神經外科患者艱難梭菌感染的臨床護理及防控

摘要：目的 本研究探討神經外科艱難梭菌的分子流行特征及在院內監測條件下，及時且嚴格落實院內防控和個人衛生措施在控制院內艱難梭菌交叉傳播的實效性，以及臨床護理對神經外科患者艱難梭菌感染預后的影響。方法 本單位自2011年1月開始進行艱難梭菌院內傳播監測，其間發現神經外科病房出現艱難梭菌交叉傳播，通過科室感控責任護士監督嚴格落實防控措施，加強臨床護理，同時繼續監測病房艱難梭菌流行；并將分離培養的艱難梭菌進行全基因組測序分析，了解監測不同時期艱難梭菌的基因特征。結果 本研究涵蓋神經外科3個樓層的病房（病房一、病房二和病房三）住院腹瀉患者，共計分離得12株艱難梭菌，主要為ST35和ST37，分離率為10.9%（12/110）。在監測前期，通過PCR-核糖體分型發現不同樓層的菌株之間存在同源性。在院感科督查下，由感控責任護士規范化嚴格落實消毒隔離措施，并對艱難梭菌患者加強臨床護理，在后續監測過程中未發現艱難梭菌的交叉流行。通過對分離到的艱難梭菌全基因組數據分析，發現交叉傳播菌株屬于攜帶多重耐藥基因的ST-37型艱難梭菌。結論 加強臨床抗菌藥物的合理使用，嚴格落實院內防控和個人衛生措施是減少院內傳播和實現醫院感染控制至關重要的措施。同時，精細化的臨床護理能改善神經外科艱難梭菌感染患者預后。

關鍵詞：艱難梭菌感染；艱難梭菌；神經外科；臨床護理；隔離防控

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Clinical nursing and prevention of Clostridioides difficile infection in

neurosurgical patients

Bi Xiajing， Yang Zhi， Zhao Ping， and Tong Xiaofei

（Department of Nursing， the First Affiliated Hospital， School of Medicine， Zhejiang University， Hangzhou 310003）

Abstract Objective To investigate the molecular epidemiology of Clostridioides difficile （C. difficile） in the neurosurgery department and the effectiveness of timely and strict implementation of nosocomial prevention and control measures and personal hygiene practices in controlling C. difficile cross-transmission under surveillance and to determine the impact of clinical care on the prognosis of neurosurgical patients with C. difficile infection. Methods Since January 2011， surveillance of the nosocomial transmission of C. difficile has been implemented in our hospital. During this period， a cross-transmission of C. difficile in neurosurgery wards was identified. The rigorous preventive and control measures were implemented by the infection control nurses， as well as improvements to the clinical care. Furthermore， whole-genome sequencing analysis of C. difficile was conducted to investigate the genetic characteristics of C. difficile in different surveillance periods. Results This study encompassed inpatients with diarrhea in three different neurosurgery wards （Ward 1， Ward 2 and Ward 3）. A total of 12 strains of C. difficile were isolated， with an isolation rate of 10.9% （12/110）. Among them， ST35 and ST37 were the dominant types. The strains from different wards were homologous identified by PCR-ribosomal type during the pre-monitoring period. In accordance with the supervision of hospital infection-control department， the infection control nurses strictly adhered to implement standardized disinfection and isolation measures， and improved the clinical care for patients. No cross-transmitted strains of C. difficile was not detected during the follow-up surveillance. The whole genome data of the isolated C. difficile strains revealed that the cross-transmitted strains belonged to ST-37， which carried multi-drug resistance genes. Conclusion Strengthening the rational use of clinical antimicrobial drugs， the implementation of rigorous nosocomial prevention， and personal hygiene measures are crucial measures to reduce nosocomial transmission and attain optimal hospital infection control. Meanwhile， the implementation of refined clinical care has the potential to enhance the prognosis of patients with neurosurgical C. difficile infection.

Key words Clostridioides difficile infection; C. difficile; Neurosurgery; Clinical nursing; Quarantine and prevention

艱難梭菌（Clostridioides difficile）是一種嚴格厭氧的革蘭陽性菌，艱難梭菌感染（C. difficile infection， CDI）能引發一系列臨床癥狀，包括腹瀉（≥3次/d）、發熱和腹痛，甚至可發展為結腸炎、危及生命的偽膜性腸炎和中毒性巨結腸，可導致患者死亡[1]。此外，艱難梭菌也是醫源性腹瀉中最常見的條件致病菌之一，可在醫療機構中交叉傳播甚至暴發流行，構成嚴重的公共衛生問題[2]。

艱難梭菌的傳播主要是通過直接接觸受污染的環境或物表，或通過被艱難梭菌芽胞污染的醫療設備（如溫度計）、衛生設施（如馬桶或便盆）以及醫護人員的手，經糞-口途徑發生并引起艱難梭菌在醫療機構中的傳播，導致患者間交叉感染[3-5]。因此，為預防和控制艱難梭菌在院內傳播，臨床需采取系列綜合干預措施，包括嚴格的手衛生、有效的隔離和徹底的環境消毒[5]。事實上，我國艱難梭菌的院內交叉傳播和小規模的暴發流行事件均已有報道[6-7]。然而，目前我國醫療機構對患者艱難梭菌感染后的防控措施重視程度不足，且真正嚴格落實艱難梭菌的院內防控和個人衛生措施尚為欠缺。有研究表明，通過感控責任護士的監督，嚴格落實防控措施，可降低院內交叉感染的發生率；同時，提高對患者精細化水平的護理，可改善患者的預后[8]。

本單位于2011年1月開始實施對艱難梭菌院內感染監測工作。在監測實施后，發現神經外科病房存在艱難梭菌交叉傳播事件，經院感科通過督查感控責任護士積極落實相關防控措施，并加強對艱難梭菌感染患者的精細化護理，最終減少病房艱難梭菌交叉傳播。因此，本研究通過對本次事件的回顧和總結，旨在探討艱難梭菌作為引起院內交叉感染病原菌的監測價值，同時分析及時且嚴格落實院內防控和個人衛生措施在控制艱難梭菌院內傳播的實效性，以及臨床護理對神經外科患者艱難梭菌感染預后的影響；并通過對交叉傳播事件前后分離的艱難梭菌進行全基因組測序分析，探索不同監測事情艱難梭菌的基因特征，為艱難梭菌院內防控提供基礎。

1 資料與方法

1.1 艱難梭菌的監測

艱難梭菌作為引起院內交叉感染的重要病原菌之一，浙江大學醫學院附屬第一醫院感科聯合傳染病重癥診治全國重點實驗室開展艱難梭菌的臨床監測。腹瀉患者（腹瀉次數≥3次/d）的糞便樣本送到實驗室后，使用谷氨酸脫氫酶（DGH）聯合毒素檢測兩步法進行艱難梭菌的臨床檢測并報告；同時根據艱難梭菌實驗室診斷結果和防控相關指南[5]，將艱難梭菌檢測陽性且毒素陽性的病例作為院感監測對象進行及時上報，并對分離的菌株定期采用毛細管凝膠電泳技術進行PCR核糖體分型。

1.2 監測階段和院感措施的落實階段

在2011年1月—2020年12月實施艱難梭菌臨床監測期間，通過PCR核糖體分型發現神經外科送檢樣本中分離的多株相似度100%條帶的同一核糖體核型，疑似患者之間存在交叉傳播，隨即院感科立即聯系科室感控責任護士，嚴格按防控要求落實防控措施。首先，落實艱難梭菌感染患者單間病房隔離，并艱難梭菌感染治療期間，暫時停用一切不必要的抗菌藥物使用；同時，限制探視以阻斷艱難梭菌的直接交叉傳播。其次，落實加強醫護人員的個人衛生。由于艱難梭菌芽胞可通過不同的接觸性媒介進行傳播，如對醫務人員的手、聽診器等；因此在接觸患者或其個人物品時，佩戴一次性手套，使用后，立刻丟棄并執行正確的手衛生程序。當有未佩戴一次性手套接觸艱難梭菌感染的患者或其物品的情況發生時，必須使用洗手液或肥皂進行徹底洗手。再次，落實強化環境的消毒。患者所用的被服、衣物均使用500 mg/L有效氯溶液充分浸泡30 min后送洗；患者排泄的糞便用10000 mg/mL含氯消毒劑進行消毒處置；同時加強病房環境消毒，確保落實每日進行至少30 min的紫外線消毒和每周至少1次的空氣凈化，并用1：100稀釋的含氯消毒劑對地面、桌椅和窗戶等進行擦拭消毒。

1.3 患者艱難梭菌感染的臨床護理

除了進行有效的消毒隔離措施外，由于神經外科患者其特殊的治療條件，尤其是侵入性手術，家屬和患者對康復的期望值往往較高。除了常規的神經外科術后護理措施外，當患者出現腹瀉、消瘦且單獨隔離治療時，家屬可能會出現焦躁和悲觀。在這種情況下，責任護士及時向患者及家屬提供關于艱難梭菌感染的知識、心理方面給予積極的疏導，幫助緩解患者及家屬的精神壓力，協助他們建立后續治療和護理的信心，以此積極配合醫療團隊的治療。

與此同時，艱難梭菌感染患者常伴發熱癥狀，首先考慮物理降溫的方式來降低患者的體溫，若患者體溫超過38.5 ℃時，遵循醫囑給予藥物降溫，如消炎痛栓塞肛降溫，同時，密切監測患者體溫的變化并詳細記錄，以便及時調整護理方案。

1.4 艱難梭菌的分離培養及鑒定

取0.2～0.3 g患者送檢的不成形糞便樣本（或水樣便0.2～0.3 mL）浸泡于無水乙醇中，室溫靜置30 min后，以3000 r/min離心15 min，棄去上清液后，加入0.5 mL生理鹽水充分混勻。然后將適量混合液均勻涂布在選擇性培養基環絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂培養基（cycloserine-cefoxitin-fructose agar， CCFA）上，在Electrotek AW300SG厭氧工作站（厭氧環境：80%氮氣-10%二氧化碳-10%氫氣）中于37 ℃下培養48～72 h觀察結果。對于可疑的菌落進行MALDI-TOF-MS鑒定，確認為艱難梭菌的菌株（score value≥2）。對于檢測出的艱難梭菌菌株，通過聚合酶鏈反應（PCR）鑒定其毒素基因tcdA、tcdB、cdtA和cdtB[9-10]，以確定其是否為產毒菌株。

1.5 艱難梭菌PCR-核糖體分型

引物序列參考Bidet等[11]，PCR反應條件：反應體系50 μL；95 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min、57 ℃ 1 min、75 ℃ 1 min，35個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增后的產物選用S1卡夾（High Resolution Cartridge，Bioptic公司）在全自動多功能毛細管電泳儀（Bioptic Qsep100，Bioptic公司）檢測，根據檢測條帶導出圖譜，圖譜導入BioNumerics7.6軟件進行比對。根據系統算法進行聚類分析，將相似度100%條帶認定為同一核糖體核型。

1.6 基因組提取、測序和組裝

為了解所分離的艱難梭菌基因特征，將產毒素艱難梭菌重新接種于哥倫比亞血瓊脂平板，并在35 ℃的厭氧條件下培養48 h。隨后，用FastDNA Spin Kit試劑盒提取菌株的基因組DNA，并進行全基因組測序（WGS）。測序是在Illumina HiSeq 2500系統（Illumina， San Diego， CA， USA）上完成的。在組裝前，通過 FastQC v.0.11.5對原始序列讀數進行質量控制（https：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/），并使用Trimmomatic v.0.40對適配器區域進行修剪處理[12]。最后，使用SPAdes v.3.6軟件對處理后的序列數據進行基因組的重組裝[13]。

1.7 系統發育和基因組特征分析

為了探究產毒艱難梭菌的種群結構，將上述組裝好的基因組數據上傳至PubMLST數據庫進行多位點序列分型（MLST）（http：//pubmlst.org/organisms/clostridioides-difficile/）。并用Snippy軟件（http：//github.com/tseemann/snippy）基于參考序列艱難梭菌630 （Accession： NC_009089.1）分析產毒素艱難梭菌菌株之間差異性突變位點，即單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism， SNP）；同時，基于核心基因組的SNP利用MEGA11構建最大似然樹和利用Cytoscape構建最小生成樹[14]。

根據抗生素耐藥性綜合數據庫（Comprehensive Antib iotic Resistance Database， CARD）檢測耐藥基因；根據毒力因子數據庫（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria， VFDB）確定了毒力基因。同時使用BLAST與CARD下載的gyrA和gyrB參考序列，進行氟喹諾酮類藥物的抗性基因位點突變分析。

1.8 統計學方法

用SPSS 21.0軟件對本研究中的數據進行處理，用χ2檢驗，計量資料用均數±標準差（x±s）表示；用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 艱難梭菌交叉感染事件的發生

本研究涵蓋了神經外科3個樓層的病房（病房一、病房二和病房三）住院腹瀉患者，在監測期間，實驗室通過對同一時段本院所有分離的共計78株產毒素艱難梭菌進行PCR核糖體分型發現，其中分離自3位神經外科患者的3株艱難梭菌，其條帶相似度100%，考慮為同一核糖體核型；基于此結果及患者相關住院信息，考慮3位神經外科患者之間可能存在交叉感染，分別為神經外科病房三患者P1、病房二患者P2和P3（圖1）。分離自P4患者的艱難梭菌菌株距離上與上訴菌株較遠，不考慮相互傳播。

2.2 院感防控措施的落實

實驗室將此事件定義為艱難梭菌交叉感染事件上報院感科，院感科聯系我科感控責任護士，督查嚴格落實院內防控措施和個人衛生措施；同時，加強對艱難梭菌感染患者的精細化護理，減少患者和家屬負面情緒。

2.3 CDI患者護理后的臨床療效

為了解嚴格落實院內防控和個人衛生措施，以及對艱難梭菌感染的神經外科患者進行精細化臨床護理的預后效果，對交叉感染前后患者的單次住院總時間、艱難梭菌感染治療后至出院的時間進行了數據統計分析，經對比研究發現無顯著性的差異，P值均大于0.05；但是，交叉感染防控后的患者在艱難梭菌感染治療后至出院的平均住院時長呈縮減趨勢（表1）。在后續的艱難梭菌臨床監測中，未監測到科內患者艱難梭菌發生交叉感染事件的發生。

2.4 艱難梭菌基因組特征

為了解交叉傳播事件前后艱難梭菌菌株的基因特征和神經外科患者艱難梭菌感染流行情況，對本次研究中所收集的110份臨床糞便樣本進行體外艱難梭菌分離培養，共計分離得12株艱難梭菌并進行全基因組測序分析，組裝的基因組序列已提交至GenBank數據庫（accession number： PRJNA432876），樣本分離率為10.9%（12/110）。經MLST分型發現分別為：ST-2（1株）、ST-14（1株）、ST-35（4株）、ST-37（3株）、ST-54（1株）、ST-81（1株）和ST-98（1株）型。

在2011年1月—2011年6月期間發生疑似交叉傳播事件的3株產毒素艱難梭菌經多位點序列分型發現同為ST-37型，均攜帶多種耐藥基因，包括AAC（6'）-Ie-APH（2\"）-Ia、ermB、cdeA和tetM，而且發現有gyrA突變（Thr82Ile）（圖2）。通過核心基因組數據分析發現，病房三患者P1與病房二患者P3所分離的艱難梭菌核心基因組僅相差1個SNP，而病房二患者P2與同一樓層患者P3的艱難梭菌核心基因組相差多個SNP（圖3）。依據艱難梭菌分子進化，在間隔124～364 d

的傳播分離株之間鑒定出0～3個單核苷酸變異，說明菌株為同一菌株[15]。由此判斷患者之間確實存在艱難梭菌交叉傳播事件，為跨樓層但非直接接觸性艱難梭菌交叉傳播；同時也說明在臨床艱難梭菌日常監測中，PCR核糖體分型可及早發現院內潛在交叉傳播事件。

至此，2011年6月—2020年12月后續的監測期共計分離的9株產毒素艱難梭菌，分別為ST-2、ST-14、ST-35、ST-54、ST-81和ST-98型，未發現與發生交叉傳播的同一ST型菌株（包括ST-37）。值得注意的，在病房二患者P8住院期間，多次分離得攜帶多種耐藥基因的ST-35型艱難梭菌，包括AAC（6'）-Ie-APH（2\"）-Ia、catD、cdeA、clbA、tetM以及gyrA突變（Thr82Ile），但均未從其他患者中分離得相同分型且小于3個SNP艱難梭菌。說明及時的院感防控措施介入并落實，對于控制和避免艱難梭菌患者之間交叉傳播是有效的。

3 討論

艱難梭菌感染是全球范圍內最普遍的院內獲得性感染性疾病之一，超過半數的艱難梭菌感染病例發生在住院期間[16]。在我國，艱難梭菌感染總流行率為11.4%，就地理分布而言，華北地區與華南地區在統計學上并不顯著，但是不同地區艱難梭菌的流行率有一定的差異性[17]。本研究發現產毒素艱難梭菌在神經外科患者送檢樣本中的分離率為10.9%且主要流行株為ST-35和ST-37，與我院前期所報道的艱難梭菌分子流行特征相仿[18]。

艱難梭菌仍是醫源性腹瀉中最常見的致病菌之一，可導致醫療機構中交叉傳播[16]。由于艱難梭菌可形成芽胞，對高溫、干燥和消毒酒精等具有強大的耐受性，并在體外環境中存活數周甚至數月，從而大大增加院內患者之間的交叉傳播風險[3]。尤其是攜帶多重耐藥的艱難梭菌，這一特征會進一步增強艱難梭菌在環境中的適應性，尤其是在胃腸道環境中，更適合其定植生存[19]。在本研究中，發現科室內不同樓層患者之間的非接觸性交叉傳播事件，通過全基因組數據分析確證菌株為攜帶多重耐藥基因的ST-37型。事實上，強化院內感染防控措施，尤其是嚴格落實院內防控和個人衛生措施，優化環境衛生，是為避免院內患者間艱難梭菌的交叉傳播和暴發流行的關鍵策略[5]。在一項單中心實驗研究中，首次評估了院內防控和衛生消毒措施的實效性，發現院內獲得性艱難梭菌感染的發生率每日顯著下降[20]。使用無接觸消毒技術，如紫外線、和含氯的消毒液進行消殺，均可有效地減少病房中的艱難梭菌芽胞，從而降低艱難梭菌感染發病率[3]。此外，艱難梭菌陽性患者的單間隔離是直接有效、切斷艱難梭菌患者間交叉傳播的手段之一[5]。在本研究中，我科室在院感科督查下嚴格落實院內防控和個人衛生措施后，從患者分離的產毒素艱難梭菌之間未發現交叉傳播，尤其在患者P8多次分離的相同型攜帶多種耐藥基因的艱難梭菌ST-35住院期間，未從其他患者糞便樣本中分離得其相同分型的艱難梭菌。因此，艱難梭菌感染患者的單間隔離以及嚴格落實院內防控措施和個人衛生措施，在控制或減少艱難梭菌院內患者之間的交叉傳播是有效的。此外，加強對神經外科艱難梭菌感染患者的護理措施質量，包括艱難梭菌感染后實施的有效治療措施，包括停止一切不必要的抗菌藥物使用，以及神經外科術后護理措施[8]，可以提高患者在臨床上的預后并減少患者住院日。

快速、精準的分型方法有助于艱難梭菌院內感染的監測，毛細管凝膠電泳技術進行PCR核糖體分型具有較高的靈敏度，對遺傳親緣關系具有良好的辨識度[21]，可以初步判斷患者之間艱難梭菌交叉傳播的事件發生。通過結合患者的臨床相關信息，PCR核糖體分型可以為臨床艱難梭菌日常監測提供便捷且快速的手段。

通過全基因組測序分析，雖然本研究中尚未發現國外在院內引起暴發流行且較為流行的BI/NAP1/027型艱難梭菌，但是發現交叉傳播菌株ST-37型艱難梭菌不僅攜帶多重的耐藥基因，也存在氟喹諾酮類藥物的點突變（gyrA，Thr82Ile），導致對氟喹諾酮類耐藥。盡管大多數抗菌藥物對艱難梭菌無治療作用，但耐藥的艱難梭菌在環境中具有生存優勢[22]。此外，研究證實，攜帶有氟喹諾酮耐藥基因gyrA（Thr82Ile）突變的艱難梭菌是醫療環境中艱難梭菌傳播的重要標志[23]。已有研究表明，通過減少氟喹諾酮類藥物的臨床使用，可以降低院內艱難梭菌感染的發生率[24]。因此，不僅臨床一方面需要加強對發生艱難梭菌感染患者的院感防控措施，同時也需要加強抗菌藥物的合理使用，如減少氟喹諾酮類藥物的使用，以減少艱難梭菌感染的發生。

綜上所述，除了院內艱難梭菌分子流行病學的監測，及早發現病例的聚集和交叉傳播事件外，加強臨床抗菌藥物的合理使用，以及嚴格落實院內防控和個人衛生措施是減少院內傳播和實現醫院感染控制至關重要措施。此外，提升臨床醫護人員對艱難梭菌感染的認識、優化護理措施和強化護理觀察細致性，對于促進患者預后和減少患者住院日依舊具有積極的作用。

參 考 文 獻

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