黃精病害病原的分離鑒定

摘要：

黃精作為一種傳統中藥材，具有多種藥用功效，隨著栽培面積逐漸增大，黃精病害也隨之增多，為了明確為害黃精的病原菌種類，為黃精病害的診斷和綠色防控提供依據，本文對杭州市淳安縣臨岐鎮采集的黃精病害樣本進行了分離與鑒定。結果顯示，黃精病害樣本上共分離了9種病原菌，其中層出鐮刀菌、新殼梭孢菌、白地霉、瓜笄霉、膝曲彎孢5種病原菌是在黃精中首次分離獲得。研究結果為后續黃精病害的防治提供了理論基礎。

關鍵詞：黃精；病害；真菌；分子鑒定

中圖分類號：S435.672 文獻識別碼：A 文獻編號：1005-6114（2025）01-034-03

黃精作為傳統中藥材，收錄于《中國藥典》，具有多種功效［1］。近年來，隨著市場需求的持續攀升，黃精人工種植規模日益擴大。然而，病害發生給黃精的安全生產帶來了嚴峻挑戰。已報道的黃精病害有葉斑病、炭疽病、葉枯病、根腐病等［2］。對病害的防治需要有針對性，在黃精病害防治工作中，精準識別病原菌至關重要，未確定病原菌的情況下亂用殺菌劑，會增加病菌的抗藥性和農殘，對中藥材品質、經濟效益等都會帶來嚴重的負面影響［3］。本文對杭州市淳安縣栽培的黃精的病害病原進行分離，對真菌rDNA的ITS區段的PCR擴增產物分析，通過與基因數據庫比對鑒定病原類型［4］，為中藥材病害防控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在杭州市淳安縣臨岐鎮，采用隨機取樣法采集20份黃精感病植株（營養器官旺盛生長期），帶回實驗室置于4℃冰箱中保存，用于病原菌的分離培養。

PDA培養基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 L；光學顯微鏡；Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離

將感病黃精樣品置于篩子中用自來水小心地清洗植物病斑表面的雜質，洗凈后晾干，用75%酒精消毒滅菌，再用無菌水清洗2～3次，晾干。 采用組織分離法對樣品病健交界處進行分離，用無菌手術刀切取0.5～1 cm大小的組織塊，接種于PDA培養基平板上，置于25℃、80%相對濕度下培養3 d［5］。

1.2.2 病原菌的純化

用無菌牙簽挑取長出的菌絲，接種至新PDA平板上，25℃、80%相對濕度下培養3 d。根據菌落特征再進行1～3次純化培養，最終得到純凈的單一菌落。

1.2.3 病原菌形態觀察

將分離純化的病原菌接種至新PDA平板上，25℃培養5～7 d。挑取菌絲在顯微鏡下觀察病原菌的形態特征［6］。

1.3 分子生物學鑒定

按照Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取病原菌DNA。以病原菌基因組DNA為模板，利用真菌通用引物擴增目的片段，引物為ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ ［7］。

25 μL反應體系：Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL，引物0.5 μL，ddH2O 11.0 μL。

PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環；72℃再延伸10 min。

反應結束后PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測［8］。

PCR產物送至上海生工生物工程有限公司進行測序，將測序結果提交至NCBI數據庫，通過BLAST軟件進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離

對臨岐鎮采集的黃精病害樣本進行分離純化，共分離篩選獲得9株菌（圖1）。對分離的菌株進行形態學特征觀察，記錄并統計（表1）。

2.2 病原菌鑒定

對分離篩選到的菌株進行ITS序列分析。經鑒定，分離的菌株有1株鐮刀菌，1株新殼梭孢菌，1株白地霉，1株瓜笄霉，1株膝曲彎孢，1株鏈格孢，3株炭疽菌（表2）。

對從黃精上分離的病原菌進行ITS區段分析后，結合以往關于中藥材病害病原的文獻資料，發現有報道稱可引起黃精病害的病原菌有尖孢鐮刀菌、鏈格孢菌、白蠟樹炭疽菌［7，9-10］等。本文篩選鑒定的病原菌與之存在一定差異，其中白地霉、膝曲彎孢、瓜笄霉、新殼梭孢菌、層出鐮刀菌為首次從黃精上分離獲得。淳安縣栽培黃精能夠被多種真菌單一侵染或混合侵染，從而引起黃精植物病害。

3 討論

杭州市淳安縣臨岐鎮是中藥材大鎮，種植的中藥材面積大、種類多，加之臨岐鎮山地農田生態環境各具特色，復雜的中藥材生長環境導致其真菌種類繁多、危害重。本研究中對黃精病原物進行分子測序鑒定，確定了危害黃精的真菌種類，為有針對性地進行病害生物防控提供了參考。

本研究在利用黃精病害病原物為材料提取DNA，利用真菌特有引物ITS1和ITS4，在PCR擴增的基礎上對真菌rDNA的ITS區段進行堿基序列測定，確定真菌的種屬，該方法在進行病原物真菌分類鑒定中是切實可行的［11，12］；同時利用ITS區段DNA序列和互聯網上的生物信息資源比對，對病原物真菌進行分子鑒定，并把所測序列輸入GenBank中，可以進一步豐富GenBank等DNA序列數據庫中的生物信息，為外病原物真菌rDNA上ITS區段的分子鑒定提供依據［13，14］。

本研究鑒定出淳安縣黃精病害的主要病原菌為炭疽菌屬真菌，同時有鐮刀菌、鏈格孢等多種病原真菌混合侵染植株，后期需要通過對不同病原菌具有殺菌效果的菌株進行篩選；同時要考慮多種病原菌存在時，不同菌株進行復配使用的殺菌效果，為中藥材栽培過程中發生的病害提供最佳的生物防治方法，保障中藥材產品質量安全［15］。

參考文獻

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