抑制MCP-1改善高脂飲食條件下的骨質疏松及血管鈣化

摘要：目的 通過構建高脂飲食模型，初步研究MCP-1在骨質疏松及血管鈣化過程中的作用。方法 將24只LDLR^-/-小鼠分為3組，低脂飲食組（LFD組）、高脂飲食組（HFD組）、MCP-1抑制高脂飲食組（HFD+MI組）。造模24 W，收集小鼠血液，主動脈，股骨。茜素紅染色與鈣鹽染色檢測主動脈鈣化程度；免疫組化檢測Osterix、Osteocalcin、MCP-1的表達量；實時熒光定量PCR檢測主動脈Col1A，Ocn，Runx2 mRNA的表達；ELISA檢測血液中MCP-1的含量；Micro CT檢測小鼠股骨的骨結構相關參數。結果 與低脂飲食組（LFD組）相比，HFD組可觀察到明顯的主動脈鈣化，主動脈鈣鹽沉積增加，Osterix、Osteocalcin、MCP-1表達量增加（P＜0.05），Col1A，Ocn，Runx2 mRNA的表達量增加（P＜0.05），血液中MCP-1的含量顯著增加（P＜0.05），同時股骨可觀察到明顯的骨質疏松，骨表面積、骨小梁數量等明顯下降，骨小梁分離度等增高（P＜0.05）；HFD+MI組相比HFD組，主動脈鈣鹽沉積減少，Osterix、Osteocalcin、MCP-1表達量減少（P＜0.05），Col1A，Ocn，Runx2 mRNA的表達量減少（P＜0.05），血液中MCP-1的含量減少（P＜0.05），同時股骨可觀察到骨量增加，骨表面積、骨小梁數量等明顯增加，骨小梁分離度等降低（P＜0.05）。結論 在高脂飲食LDLR^-/-小鼠模型中，主動脈鈣化處MCP-1含量明顯增加；抑制MCP-1可以改善骨質疏松及血管鈣化。

關鍵詞：骨質疏松；血管鈣化；MCP-1

中圖分類號：中圖分類號R580文獻標志碼：A文獻標識碼

DOI：10.13880/j.cnki.65-1174/n.2025.22.002

文章編號：1007-7383（2025）01-0001-07

Inhibition of MCP-1 improves osteoporosis and vascular calcification under high fat diet

GUO" Tongtong1，ZHOU" Wenxin2，XIAO" Yao1，RUSitanmu1，LUO" Jiangmiao1，ZHAO" Han1，CHEN" Yuan1，WANG" Weishan^1*

（1 School of Medicine，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000，China;

1 First Affiliated Hospital，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000，China;

2 General Hospital of Beitun City， Tenth Division， Xinjiang Production and Construction Corps，Beitun，Xinjiang 836000，China）

Abstract： Objective The role of MCP-1 in the development of osteoporosis and vascular calcification was studied by constructing a highfat diet model. Methods Twentyfour LDLR^-/- mice were divided into three groups： Lowfat diet group （LFD group）， highfat diet group （HFD group）， MCP-1 inhibition highfat diet group （HFD+MI group）. After 24 weeks of modeling， blood， aorta and femur were collected. Alizarin red staining and calcium salt staining were used to measure the degree of aortic calcification. The expressions of Osterix， Osteocalcin， and MCP-1 were determined by immunohistochemistry. The mRNA expressions of Col1A，Ocn and Runx2 were assayed by realtime PCR. ELISA was used to detect the content of MCP-1 in blood. Micro CT was used to examine the bone structure related parameters of mouse femur.Results Compared with the Lowfat diet group （LFD group），the HFD group showed significant aortic calcification， increased calcium salt deposition， increased expression of Osterix， Osteocalcin， and MCP-1 （Plt;0.05）， and improved mRNA expression of Col1A，Ocn， and Runx2 （Plt;0.05）. The content of MCP-1 in blood was significantly enhanced （Plt;0.05）. At the same time， obvious osteoporosis was observed in the femur， the bone surface area and the number of bone trabeculae were significantly reduced， and the separation of bone trabeculae was mounted （Plt;0.05）. Compared with the HFD group，the HFD+MI group had significantly lessened calcium deposition in the aorta， decreased expression of Osterix， Osteocalcin， and MCP-1 （Plt;0.05）， and Downregulated mRNA expression of Col1A，Ocn， and Runx2 （Plt;0.05）， and declined content of MCP-1 in the blood （Plt;0.05）. At the same time， the bone mass， bone surface area and the number of bone trabeculae were significantly increased， and the separation of bone trabeculae was decreased （Plt;0.05）.Conclusion In the highfat LDLR^-/- mouse model， the MCP-1 content in the calcified aorta was significantly increased; Inhibition of MCP-1 can improve osteoporosis and vascular calcification.

Key words： osteoporosis;Vascular calcification;MCP-1

0 引言

骨質疏松癥是一種全身性疾病，以骨量低、骨組織微結構惡化為特征，增加骨脆性，積累骨折風險，并帶來骨質疏松性骨折等嚴重并發癥^［1］，它影響到世界上大約2億患者。2019年的1項研究顯示，中國50歲以上男性和女性OP患病率分別高達6.46%和29.13%，降低OP的發病率，闡明其發病機制已成為迫切的公共衛生問題^［2］。血管鈣化（VC）是血管系統中鈣和磷酸鹽礦物的病理沉積，它導致血管僵硬和脆弱，血流動力學受損，并增加心血管疾病（如動脈粥樣硬化、收縮期高血壓和冠狀動脈疾病）的發病率和死亡率^［3］。近年來的研究發現，它是1個活躍的過程，具有骨形成的組織病理學特征、礦物質組成和啟動發育機制^［3］。

骨質疏松癥與血管鈣化是威脅中老年人健康的兩類重要疾病，以往認為它們是與年齡有關、相互獨立的疾病^［4］，但最近的研究發現，二者是相互聯系的，有共同的危險因素與信號通路。骨質疏松與血管鈣化通常共同存在于老年人，糖尿病患者，慢性腎臟病患者中^［5］。一些學者提出了骨-血管軸的概念，支持存在著細胞、內分泌和代謝信號，這些信號在血管系統和骨骼之間雙向流動，當代謝紊亂狀態擾亂了骨-血管軸時，血管和骨骼疾病可能同時發生^［6］。但目前關于兩者間關系的研究很少。

趨化因子是由免疫細胞分泌的小分子信號蛋白，負責調節其他細胞對化學刺激的反應^［7］。單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1或CCL2）是CC基序趨化因子家族中1個有效的促炎成員。有研究指出，在血管損傷處，可觀察到MCP-1含量明顯增多^［8］。絕經后骨質疏松女性患者中，MCP-1水平增加，且與骨密度降低相關^［9］。因此，本研究通過對LDLR^-/-小鼠喂食高脂飲食，構建血管鈣化動物模型，觀察骨質疏松情況，研究MCP-1在兩者間的作用，為骨質疏松與血管鈣化的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

購買24只1月齡無特定病原體（specific pathogen free，SPF） 級雄性LDLR^-/-小鼠，所有動物均由武漢貝賽模式生物科技有限公司提供且經過石河子大學第一附屬醫院實驗動物管理委員會批準，倫理審查編號：A2021-091-01，飼養于溫室（22℃～24℃）、濕度 50% ～60%的動物實驗中心，12 h 晝夜周期。

1.1.2 試劑

Bindarit 購自APExBIO公司；TRIzol 試劑、逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒購自Thermo公司;小鼠MCP-1 ELISA試劑盒購自江萊生物公司；免疫組化抗體Osteocalcin購自Bioss公司；免疫組化抗體MCP-1購自Affinity公司;免疫組化抗體Osterix購HuaBio公司；茜素紅S染色液、鈣鹽染色試劑盒購自Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組

將24只LDLR^-/-小鼠隨機分為3組，每組8只。分別為低脂飲食組（LFD組），高脂飲食組（HFD組），MCP-1抑制高脂飲食組（HFD+MI組）。HFD+MI組經腹腔注射5mg·kg^-1 Bindarit，LFD組與HFD組注射等體積的生理鹽水，1個月注射1次。低脂飲食組脂肪供能比為10%，高脂飲食組脂肪供能比為45%。

1.2.2 血管、股骨的收集

取喂養24 w的小鼠8只。固定小鼠，輕壓取血側眼部皮膚，使眼球充血突出，彎頭鑷夾取眼球并快速在摘取，使用抗凝管收集血液。收集血液之后，脫臼法處死小鼠，同時收集主動脈及股骨，多聚甲醛固定。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測主動脈Col1A、Ocn、Runx2的mRNA水平

按照TRIzol法提取小鼠主動脈中的總RNA，微量分光光度計檢測純度與濃度，取1ug RNA按照逆轉錄試劑盒的說明書，將RNA逆轉錄為cDNA。根據SYBR Green Master Mix試劑盒說明書，構建反應體系后使用熒光定量PCR儀進行檢測.以gapdh為內參，采用2－△△CT法計算目的基因的表達水平。gapdh上游引物為5′-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3′，下游引物為 5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3′; Col1A上游引物為5′-GAGAGGTGAACAAGGTCCCG-3′，下游引物為 5′-AAACCTCTCTCGCCTCTTGC-3′;Ocn上游引物為5′-ACAGGCTTCCTAGAACAAGGGC-3′，下游引物為 5′-AAGAACTCAAACATACGGGCAA-3′;Runx2上游引物為5′-CCCAACTTCCTGTGCTCCGT-3′，下游引物為 5′-AACTCTTGCCTCGTCCGCTC-3′。

1.2.4 Micro CT

每組取4只小鼠左側股骨， 使用SKYSCAN 1276儀器， 在9μm的分辨率，電壓80 kV，電流100 mA的條件下進行掃描， 在股骨干界面找到生長板凸起位置，即為低密度軟骨橋，以此為參考層，向股骨干方向選取200層為分析區域， 利用相關軟件進行三維重塑和分析， 得到骨表面積（BS， mm2），骨體積與總體積之比（BV/TV，%），骨表面與骨體積之比（BS/BV， 1/mm），骨表面與總體積之比（BS/TV， 1/mm），骨小梁分離（TB.SP，單位mm），骨小梁數量（TB.N，單位為1/mm）等數據。

1.2.5 ELISA檢測MCP-1的含量

3個組各取5只小鼠，收集小鼠的血液，離心后取血清，按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測血清中MCP-1的含量。

1.2.6 免疫組化

3個組各取5只小鼠，將組織固定，常規脫水包埋，石蠟切片脫蠟至水。切片添加檸檬酸緩沖液抗原修復，消除內源性過氧化物酶，添加一抗4℃孵育過夜，二抗常溫孵育，顯色后復染，脫水透明，鏡下拍照，圖片倍數為400x。

1.2.7 茜素紅染色

3個組各取5只小鼠，將組織固定，常規脫水包埋，石蠟切片脫蠟至水。切片浸入茜素紅S染色液5 min，蒸餾水洗1 min。脫水透明，鏡下拍照，圖片倍數為400×，圖中橙紅色為鈣沉積物。

1.2.8 鈣鹽染色

3個組各取5只小鼠，將組織固定，常規脫水包埋，石蠟切片脫蠟至水。切片首先浸入Von Kossa銀溶液5～10 min，然后海波溶液處理2 min，最后HE染色液染1～3 min。脫水透明，鏡下拍照，圖片倍數為400×，圖中紅褐色至深黑色為鈣鹽。

1.2.9 統計學分析

本研究數據分析和作圖采用的軟件為SPSS25.0、Image J與GraphPadPrism8.0，計量資料結果用±s表示。實驗組間差異使用單因素方差分析（Oneway ANOVA） ，Plt;0.05為差異有統計學意義。與LFD組比較，*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001，^****P＜0.0001；與HFD組比較，#P＜0.05，^##P＜0.01，^###P＜0.001，^####P＜0.0001。

2 結果

2.1 主動脈鈣鹽染色

低脂飲食組（LFD組）血管結構基本正常；茜素紅染色中，HFD組可觀察到血管動脈處橙紅色沉淀，為箭頭指示處，鈣鹽染色中，HFD組可在箭頭指示處觀察到黑色沉淀，說明有明顯的鈣鹽沉積；HFD+MI組與HFD組相比，茜素紅染色中觀察到橙紅色沉淀明顯減少，鈣鹽染色中未觀察到明顯的黑色沉淀，說明MCP-1抑制劑可以明顯改善血管鈣化（圖1）。

2.2 主動脈成骨因子Osterix、Osteocalcin的表達

低脂飲食組（LFD組）成骨細胞特異性因子Osterix、Osteocalcin表達不明顯，HFD組可觀察到兩者大量表達（P＜0.05），HFD+MI組中MCP-1抑制劑干預后，兩者表達量明顯降低（P＜0.05）；與此同時，我們檢測了3個組中MCP-1的表達量，LFD組表達量低，HFD組中MCP-1表達明顯增加（P＜0.05），HFD+MI組中干預后，MCP-1表達量相比HFD組中明顯下降（P＜0.05）。在血管鈣化中MCP-1表達量增多，同時成骨相關因子Osterix、Osteocalcin表達量增多，MCP-1抑制劑干預后，3者表達明顯下降，MCP-1的表達與Osterix、Osteocalcin的表達呈現出相同的趨勢，可能是MCP-1通過促進Osterix、Osteocalcin的表達進而導致血管鈣化（圖2，圖3）。

2.3 主動脈成骨相關因子Col1A，Ocn，Runx2 mRNA的表達

應用實時熒光定量PCR實驗檢測小鼠主動脈中成骨標志物mRNA的表達水平，如圖3所示：與LFD組對比，HFD組中Col1A，Ocn，Runx2 mRNA表達顯著升高（Plt;0.05）；HFD+MI組與HFD組相比，Col1A，Ocn，Runx2 mRNA表達顯著降低（Plt;0.05），以上說明MCP-1抑制劑可以明顯降低成骨相關因子的表達，進而改善血管鈣化（圖4）。

2.4 血液中MCP-1的含量

LFD組中MCP-1的含量為200 pg·mL^-1左右，HFD組與LFD相比，觀察到MCP-1的含量明顯增加（Plt;0.05）；HFD+MI組與HFD組相比，MCP-1含量顯著降低，說明MCP-1抑制劑可以降低血管內MCP-1的含量（圖5）。

2.5 股骨的Micro CT分析

與LFD組相比，HFD組骨體積與總體積之比BV/TV、骨表面積BS、骨小梁數量Tb.N、骨表面與總體積之比BS/TV明顯下降，骨小梁分離度Tb.Sp、骨表面與骨體積之比BS/BV均高于對照組，結果具有統計學差異（P＜0.05）；HFD+MI組與HFD組相比，骨體積與總體積之比BV/TV、骨表面積BS、骨小梁數量Tb.N、骨表面與總體積之比BS/TV明顯增加，骨小梁分離度Tb.Sp、骨表面與骨體積之比BS/BV均低于HFD組，結果具有統計學差異（P＜0.05）。HFD組中可觀察到明顯的骨質疏松現象，MCP-1抑制劑干預后，可明顯改善這一現象（圖6，圖7）。

3 討論

骨質疏松癥和血管鈣化是兩種嚴重威脅中老年人健康的疾病，過往研究認為它們是相互獨立且與老齡化相關的疾病，但近來許多研究指出，二者密切相關，且有著許多共同的信號通路。1項研究表明，RANKL與RANK結合通過作用于NF-κB通路，促進破骨細胞分化成熟，提高骨吸收，導致骨密度降低導致骨質疏松癥^［10］；在血管組織中，RANKL與RANK結合通過促進血管平滑肌細胞轉分化為成骨樣細胞，而促進血管鈣化的形成^［11］。Wnt 通路可促進間充質干細胞向成骨細胞分化，進而促進成骨^［12］；在血管中，同樣可以促進血管平滑肌細胞轉分化為軟骨細胞與成骨細胞，導致VC的形成^［13］。臨床研究指出，與健康組相比，骨質疏松組血漿中單核細胞趨化蛋白-1 （MCP-1）水平顯著升高^［14］；MCP-1通過影響破骨細胞的發育和激活，在小鼠骨重塑中發揮了重要作用^［7］。在終末期腎病患者的血管鈣化中，MCP-1促進單核細胞向亞內皮的遷移，并將白細胞吸引到損傷部位，從而促進動脈粥樣硬化和血栓栓塞的發生^［7］。基于以上的研究發現，我們初步研究了MCP-1在骨質疏松及血管鈣化中的作用。

高脂飲食組與低脂飲食組對比，我們觀察到高脂飲食組（HFD組）中觀察到明顯的鈣鹽沉積，免疫組化顯示Osterix、Osteocalcin、MCP-1的表達量增加，Osterix又稱轉錄因子SP7，是一種成骨細胞特異性轉錄因子^［15］，骨鈣素（Osteocalcin， OCN）是最豐富的非膠原骨基質蛋白，由成骨細胞特異性產生^［16］；主動脈成骨相關Col1A、Ocn、Runx2的mRNA表達增加，Runx2是成骨細胞分化的關鍵轉錄調節劑^［17］，COL1A編碼的I型膠原是骨基質蛋白之一，在終末期患者的血管鈣化中，我們可以觀察到OCN與COL1A表達增加，與本實驗的結果一致^［18］；同時我們在該動物模型中檢測了骨相關參數，LH組中我們可以觀察到骨體積與總體積之比、骨表面積、骨小梁數量、骨表面與總體積顯著下降，骨小梁分離度明顯增加，去卵巢大鼠中，MCP-1與骨量呈負相關，與本實驗結果類似^［19］，這些都證實了該組同時具有血管鈣化與骨質疏松，提示我們MCP-1在介導血管鈣化與骨質疏松中發揮了重要的作用。

接下來我們通過抑制MCP-1在體內的含量，來觀察動物發生的變化。HFD+MI組與HFD組相比，我們觀察到HFD+MI組鈣鹽明顯減少，Osterix、Osteocalcin、MCP-1的表達量減少，成骨相關Col1A、Ocn、Runx2的mRNA表達減少；同時，股骨的骨量明顯改善，骨表面積、骨小梁數量等增加，骨小梁分離度明顯降低。以上提示，MCP-1抑制劑在減輕血管鈣化的同時，改善了骨質疏松。

骨關節炎中，MCP-1募集單核細胞到炎癥部位，可能參與軟骨細胞的降解^［20］；骨質疏松中，有研究指出MCP-1與CXCL1可以預測早期骨質流失^［19］。間歇性甲狀旁腺激素刺激成骨細胞分泌MCP-1，從而導致TGF-β增加，參與甲狀旁腺激素的合成代謝作用^［21］。MCP1作為TGFb在損傷動脈中的下游靶點，負責MSCs向損傷血管的遷移和歸巢^［8］。我們做如下猜想，TGF-β可能通過MCP-1促進血管鈣化，作為我們后續的研究方向。綜上所述，在高脂飲食小鼠模型中，抑制MCP-1在增強骨密度的同時，還可以減輕主動脈的鈣鹽沉積，本研究指出MCP-1可能是骨質疏松及血管鈣化潛在的治療靶點之一。

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（責任編輯：編輯唐慧）

基金項目：國家自然科學基金項目 （82160423）

作者簡介：郭桐桐（1995—），男，碩士研究生，專業方向為骨科學。

*通信作者：王維山（1975—），男，教授，博士生導師，從事骨關節炎與骨代謝研究，email：wwsmc2002@sina.com。