黑骨藤醇提取物調控巨噬細胞極化對小鼠痛風性關節炎的影響及機制研究

摘要：探討黑骨藤醇提取物對小鼠痛風性關節炎的抗炎作用及其初步機制，將C57/BL雄性小鼠隨機分為對照組、模型組、秋水仙堿組和黑骨藤組，對照組和模型組給予7 d生理鹽水灌胃，其余兩組每天分別用秋水仙堿0.3 mg/kg或黑骨藤50 mg/kg灌服。給藥第5 d時，除對照組外其余3組在小鼠右踝關節注射50 μL尿酸鈉懸液構建急性痛風性關節炎模型。造模48 h后測定小鼠足趾容積并進行步態評分，HE染色觀察滑膜組織病理學特征，ELISA檢測血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4和IL-10水平，免疫熒光染色檢測滑膜M1型巨噬細胞標志物iNOS和M2型巨噬細胞標志物Arg1的水平，免疫組化檢測p-AMPK和HIF-1α蛋白的表達水平。將RAW264.7巨噬細胞隨機分為對照組、尿酸鈉組（MSU組）、尿酸鈉+黑骨藤組（MSU+PFS組）、尿酸鈉+黑骨藤+Compound C組（MSU+PFS+CC組），用尿酸鈉晶體刺激RAW264.7巨噬細胞構建體外炎癥模型。蛋白質印跡法檢測各組iNOS、Arg1、p-AMPK和HIF-1α蛋白表達水平，用試劑盒測定各組葡萄糖、乳酸和細胞ATP濃度。結果顯示：秋水仙堿與黑骨藤醇提取物減輕了小鼠右踝關節腫脹，降低了關節步態評分、滑膜組織炎細胞浸潤，下調了TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌水平，提高了IL-4、IL-10的分泌水平。黑骨藤能減少RAW264.7巨噬細胞iNOS蛋白表達，上調Arg1蛋白表達，激活p-AMPK，下調HIF-1α表達，并增加細胞的ATP水平，降低葡萄糖消耗和乳酸生成，AMPK抑制劑Compound C可以減弱黑骨藤醇提取物的上述作用。綜合表明：黑骨藤醇提取物可能通過AMPK/HIF-1α途徑調節巨噬細胞極化，從而減輕痛風性關節炎的炎癥反應。

關 鍵 詞：黑骨藤；痛風性關節炎；巨噬細胞極化

中圖分類號：R285 文獻標志碼：A

文章編號：1673-9868（2025）03-0179-12

The Effect and Preliminary Mechanism Study of Periploca forrestii Schltr Alcohol Extract Regulating Macrophage Polarization on Gouty Arthritis in Mice

WANG Mi¹， LI Menglan¹， ZHAO Xu¹，XIE Qingqing²， XIAO Jiawei¹， SHUAI Shiquan^1，2

1. The Second Clinical Hospital of North Sichuan Medical College/Rheumatology and Immunology Department of Nanchong Central Hospital，Nanchong Sichuan 637000，China；

2. Inflammation and Immunology Nanchong Key Laboratory，Nanchong Central Hospital，Nanchong Sichuan 637000，China

Abstract：To explore the anti-inflammatory effect and potential mechanism of Periploca forrestii Schltr alcohol extract on gouty arthritis of mice．C57/BL male mice were randomly divided into a control group，a model group，a colchicine group，and P. forrestii Schltr group．The control group and model group were given physiological saline by gavage for 7 days，while the other two groups were given colchicine （0.3 mg/kg） and P. forrestii Schltr （50 mg/kg） by gavage，respectively．On the 5^th day of administration， except for the control group，the other three groups were injected with 50 μL sodium urate suspension into the right ankle joint of mice to construct an acute gouty arthritis model．After 48 hours of modeling，the volume of mouse toes was measured and gait scores were performed．HE staining was used to observe synovial tissue pathology，ELISA was performed to detect the levels of TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-4，and IL-10 in serum，immunofluorescence staining was used to detect the levels of M1 macrophage marker iNOS and M2 macrophage marker Arg1 in synovium，and immunohistochemistry was used to detect the expression levels of p-AMPK and HIF-1α proteins．RAW264.7 cells were randomly divided into control group，sodium urate group，sodium urate+P. forrestii Schltr group，and sodium urate+P. forrestii Schltr+Compound C group．An in vitro inflammatory model was constructed by stimulating RAW264.7 cells with sodium urate crystals．Protein blotting was used to detect the expression levels of iNOS，Arg1，p-AMPK， and HIF-1α proteins in each group，and the concentrations of glucose，lactate，and cellular ATP in each group were measured using reagent kits．Colchicine and P. forrestii Schltr alcohol extract reduced swelling of the right ankle joint of mice，decreased joint gait score，synovial tissue inflammatory cell infiltration，downregulated TNF-α，IL-1β，IL-6 secretion levels，and increased IL-4 and IL-10 secretion levels． P. forrestii Schltr alcohol extract can reduce the expression of iNOS protein in RAW264.7 cells，upregulate the expression of Arg1 protein，activate p-AMPK，downregulate the expression of HIF-1α，and increase the ATP level of cells，reduce glucose consumption and lactate production．Compound C can weaken the above effects of P. forrestii Schltr alcohol extract．P. forrestii Schltr alcohol extract may regulate macrophage polarization and alleviate gouty arthritis response through the AMPK/HIF-1α pathway．

Key words：Periploca forrestii Schltr；gouty arthritis；macrophage polarization

痛風性關節炎（Gout Arthritis，GA）是一種由尿酸鈉晶體（Monosodium Urate Crystals，MSU）在滑膜、骨、關節囊、軟骨和組織中積聚引起的炎癥性關節疾病^［1-2］。迄今，臨床上常用抗痛風急性發作的藥物有較大毒副作用，因而尋找無毒副作用或毒副作用小的天然產物備受關注。黑骨藤（Periploca forrestii Schltr， PFS）又叫狹葉蓬萊葛，是中國西南地區的傳統藥用植物，其提取物具有抗炎、鎮痛及強心等功效^［3-4］。研究發現，巨噬細胞是參與GA發展的重要效應細胞^［5］，其極化狀態與痛風的發生和發展密切相關^［6-7］。黑骨藤醇提取物能否調控巨噬細胞極化狀態減輕GA癥狀與機制還未見報道，本研究通過構建小鼠急性痛風性關節炎模型，觀察黑骨藤醇提取物對小鼠痛風性關節炎的防治效果及調控巨噬細胞極化狀態的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞

6～8周齡、體質量20±0.23 g的雄性SPF級C57/BL小鼠共24只，購于川北醫學院動物實驗中心，在溫度22～25 ℃條件下飼養，充足飲食和飲水，每12 h明暗循環。研究嚴格按照川北醫學院動物倫理委員會的方案（2023100）實施。小鼠RAW264.7巨噬細胞購于上海一研生物科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

秋水仙堿片，云南西雙版納藥業有限責任公司；尿酸鈉晶體，美國Sigma公司；IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10試劑盒，上海茁彩生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，碧云天生物技術研究所；誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1）抗體，Proteintech公司；低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）抗體，Abclonal公司；磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（phosphorylated AMP-activated protein kinase，p-AMPK），Affbiotech公司；AMPK抑制劑Compound C，北京德航五洲科技有限公司。

1.3 黑骨藤醇提取物的制備

黑骨藤（PFS）藥材采集于貴州省貴陽市，由川北醫學院藥學院分離提取與鑒定^［8］。取黑骨藤藥材120 g粉碎，加入70%乙醇1 200 L，在70 ℃水浴中回流提取2 h，過濾，重復3次，合并濾液；分別用石油醚和正丁醇萃取，正丁醇溶劑在真空蒸發器中蒸發，生成正丁醇組分；將最終提取液干燥即得到PFS醇提取物活性成分，最后將混合物配制成1 g/mL的藥汁并滅菌包裝。

1.4 急性痛風性關節炎的建模與關節腫脹評價

隨機將24只C57/BL雄性小鼠分為4組，對照組和模型組給予7 d生理鹽水灌胃；秋水仙堿組與黑骨藤醇提取物組每天分別用秋水仙堿0.3 mg/kg或黑骨藤醇提取物50 mg/kg連續灌胃7 d；第5 d給藥時，除對照組外其余3組在小鼠右踝關節腔注射25 mg/mL的尿酸鈉混懸液50 μL，構建急性痛風性關節炎模型^［9］。造模前及造模后48 h測定小鼠右踝關節足趾容積并進行步態評分，腫脹度（S）的計算公式^［10］為：

S=V_測定-V_初始 V_初始×100%（1）

式中：V_測定為測定時間點足容積；V_初始為初始足容積。

步態評分標準^［9］：步態正常，計0分。靜止時，雙后肢著地無明顯差異；活動時，患側肢體承重減輕，輕度跛行，計1分。不管靜止還是活動狀態下，患側肢體承重均明顯減弱，明顯跛行，計2分。患側肢體不能承重，完全離地，三足步態，計3分。

1.5 小鼠踝關節病理形態學觀察

第7 d灌胃1 h后，頸椎脫臼處死小鼠。取小鼠建模側踝關節，4%多聚甲醛固定，EDTA脫鈣60 d，石蠟包埋并切片，蘇木精—伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，顯微鏡觀察，采用數字病理切片掃描進行拍片。

1.6 ELISA測定血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-4的分泌情況

末次給藥1 h后心臟穿刺采血，靜置2 h，3 000 r/min離心20 min，取上清液，ELISA法檢測小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10水平。

1.7 免疫學方法檢測iNOS、Arg1、p-AMPK和HIF-1α的蛋白表達

一組切片脫蠟脫水，檸檬酸鈉抗原修復，使用CD68、iNOS、Arg1作為一抗，染色完成后用熒光倒置顯微鏡檢測分析；另一組切片脫蠟脫水，微波修復抗原，加p-AMPK和HIF-1α后4 ℃過夜，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，并采用Image J軟件分析其陽性表達的吸光度值，計算陽性率。

1.8 RAW 264.7巨噬細胞模型的構建及給藥

將1×10⁵個/孔的RAW 264.7巨噬細胞接種于6孔板，每組做3個復孔。將細胞分為對照組（常規培養）、尿酸鈉組（MSU組，100 μg/mL MSU混懸液刺激6 h）、尿酸鈉+黑骨藤組（MSU+PFS組，在MSU組基礎上加入50 μg/mL的PFS，處理12 h）、尿酸鈉+黑骨藤+Compound C組（MSU+PFS+CC組），在MSU+PFS組基礎上加入5 μmol/L的Compound C處理2 h）。

1.9 采用MTT法檢測RAW 264.7巨噬細胞活力

將RAW264.7巨噬細胞接種于96孔板中，5×10⁴個/孔，分別設置空白組、對照組和給藥組。將孔板放置在條件為37 ℃、5%CO₂的培養箱中培養24 h，之后將培養基更換為含有不同藥物濃度（0、25、50、100、200、400 μg/mL）的黑骨藤培養基，每孔加入100 μL，并繼續孵育12 h。在檢測前，每孔避光加20 μL MTT（5.0 mg/mL）培養4 h，遺棄培養液，每孔加150 μL DMSO，37 ℃孵育10 min，570 nm處測定OD值并計算細胞活力。

1.10 免疫印跡法檢測iNOS、Arg1、p-AMPK、HIF-1α的蛋白表達水平

收集各組巨噬細胞，用RIPA裂解液從細胞中提取總蛋白。使用等量蛋白質上樣，選擇10%的十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行分離；然后全部轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗iNOS、Arg1、p-AMPK、HIF-1α，TBST沖洗，后加入二抗，ECL暗室顯色，Image-Pro Plus分析蛋白表達水平。

1.11 RAW 264.7巨噬細胞內ATP、葡萄糖攝取量、乳酸生成量的測定

收集各組巨噬細胞及培養液，使用ATP含量試劑盒檢測各組RAW264.7巨噬細胞中ATP的含量；吸取上清液，使用葡萄糖和乳酸含量檢測試劑盒分別檢測葡萄糖消耗水平和乳酸分泌水平，具體步驟參照說明書。

1.12 統計學分析

采用SPSS 26.0統計學軟件進行數據處理，結果以x±s表示；采用單因素方差分析，p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 各組小鼠踝關節腫脹度與步態評分

小鼠踝關節腫脹程度見圖1，結果顯示，與對照組比較，模型組踝關節腫脹度和步態評分均顯著升高；與模型組比較，秋水仙堿組和黑骨藤組踝關節腫脹度和步態評分均顯著降低（圖2）。

箭頭指示踝關節腫脹度比較。

2.2 小鼠踝關節組織病理學觀察

由圖3可知，對照組小鼠踝關節滑膜細胞排列整齊，周圍軟組織未出現炎細胞浸潤；模型組小鼠踝關節中，滑膜細胞增生明顯，可見大量炎細胞浸潤、纖維素樣物質滲出、水腫、出血和新生毛細血管形成；秋水仙堿組小鼠踝關節中滑膜細胞基本保持正常狀態，僅有少量炎細胞浸潤；黑骨藤組小鼠關節中，滑膜細胞略有增生，充血水腫不明顯，可見少量炎細胞浸潤。

2.3 各組小鼠血清炎癥因子水平檢測

由圖4可知，模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高，IL-4、IL-10水平顯著降低；與模型組比較，秋水仙堿和黑骨藤組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低，IL-4和IL-10水平顯著升高。

2.4 各組小鼠踝關節組織巨噬細胞極化標志物iNOS和Arg1的表達情況

綠色染料標定CD68，紅色染料標定iNOS和Arg1，藍色染料標定細胞核，通過這種方式可以對活化的M1和M2巨噬細胞進行區分。M1巨噬細胞在膜表面高表達CD68和iNOS，而M2巨噬細胞則高表達CD68和Arg1^［11］。由圖5可知，模型組小鼠關節滑膜組織中M1細胞的標記物iNOS蛋白熒光強度顯著增強；與模型組比較，黑骨藤組和秋水仙堿組小鼠關節滑膜組織中iNOS蛋白熒光強度明顯下降，而M2細胞的標記物Arg1蛋白熒光強度顯著增強。

2.5 各組小鼠滑膜組織p-AMPK、HIF-1α蛋白的表達情況

由圖6可知，模型組小鼠滑膜組織p-AMPK蛋白水平明顯降低，HIF-1α蛋白水平明顯升高；與模型組比較，秋水仙堿組和黑骨藤組p-AMPK蛋白水平明顯升高，HIF-1α蛋白水平明顯降低。

2.6 不同濃度黑骨藤對RAW264.7巨噬細胞活性的影響

由圖7可知，當黑骨藤濃度大于50 μg/mL時，對細胞活力有顯著抑制作用；25、50 μg/mＬ的黑骨藤對細胞活性影響不大，提示在該濃度范圍內對細胞沒有明顯毒性作用，故本實驗選用高濃度50 μg/mL的黑骨藤進行后續的細胞實驗。

2.7 黑骨藤通過AMPK/HIF-1α通路對巨噬細胞極化的影響

由圖8可知，尿酸鈉組（MSU組）iNOS和HIF-1α蛋白水平明顯增加，Arg1和p-AMPK蛋白水平顯著降低；與MSU組比較，尿酸鈉+黑骨藤組（MSU+PFS組）iNOS和HIF-1α蛋白水平明顯降低，Arg1和p-AMPK蛋白水平顯著增加；與MSU+PFS組比較，尿酸鈉+黑骨藤+Compound C組（MSU+PFS+CC組）iNOS和HIF-1α蛋白水平明顯增加，Arg1和p-AMPK蛋白水平顯著降低。

2.8 黑骨藤對尿酸鈉刺激的RAW264.7巨噬細胞的糖酵解活性影響

由圖9可知，MSU組細胞內ATP水平降低，乳酸排泄和葡萄糖消耗增加；與MSU組比較，MSU+PFS組巨噬細胞內ATP水平增加，乳酸排泄和葡萄糖消耗降低；與MSU+PFS組比較，MSU+PFS+CC組細胞內ATP水平明顯降低，乳酸排泄和葡萄糖消耗明顯增加。

3 討論與結論

痛風是臨床常見的炎癥性關節炎，且近年來其發病率及致殘率呈現出逐漸升高的趨勢^［12］。目前治療痛風的藥物有秋水仙堿、非甾體抗炎藥和糖皮質激素，但以上藥物均存在一定的副作用，比如胃腸道不適、消化道出血、過敏等^［13-14］，因此，臨床上急需尋找一種安全高效的藥物。

黑骨藤（PFS）為西南地區常用藥，常用于治療風濕性、類風濕性關節炎^{［4，15-16］}。近年來有研究發現，黑骨藤在痛風的治療中具有顯著效果。黨榮敏等^［17］研究表明黑骨藤醇提物可下調痛風模型大鼠關節的IL-1β、IL-6、IL-8與TNF-α的表達，減輕大鼠踝關節的腫脹，減少滑膜組織炎癥細胞的浸潤。這一研究結果證實了PFS可有效治療痛風性關節炎（GA），但其藥理機制至今尚未完全闡明，因此本課題組針對黑骨藤治療痛風性關節炎的機制展開了進一步研究。

巨噬細胞主導的先天免疫是早期GA發生和進展的主要原因^［18］，也是其發生和進展的重要效應細胞，在不同的微環境中表現出高度的可塑性和異質性，具有對感染和損傷做出快速反應、有利于損傷組織修復的兩大關鍵作用，即巨噬細胞首先極化為促炎表型（M1），然后轉變為抗炎表型（M2），以便在直接危險過去時促進修復^［19］。MSU晶體在關節腔內聚集并與單核/巨噬細胞系統相互作用是誘導急性痛風性關節炎的關鍵。在GA小鼠關節組織中，M1型巨噬細胞數量增加，可引起IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎細胞因子的過量產生，大量的促炎細胞因子會導致免疫失衡，促進炎癥的發展。M2型巨噬細胞能夠分泌IL-4和IL-10等抗炎細胞因子，可緩解關節炎癥并促進組織損傷修復，因此，在痛風的炎癥發展中，巨噬細胞從M1到M2的極化可能有助于急性炎癥的自限性，而極化障礙則導致急性炎癥慢性化^［20］。M1巨噬細胞高表達iNOS，M2巨噬細胞高表達Arg1，這些標志物的檢測已被用于測定巨噬細胞的極化狀態^［21-25］。在本研究中，PFS給藥后能夠抑制MSU誘導的GA小鼠M1型巨噬細胞極化及炎癥細胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表達，同時促進M2型極化及抗炎細胞因子IL-4和IL-10的表達。這一結果表明PFS可能通過調節巨噬細胞極化來緩解GA小鼠的炎癥反應。

AMPK是一種在進化過程中高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被認為是巨噬細胞極化的調節因子^［26］。根據最新的研究，激活AMPK可以加速NF-κB的降解，增加Akt的活性，從而抑制炎癥反應，促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞的轉化^［27］。HIF-1α是誘導低氧基因及細胞氧內環境修復的核心調節因子，可調控細胞的生長、增殖、遷移、炎癥和凋亡等過程^［28-29］。有報道認為HIF-1α是控制炎癥細胞的代謝開關，可促進細胞的缺氧適應 ^［30-31］。激活HIF-1α可以抑制M1型巨噬細胞極化和糖酵解，控制關節和皮膚的炎癥反應^［32］。M1巨噬細胞主要依靠有氧糖酵解快速提供ATP來合成炎癥小體^［33］。炎癥發生時，活化的M1巨噬細胞中三羧酸循環中間產物琥珀酸產量整體增加^［34-35］，琥珀酸的增加有助于HIF-1α的穩定，這是巨噬細胞持續產生IL-1β所必需的條件^［36］。下調HIF-1α表達，可以抑制MSU誘導的巨噬細胞炎癥反應^［37］。相反，過表達HIF-1α會導致MSU誘導的巨噬細胞線粒體氧化受損，細胞代謝轉向糖酵解代謝途徑^［38］。本實驗監測了巨噬細胞的葡萄糖攝取和乳酸分泌能力以及細胞內ATP水平，結果顯示，在MSU誘導的巨噬細胞中，乳酸排泄和葡萄糖消耗水平升高，細胞內ATP水平降低；PFS激活了AMPK途徑，抑制HIF-1α過表達，導致有氧糖酵解減少，逆轉了M1巨噬細胞的這種代謝。故PFS可能通過HIF-1α途徑調節細胞的能量代謝，抑制炎性因子的產生。在本實驗中，我們發現PFS能上調p-AMPK、Arg1的表達，下調iNOS、HIF-1α的表達，表明PFS能促進AMPK磷酸化和M2型巨噬細胞極化，減少促炎細胞因子的釋放，增加抗炎細胞因子的表達，進而促進急性痛風性關節炎的炎性反應緩解。在MSU誘導的巨噬細胞被施與AMPK抑制劑后，PFS增加了iNOS水平，降低了Arg1水平等，因此，本實驗研究結果證實PFS可通過AMPK/HIF-1α途徑調節巨噬細胞M1/M2極化以發揮抗炎作用。

綜上所述，PFS通過AMPK/HIF-1α來抑制MSU晶體在體內外誘導的炎性反應，并且促進巨噬細胞從M1促炎表型轉換為M2抗炎表型，減少炎性細胞因子的釋放，增加抗炎細胞因子的釋放，最終緩解小鼠急性痛風性關節炎。以上實驗結果為中醫臨床領域運用PFS治療痛風性關節炎提供了新的理論和實驗依據。

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責任編輯 周仁惠