、離心、組織勻漿，檢測其620 nm處的吸光度，通過標準曲線計算EB濃度。然后分別檢測肺的干、濕重量，按照既往報道計算肺的水含量[11] 。

1.2.7 支氣管肺泡灌洗液 （bronchoalveolar lavage fluid， BALF） 檢測

將5 mL 0.9%NaCl溶液通過支氣管插管注入雙肺，10 s后回抽液體，重復(fù)2次，回收率為85%，將BALF分裝6管，進行細胞計數(shù)和總蛋白測定，CCL2、CXCL1、TNF-α、IL-1β和IL-6采用ELISA試劑盒參照制造商說明書檢測。

1.2.8 檢測大鼠血清白蛋白以及PaO2、PaCO2和SaO2

大鼠血清白蛋白采用全自動生化分析儀檢測。PaO2、PaCO2和SaO2采用血清分析儀檢測。

1.2.9 HE染色

取肺邊緣肺組織，固定于4%多聚甲醛，進行HE染色。在400倍顯微鏡下由專業(yè)病理師挑選10個視野，計算所挑選出的10個視野的病理評分均值。

1.2.10 LTQFD大鼠含藥血清的制備

10只大鼠隨機分為空白組和LTQFD組。LTQFD組大鼠給予LTQFD（15 mg/kg×2 次/d×3 d） 灌服，空白對照組大鼠僅給予等量生理鹽水。末次給藥后，大鼠的血液被采集，離心，獲得的血清，備用。

1.2.11 RPPVECs細胞培養(yǎng)

采用RPPVECs完全培養(yǎng)基培養(yǎng)（37 ℃，5%CO2）；待細胞達到80%匯合時，進行傳代培養(yǎng)；待細胞完全貼壁后，培養(yǎng)觀察；之后每隔2～3 d更換新鮮的完全培養(yǎng)基。

1.2.12 轉(zhuǎn)染siRNAs

按照制造商的說明書，將大鼠的c-Fos的小干擾RNA（Stealth siRNA）瞬時轉(zhuǎn)染到RPPVECs。

1.2.13 Transwell實驗

RPPVECs接種于有0.4 μm多孔無菌聚酯薄膜細胞培養(yǎng)插件的4 mm Transwell?2并生長至匯合。RPPVECs的單層跨膜電阻（transepithelial electrical resistance， TEER）用Millicell?電阻儀檢測，TEER的值通過以前所報道的公式計算[12] 。為進一步檢測旁細胞漏，F(xiàn)ITC標記的葡聚糖（50 g/mL）被加到Transwell的上室，并在37 ℃與細胞單層共孵育60 min ，然后上室和下室的樣本被提取在535 nm的發(fā)射波長處進行熒光測定，進而，葡聚糖的通透性根據(jù)此報道計算[13]。

1.2.14 測定RPPVECs上清液中的TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度

收集RPPVECs上清液，根據(jù)制造商說明書，采用ELISA試劑盒測定TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度。

1.2.15 Western Blot

提取3組RPPVECs的總蛋白進行SDS-PAGE電泳，將膠內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)移至Immobilon?PVDF membranes，封閉膜，4 ℃過夜孵育一抗（稀釋度 1：1000），然后孵育二抗，ECL法顯色，采用ImageJ software對結(jié)果進行分析。

1.2.16 統(tǒng)計分析

采用SPSS19.0軟件分析實驗結(jié)果數(shù)據(jù)，用x±s表示，采用軟件中的Dunnett’spair-wise multiple comparison t-test分析組間數(shù)據(jù)差異。r或P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 M/N和L/M的差異基因

采用Rosetta Biosoftware基因表達數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進行分析，Rat OneArray?Plus微陣列的20715個基因探針中，M/N的DEDs簇中有3320個基因顯著表達，其中1778個基因上調(diào)，1542個基因下調(diào)；L/M的DEDs簇中有4398個基因顯著表達，其中2514個基因上調(diào)，1884個基因下調(diào)；（|log2（Ratio）|≥0.585， r＜0.05）。

2.2 LTQFD緩解ALI肺毛細血管滲漏的KEGG通路富集分析

與毛細血管滲漏密切相關(guān)的KEGG通路富集分析表明：L/N和M/N的DEGs簇中的部分DEGs顯著地富集在以下5個信號通路：炎性通路（toll-like receptor signaling pathway），旁細胞漏（adherens junction、tight junction和regulation of actin cytoskeleton）以及細胞凋亡（apoptosis）通路（r＜0.05， Entitles≥3）。結(jié)果見表1。

2.3 LTQFD緩解ALI肺毛細血管滲漏在Toll樣受體通路中的關(guān)鍵靶基因和優(yōu)先樞紐蛋白

M/N和L/M DEGs簇 （|log2（Ratio）|≥0.585， P＜0.05）中有39個基因顯著地富集在Toll樣受體通路（Total=96，Hits=39，P=8.96E-22）。基于基因表達模式構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（Nodes=258， Edges=332， Seed Proteins=23），如圖1A所示。其中具有最高的連接度和介數(shù)（Betweeness＞500且Degree＞50） 的DEGs編碼的蛋白，被選定為優(yōu)先樞紐蛋白，即：Fos（proto-oncogene c-Fos） （圖1A和表2）。進而，篩選出位于Toll樣受體通路重要節(jié)點的10個DEGs：Fos， Lbp（lipopolysaccharide-binding protein）， Cd14（monocyte differentiation antigen CD14）， Irak4 （Interleukin-1 receptor-associated kinase 4）， Pik3r1 （Phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit alpha）， Nfkbia （NF-kappa-B inhibitor alpha）， Mapk13 （Mitogen-activated protein kinase 13）， Tnf （Tumor necrosis factor）， IL1b （Interleukin-1 beta）和IL6 （Interleukin-6）。其表達模式按照歐式距離排列形成聚類熱圖（圖1B）。上述10個DEGs的差異倍數(shù)如表2所示：在M/N的DEGs簇中，這10個基因均被上調(diào)，其中Pik3r1、Nfkbia和Irak4上調(diào)大于1.5倍，Tnf、Il6、Il1b、Cd14和Mapk13上調(diào)大于2倍，F(xiàn)os和Lbp上調(diào)高于5倍；而在L/M的DEGs簇中，這些DEGs均呈現(xiàn)出逆轉(zhuǎn)M/N表達上調(diào)的下調(diào)模式。

2.4 LTQFD改善ALI肺白細胞招募因子以及促炎細胞因子的產(chǎn)生

如表3所示，與正常對照組比較，ALI組顯著的誘導(dǎo)了肺白細胞招募因子（CCL2和CXCL1）以及促炎細胞因子（TNF-α， IL-1β和IL-6）的升高（Plt;0.05）；引人注目的是，當與ALI組比較時，LTQFD治療能有效地減少ALI肺白細胞招募因子以及促炎細胞因子的產(chǎn)生（Plt;0.05）。

2.5 LTQFD改善ALI肺毛細血管滲漏

如表4所示，與正常對照組比較，ALI組明顯地誘導(dǎo)了大鼠肺TER、EB和水含量急劇升高，而大鼠血清白蛋白因漏出而明顯下降（Plt;0.05）；當與ALI組比較時，LTQFD治療顯著地逆轉(zhuǎn)了上述特征性指標的異常變化（Plt;0.05）。

2.6 LTQFD改善ALI肺氣道指標和呼吸功能

如表5所示，作為氣道指標，ALI組BALF的總蛋白水平和總細胞計數(shù)均顯著高于正常對照組（P＜0.01）；作為呼吸功能的特征指標，與正常對照組相比，ALI組的PaCO2明顯升高，PaO2和SaO2顯著降低（P＜0.01）；值得注意的是，與ALI組相比，LTQFD治療顯著地逆轉(zhuǎn)了這些特征指標的變化（P＜0.05）。

2.7 LTQFD改善ALI肺病理變化

如圖2所示，肺病理改變結(jié)果如下：①與正常對照組相比，在ALI組中，肺泡結(jié)構(gòu)被破壞、肺泡壁增厚、存在大量的炎性細胞和紅細胞浸潤；②LTQFD治療有效地逆轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)的肺病理改變；③根據(jù)以上的組織病理學改變，ALI組中的肺組織病理學評分顯著高于正常對照組（P＜0.01） ，而LTQFD組中肺組織病理學評分顯著低于ALI組（P＜0.05）。

2.8 LTQFD改善LPS介導(dǎo)的RPPVECs促炎因子的釋放和細胞滲漏

如表6所示，當與正常組比較時，LPS刺激RPPVECs時介導(dǎo)了促炎細胞因子（TNF-α， IL-6和IL-1β）釋放和葡聚糖流量（旁細胞漏）的顯著增加（P＜0.05）；同時，LPS組的TEER顯著地低于正常組 （P＜0.05）。 基于本研究大鼠肺組織基因芯片分析構(gòu)建的 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，c-Fos被推測為LTQFD 緩解肺毛細血管滲漏的關(guān)鍵靶蛋白。為了驗證這一推測，采用c-Fos的siRNAs瞬時轉(zhuǎn)染RPPVECs。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染c-Fos的siRNAs顯著地逆轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)的促炎因子釋放和旁細胞漏的升高以及 TEER 的降低（P＜0.05）。LTQFD預(yù)處理RPPVECs也顯著的逆轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)的促炎因子釋放和旁細胞漏的升高以及 TEER的降低（Plt;0.05），這表明LTQFD起到了與c-FOS蛋白siRNA的相似作用。

2.9 LTQFD逆轉(zhuǎn)LPS介導(dǎo)的c-Fos過度表達

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明：與正常對照組相比，LPS可顯著誘導(dǎo)c-Fos的過度表達（Plt;0.05，圖3）； 用c-Fos siRNA轉(zhuǎn)染明顯地抑制了LPS誘導(dǎo)的c-Fos過表達（Plt;0.05，圖3）；值得注意的是，LTQFD預(yù)處理RPPVECs同樣地逆轉(zhuǎn)了LPS介導(dǎo)的c-Fos蛋白過度表達，這顯示出與c-Fos蛋白siRNA的相似作用 （Plt;0.05，圖3）。因此，抑制LPS介導(dǎo)的c-Fos的過度表達可能是LTQFD緩解毛細血管滲漏的重要分子機制。

3 討論

內(nèi)毒素介導(dǎo)Toll樣受體級聯(lián)激活將導(dǎo)致NFKB和MAPK級聯(lián)的活化，激活促炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄增強[14]。c-FOS是核磷蛋白，在MAPK通路中與JUN/AP-1轉(zhuǎn)錄因子形成緊密但非共價連接的復(fù)合物調(diào)控轉(zhuǎn)錄；在異二聚體中，F(xiàn)OS和JUN/AP-1堿性區(qū)似乎都與對稱的DNA半位點相互作用[15]。c-FOS在TGF-β激活時，在AP1/SMAD結(jié)合位點形成多聚體SMAD3/SMAD4/JUN/FOS復(fù)合物，以調(diào)節(jié)TGF-β介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)[16]。c-FOS被認為在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖和分化中具有重要作用；在生長中的細胞中，可能通過激活CDS1和PI4K2A來激活磷脂合成；這種活性需要酪氨酸去磷酸化并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合[17]。響應(yīng)上游信號，c-FOS過度激活將導(dǎo)致促炎細胞因子的大量轉(zhuǎn)錄[18]。過激的炎性反應(yīng)將誘導(dǎo)黏附連接 、緊密連接和F-actin在細胞-細胞接觸點的分解，并且觸發(fā)F-actin的過度組裝和細胞骨架重構(gòu)，從而引起毛細血管滲漏[19]。F-actin的過度組裝將進一步誘導(dǎo)Fos的過表達和激活[20]，這將介導(dǎo)更多的炎性細胞因子轉(zhuǎn)錄，形成惡性循環(huán)。本研究證實：①LPS介導(dǎo)了大鼠肺Toll樣受體級聯(lián)關(guān)鍵節(jié)點基因表達的顯著上調(diào)以及c-FOS蛋白的過度表達，促使了白細胞招募因子以及促炎細胞因子的過度產(chǎn)生，引發(fā)了強烈的毛細血管滲漏（毛細血管通透性和旁細胞滲漏顯著增加），從而導(dǎo)致肺病理學改變和氣道指標的惡化，最終引發(fā)呼吸衰竭；②c-FOS siRNA瞬時轉(zhuǎn)染能夠逆轉(zhuǎn)LPS介導(dǎo)的c-FOS蛋白的過度表達，抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生，從而明顯改善毛細血管通透性和旁細胞滲漏的增加。

靈通清肺湯所含中藥單體藥理作用如下：臭靈丹具有抗炎、抗菌、祛痰功能，對LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI具有保護作用[21]；通關(guān)藤能夠鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗菌，調(diào)控Toll樣受體信號通路改善炎性反應(yīng)[22]；桑白皮、葶藶子、陳皮、苦杏仁、石菖蒲、天冬和百部均可抗菌、抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)咳、祛痰和調(diào)節(jié)免疫[23-29]。因此，以上中藥聯(lián)合使用可能協(xié)同改善內(nèi)毒素血癥引發(fā)的肺毛細血管滲漏。本研究證實：LTQFD治療能夠逆轉(zhuǎn)LPS介導(dǎo)的Toll樣受體級聯(lián)關(guān)鍵節(jié)點基因表達的顯著上調(diào)和c-FOS蛋白的過度表達，緩解白細胞招募因子和促炎細胞因子過度產(chǎn)生引發(fā)的毛細血管滲漏（毛細血管通透性和旁細胞滲漏顯著增加），從而改善異常的肺病理學變化、氣道指標和呼吸功能。

4 結(jié)論

LTQFD可能通過逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的Toll樣受體級聯(lián)激活以及c-Fos蛋白高表達，緩解ALI 肺毛細血管滲漏，從而改善異常的肺病理學改變、氣道指標和呼吸功能。

參 考 文 獻

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收稿日期：2024-04-28

基金項目：四川省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科研專項資助（No. 2021MS036）

作者簡介：吳偉，男，生于1976年，博士，主要研究方向為彝族醫(yī)藥，E-mail： weijunhr008@sina.com。

*通信作者，E-mail： liubin00008888@sina.com