黃芪甲苷通過調控Nrf2/HO-1通路對肢體動脈硬化閉塞癥大鼠血液流變學的影響

摘要""目的：探究黃芪甲苷對大鼠動脈硬化閉塞癥（ASO）的治療作用及潛在機制。方法：以高脂飼料喂養(yǎng)和隱動脈內膜損傷的方式建立ASO模型，將成功建模的大鼠隨機分為模型組、黃芪甲苷低劑量組以及黃芪甲苷高劑量組，每組10只。另外，設定一個假手術組（10只）。使用血流變分析儀分析血液標本全血黏度、紅細胞聚集指數(shù)及紅細胞剛性指數(shù)等血流變指標。使用全自動生化分析儀上測定血液中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。蘇木精-伊紅（HE）、彈性纖維-維多利亞藍（EVG）染色檢測大鼠動脈血管組織病理形態(tài)改變。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。蛋白免疫印跡法檢測腦組織核因子E2相關因子2（Nrf2）、Kelch樣ECH關聯(lián)蛋白1（Keap1）以及血紅素加氧酶-1（HO-1）蛋白表達。結果：黃芪甲苷組各劑量雖出現(xiàn)了內皮結構受損和管腔變狹窄，但相較于模型組而言，已有所減輕。與模型組相比，黃芪甲苷組各劑量血液黏度降低，血液流動性升高。與模型組相比，黃芪甲苷各劑量組TG、TC、LDL-C、TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低，HDL-C升高（P＜0.05）。與模型組相比，黃芪甲苷各劑量組Nrf2、Keap1和HO-1蛋白水平升高（P＜0.05）。結論：黃芪甲苷可調控Nrf2/HO-1通路，抑制炎癥，改善血脂代謝和血流變指標，減輕ASO大鼠動脈血管組織損傷。

關鍵詞""動脈硬化閉塞癥；黃芪甲苷；血脂代謝；血液流變學

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.05.005

Abstract Objective：To explore the therapeutic effect of astragaloside on arteriosclerosis obliterans（ASO） in rats.Methods：ASO model was established by high-fat diet and intima injury of cryptoartery.The rats successfully modeled were randomly divided into model group，astragaloside low-dose group，and astragaloside high-dose group，with 10 rats in each group.In addition，a sham operation group（10 rats） was set up.Whole blood viscosity，red blood cell aggregation index，and red blood cell rigidity index were analyzed by haemorheological analyzer.Blood levels of total cholesterol（TC），triglyceride（TG），high-density lipoprotein cholesterol（HDL-C），and low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C） were measured using a fully automated biochemical analyzer.Hematoxylin-eosin（HE） and elastic-van gieson（EVG） staining were used to detect the pathological morphological changes of arterial vessels in rats.Serum interleukin-6（IL-6），interleukin-1β（IL-1β），and tumor necrosis factor-α（TNF-α） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The expressions of nuclear factor E2-associated factor 2（Nrf2），Kelch-like ECH associated protein 1（Keap1） and heme oxygenase-1（HO-1） were detected by Western Blot.Results：Although the astragaloside group showed endothelial structure damage and lumen stenosis，compared with the model group，it reduced.Compared with the model group，the blood viscosity of astragaloside group decreased and the blood fluidity increased.Compared with model group，the levels of TG，TC，LDL-C，TNF-α，IL-1β，and IL-6 in astragaloside group decreased，while HDL-C increased（P＜0.05）.Compared with model group，the protein levels of Nrf2，Keap1，and HO-1 in astragaloside group increased（P＜0.05）.Conclusion：Astragaloside can regulate Nrf2/HO-1 pathway，inhibit inflammation，improve lipid metabolism and hemorheology indexes，and alleviate arterial tissue damage in ASO rats.

動脈粥樣硬化是導致心臟、大腦和四肢缺血的主要心血管疾病，嚴重者可導致梗死。動脈粥樣硬化已成為威脅人類健康的重要因素，也是全球人類死亡的主要原因之一［1］。動脈硬化閉塞癥（arteriosclerosis obliterans，ASO）是一種慢性進行性疾病，動脈粥樣硬化導致下肢動脈內膜增厚、管腔狹窄甚至閉塞，進而引起患肢間歇性跛行、靜息痛甚至潰瘍壞死等一系列癥狀和體征［2］。目前，血管內干預和搭橋手術用于減緩ASO的進展，但術后再狹窄率仍然較高，嚴重影響ASO的預后［3］。因此，仍需要尋找治療ASO的理想手段。

在我國，傳統(tǒng)中藥用于治療各種疾病已有數(shù)千年的歷史。作為天然藥物，中藥通?？梢园踩赜糜趯乖S多疾病，包括動脈粥樣硬化［4］。研究發(fā)現(xiàn)，桃葉珊瑚苷可通過改善血脂、抑制氧化應激和炎癥反應，從而減輕動脈粥樣硬化病變［5］。還有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可改善動脈粥樣硬化大鼠血脂代謝和抗氧化能力，進而抑制動脈粥樣硬化的形成［6］。此外，在傳統(tǒng)治療藥物阿托伐他汀的基礎上加用丹參酮ⅡA治療動脈粥樣硬化大鼠的效果更好［7］。黃芪甲苷是黃芪的活性成分，具有抗炎、抗纖維化、抗氧化和免疫調節(jié)等作用［8］。既往研究表明，服用黃芪甲苷有助于緩解動脈粥樣硬化、高血壓、高脂血癥等心血管疾?。?］。目前，ASO發(fā)生機制尚未完全闡明，但炎癥和氧化應激是ASO的重要病理過程［10］。Kelch樣ECH關聯(lián)蛋白1（Keap1）-核因子E2相關因子2（Nrf2）/血紅素加氧酶-1（HO-1）通路已被證明在抗炎和抗氧化應激過程中有著重要作用。本研究旨在探究黃芪甲苷黃調控Nrf2/HO-1通路對ASO的治療作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 建立ASO模型

雄性SD大鼠（6～8周齡，體質量200～220 g，無特定病原體級）由廣州銳格生物科技有限公司提供，將大鼠飼養(yǎng)于（21±2）℃、相對濕度40%～70%和12 h光/暗循環(huán)的房間，所有大鼠均可自由獲取水和食物。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過（No.HBZY2021-KY-089-01）。

為建立ASO模型，參照文獻［11］采用高脂飼料結合隱動脈內膜損傷的方法。具體步驟：選擇未表現(xiàn)出飲食異常的大鼠，先進行1周的高脂飼料喂養(yǎng)。使用2%戊苯巴比妥鈉（40 mg/kg）對大鼠進行全身麻醉。雙側腹股溝和后肢內側皮膚經(jīng)常規(guī)消毒處理后，從雙側腹股溝至膝關節(jié)作縱向約2 cm的切口，隨后進行隱動脈的解剖分離。利用動脈夾子對隱動脈進行暫時夾閉，然后緩慢注入0.25 mL蒸餾水至血管充盈。注射完成后，解除夾閉，進行止血操作，之后縫合切口。隨后，進行1周的高脂飼料喂養(yǎng)建模完成。

將成功建模的大鼠隨機分為模型組、黃芪甲苷低劑量組（40 mg/kg）以及黃芪甲苷高劑量組（80 mg/kg），每組10只。另外，選取10只大鼠作為假手術組，此組大鼠僅進行隱動脈分離，并采用普通飼料喂養(yǎng)。黃芪甲苷低劑量組、高劑量組大鼠則每日灌胃相應劑量的黃芪甲苷（采用二甲基亞砜溶解后，進一步使用生理鹽水調至所需濃度），連續(xù)給藥28 d［12］。而模型組和假手術組大鼠則接受相同體積的生理鹽水灌胃處理。

1.2 血液流變學指標及血脂水平檢測

最后一次用藥干預后24 h，戊苯巴比妥鈉麻醉大鼠后，腹部消毒，暴露皮膚，采集腹主動脈血液，使用血流變分析儀分析血液標本全血黏度（高切、低切）、紅細胞聚集指數(shù)及紅細胞剛性指數(shù)等血流變指標，使用全自動生化分析儀上（西班牙Biosistems公司）測定血液中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。

1.3 大鼠動脈血管組織病理形態(tài)檢測

大鼠行戊苯巴比妥鈉麻醉后處死，分離取出手術側下肢動脈血管，置于多聚甲醛溶液中固定。分別使用蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（貨號#T1001，深圳拓普生物科技有限公司）和彈性纖維-維多利亞藍（EVG）染色試劑盒（貨號#E607318，上海生工生物工程股份有限公司）進行染色，觀察各組大鼠下肢動脈狹窄情況，操作按照試劑盒說明書指導進行。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

采集腹主動脈血液進行離心（4 ℃，1 000×g離心10 min），取上清液，采用ELISA試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）檢測血清中白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，使用酶標儀（美國BioTek）評估OD值。

1.5 蛋白質印跡分析

從手術側下肢動脈血管提取蛋白質，以二辛可酸（BCA）法檢測蛋白總濃度。將樣品的蛋白質用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳并轉移到聚偏二氟乙烯上，隨后，與Keap1（1∶500，貨號#ab119403，英國Abcam）、Nrf2（1∶1 000，貨號#ab92946，英國Abcam）、HO-1（1∶1 000，貨號#43966，美國CST）以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（1∶1 000，貨號#ab9485，英國Abcam）的一抗（上海Beyotime）在室溫下孵育1 h。通過增強化學發(fā)光（ECL）試劑盒（上海Beyotime）檢測蛋白質。使用Image J軟件分析蛋白質表達。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 黃芪甲苷對ASO大鼠血液流變學指標的影響

與假手術組相比，模型組全血黏度、全血還原黏度、血漿黏度、紅細胞聚集指數(shù)及紅細胞比容均顯著增加，紅細胞變形指數(shù)降低（P＜0.05）。與模型組相比，黃芪甲苷各劑量組全血黏度、全血還原黏度、血漿黏度、紅細胞聚集指數(shù)及紅細胞比容降低，紅細胞變形指數(shù)增加（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 黃芪甲苷對ASO大鼠血脂水平的影響

與假手術組相比，模型組TG、TC和LDL-C水平升高，HDL-C降低（P＜0.05）。與模型組相比，黃芪甲苷各劑量組TG、TC和LDL-C水平降低，HDL-C升高（P＜0.05）。詳見表2。

2.3 黃芪甲苷對ASO大鼠動脈血管組織病變的影響

假手術組動脈血管組織形態(tài)結構正常，未出現(xiàn)內皮結構受損。模型組出現(xiàn)內皮結構受損，管腔狹窄，平滑肌排列紊亂。黃芪甲苷各劑量組雖出現(xiàn)了內皮結構受損和管腔變狹窄，但相較于模型組而言，已有所減輕。詳見圖1、圖2。

2.4 黃芪甲苷對ASO大鼠血清促炎因子水平的影響

與假手術組相比，模型組TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高（P＜0.05）。與模型組相比，黃芪甲苷組TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低（P＜0.05）。詳見表3。

2.5 黃芪甲苷對ASO大鼠動脈血管組織中Nrf2/HO-1通路蛋白的影響

與假手術組相比，模型組Nrf2、Keap1和HO-1蛋白水平降低（P＜0.05）。與模型組相比，黃芪甲苷各劑量組Nrf2、Keap1和HO-1蛋白水平升高（P＜0.05）。詳見表4、圖3。

3 討論

ASO是一種常見的血管疾病，其基本發(fā)病機制是動脈粥樣硬化。而脂質代謝紊亂是導致動脈粥樣硬化發(fā)展的關鍵因素，因為這會導致血液黏度增大，造成血管內皮損傷，形成粥樣硬化斑塊［13］。黃芪甲苷是一種環(huán)阿魏烷型三萜糖苷化學物質，被認為是抗動脈粥樣硬化的有效藥物［14］。本研究再次證實了黃芪甲苷治療動脈粥樣硬化的有效性，包括改善脂質代謝紊亂，降低血液黏度，增加血液流動性，緩解動脈血管病變。

血管內皮損傷已被認為是動脈粥樣硬化的第一步，也是必不可少的一步。其有利于細胞黏附和遷移、脂質沉積、單核細胞侵襲和分化為巨噬細胞、平滑肌細胞轉移到內膜及進一步破壞脈管系統(tǒng)、傳播斑塊侵蝕和增加血栓形成［15］。血管內皮的炎癥反應在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［16］。在外界環(huán)境因素的刺激下，可刺激內皮細胞產(chǎn)生多種炎性因子和黏附分子，加速白細胞與內皮細胞的黏附，促進炎癥的發(fā)生。在動脈粥樣硬化的不同階段，T細胞、肥大細胞和巨噬細胞等多種炎性細胞向動脈粥樣硬化斑塊中浸潤是動脈粥樣硬化的主要特征之一［17-18］。促炎細胞因子在動脈粥樣硬化中發(fā)揮關鍵的致病作用，一些炎性細胞因子，如IL-10、IL-1β、干擾素-γ（IFN-γ）和TNF-α等可能導致動脈粥樣硬化的發(fā)生，因為這些細胞因子可導致白細胞和血管的黏附增加以及內皮細胞的形成［19］。此前有報道指出，臨床上使用抗促炎細胞因子療法可以降低心血管事件的發(fā)生率［20］。而黃芪甲苷已被證實具有良好的抗炎作用。本研究結果顯示，ASO大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高，但黃芪甲苷可有效阻止這些促炎細胞因子水平的升高。提示黃芪甲苷可明顯阻止促炎細胞因子的產(chǎn)生而引發(fā)新的動脈硬化斑塊的形成。

Nrf2是機體抗氧化應激和抗炎的重要調節(jié)因子。在生理條件下，Nrf2通過與Keap1形成復合物而主要保留在細胞質中。當暴露于外部應激時，激活的Nrf2會易位到細胞核中并與抗氧化反應基因的啟動子區(qū)域結合，從而調節(jié)下游抗氧化基因的表達，例如HO-1［21］。被Nrf2激活的HO-1可通過清除羥基自由基、單線態(tài)氧和超氧陰離子來防止脂質和蛋白質的過度氧化，此外，HO-1具有顯著的免疫調節(jié)和抗炎功能［22］。Nrf2/HO-1通路已被發(fā)現(xiàn)參與了動脈粥樣硬化的發(fā)展過程。橙皮素調控Nrf2/HO-1通路改善小鼠動脈粥樣硬化病變［23］。脂氧素A4可通過Keap1/Nrf2/HO-1信號通路發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用［24］。本研究結果顯示，Nrf2、Keap1和HO-1蛋白水平在大鼠動脈血管組織降低，而黃芪甲苷可減弱上述變化趨勢。這說明黃芪甲苷可能是通過激活Nrf2/HO-1通路來發(fā)揮治療ASO的作用。

綜上所述，黃芪甲苷可改善ASO大鼠脂質代謝紊亂、血流變以及動脈血管病變，這可能與黃芪甲苷能激活Nrf2/HO-1通路有關。

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基金項目"河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目（No.2022050）

作者單位"1.河北省中醫(yī)院（石家莊"050011）；2.安新縣醫(yī)院；3.定州市人民醫(yī)院

通訊作者"郭娜，E-mail：guona731515@163.com

引用信息"孫云朝，郭娜，魏金，等.黃芪甲苷通過調控Nrf2/HO-1通路對肢體動脈硬化閉塞癥大鼠血液流變學的影響［J］.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2025，23（5）：678-683.

（收稿日期：2023-09-07）

（本文編輯"鄒麗）