鑒定轉基因小麥中熒光蛋白的新技術應用研究

摘 要：熒光顯微成像技術由于特異性好、對比度高等優點，被廣泛應用于動物學、神經科學、細胞生物學、分子生物學等研究領域。熒光顯微成像最常用的檢測儀器是熒光顯微鏡和活體熒光成像儀，目前活體熒光成像儀用于植物領域的檢測分析報道較少。本研究以已獲得的含有紅色熒光蛋白標記（DsRed）和綠色熒光蛋白標記（GFP）的小麥種子為材料，通過熒光顯微鏡和活體成像儀觀察及與PCR的對比進行分析，結果表明：利用熒光顯微鏡觀察到的熒光表達范圍主要是根尖及幼芽著生處，可以針對單個樣品精細觀察，但是由于視野所限，難以大批量分析，而活體熒光成像儀可同時觀察的植株數量較多，通量高，觀察GFP和RFP時，都能與野生型明顯的區分開，特異性較好，不會出現背景噪音，且不同于熒光顯微鏡的是RFP的標準值更高，也更明亮。經過PCR鑒定分析，兩種設備均能正確篩選出陽性植株，且結果較為一致。本研究可以為表達熒光蛋白基因植株的鑒別和篩選提供理論依據和技術參考。

關鍵詞：活體成像儀；熒光顯微鏡；小麥；熒光觀察

中圖分類號：S512 文獻標識碼：A 文章編號：0488-5368（2025）01-0004-05

Observation and Identification of Transgenic Wheat Based on Fluorescent Protein Labeling

XUE Xiaodong LI Qinxia

（1. Shangluo University， Shangluo， Shaanxi 726000， China; 2. Collaborative Innovation Center for Resource and Biological Comprehensive Development in Qinba Mountain Area， Hanzhong， Shaanxi 723000， China）

Abstract： Fluorescent microscopic imaging technology is widely used in zoology， neuroscience， cell biology， molecular biology， and other research fields due to its specificity and contrast. The most commonly used detection instruments for fluorescence microscopy imaging are fluorescence microscopy and in vivo imagers， although in vivo imagers have not been extensively reported for plant detection and analysis. This study analyzed the wheat seeds containing red fluorescent markers （DsRed） and green fluorescent markers （GFP） using fluorescence microscopy， in vivo imaging， and PCR comparative observation. The results showed that the fluorescence expression observed with fluorescence microscopy was mainly located at the root tip and young bud growth regions， allowing detailed observation of individual samples. However， due to the limited field of view of the microscope， conducting large-scale analysis was challenging.The in vivo fluorescence imaging instrument could simultaneously observe a large number of plants with high throughput. When observing GFP and RFP， these markers could be clearly distinguished from the wild-type exhibiting high specificity and minimal background noise. Moreover， unlike fluorescence microscopy， the fluorescence intensity of RFP was higher and brighter. After PCR identification and analysis， both devices were able to correctly screen positive plants， and the results were consistent. This study provides theoretical basis and technical support for the identification and screening of transgenic plants.

Key words：Live imaging equipment; Fluorescence microscopes; Wheat; Fluorescence observations

熒光分子成像是通過激發光來激發熒光基團，到達高能量狀態的一種靶向成像技術。常用的有綠色熒光蛋白（GFP）、紅色熒光蛋白（RFP）及其它熒光報告基團。熒光成像具有其獨特的優勢，比如其熒光信號強度高，不需要任何底物或其他輔助因子，只需要有激發光譜到達熒光蛋白或染料，便會釋放出其相應的發射光譜。實際操作中，熒光成像還具有觀察方便、操作簡單、特異性好、標記靶點多樣化等優點^[1]。但是，由于生物體內物質較為復雜，通過激發光的照射，許多物質會產生非特異性熒光，這將對目標樣品的檢測產生干擾，進而影響試驗的準確性。尤其是發光細胞存在于組織內部，探測深度加大時，就需要更高能量的激發，此時便會產生更強的背景噪音^[2]。

目前，用于觀察熒光成像的儀器主要為熒光顯微鏡與活體成像儀。熒光顯微鏡是利用短波光線照射目標細胞或組織，使之激發長波光線（熒光）來觀察顯微結構的光學觀測儀器。現有的熒光顯微鏡將成像分辨率從幾百納米提高至幾納米^[3～7]，實現了生物精細結構與精細動態過程的高分辨體成像[8～13]。熒光顯微鏡由于波長較短，分辨率較高，能夠直接顯示標記的位置和強度，因此在醫學、植物學及遺傳學等領域中具有很高的應用價值，其優勢是其它技術方法難以取代的^[14]，在光學顯微鏡領域中占有極其重要的地位[15～18]。活體成像儀是利用熒光報告基因標記相關的細胞或DNA，通過靈敏度較高的成像檢測系統，可直接觀察和監測動物活體的基因表達，腫瘤的生長、轉移及藥物作用等生物學過程[19，20]，在動物領域應用較多，而植物領域應用較少。該技術具有靈敏度高、檢測快、直觀、易于操作、實驗數據真實可靠等優勢，在醫學研究、生命科學及藥物開發等領域應用廣泛[21，22]。

該研究在前期研究的基礎上，獲得了大量同時含有熒光標記GFP和RFP（DsRed）的陽性株系，并在實驗過程中用常規熒光顯微鏡和活體成像儀進行了幼苗的鑒別篩選。由于尚未見此類篩選方法的對比報道，另外，目前活體成像儀主要用來進行動物觀察研究，而用于植物組織及幼苗的篩選觀察報道較少，因此該研究對兩種熒光篩選儀器的使用方法及效率進行了分析和總結，以便為熒光標記的應用及其鑒定方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的材料為同時含有GFP和RFP（DsRed）熒光標記的轉基因小麥（Fielder），以對應的野生型材料作為對照，進行實驗觀察。保存的種子來自于本實驗室。生長條件為：長日照（18h光照/6h黑暗，溫度20℃）。用于PCR的材料為經過熒光觀察確定為陽性的小麥幼苗，取5～7葉期的葉片單株混樣，CTAB法提取待測樣品的DNA，標記后備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 熒光蛋白GFP或RFP的觀察 用于種子及幼苗觀察的活體成像儀使用的是PerkinElmerzei 的IVIS Lumina III 活體成像系統，根據需要把處理好需要觀察的種子或幼苗放入成像暗箱平臺，調節活體成像系統，使控制平臺升降到一個合適視野，開啟照明燈（明場）拍攝背景圖。然后關閉照明燈，在暗環境下（暗場）拍攝由植株體內發出的特異熒光，并進行保存。熒光顯微鏡使用的是Leica M165 FC，分別調節至對應光源的鏡頭下（GFP或RFP）進行種子或幼苗的觀察。GFP和RFP熒光檢測時，RFP的激發光波長為545 nm（Ex=545 nm），GFP的激發光波長為475 nm（Ex=475 nm）。

1.2.2 陽性苗的PCR驗證 對不同的目的片段進行引物設計，其中紅色熒光蛋白RFP（DsRed）引物擴增長度為741 bp，綠色熒光蛋白GFP引物擴增長度為596 bp。通過活體成像儀或者熒光顯微鏡下觀察，確定有熒光的發芽種子（或干種子），標記為待測陽性樣品。PCR方法：隨機取1.1中樣品的DNA為模板，PCR擴增的Mix為諾唯贊的Green Taq Mix，擴增體系為20 μL，PCR參數設置為35個循環（Denaturation：94℃ 30 s；Annealing：55℃ 45 s；Extension：72℃" 1 min），擴增結果與熒光觀察結果進行對比分析。

2 結果與分析

2.1 熒光顯微鏡觀察GFP和RFP效果

在同一視野下，同時對轉基因和野生型小麥發芽種子進行觀察，選取的模式分別為白光、紅光（RFP）及綠光（GFP），觀察效果見圖1。通過熒光顯微鏡觀察種子時，必須等到種子發芽后才能觀察到熒光，幼芽大于1～2 cm效果最好，干種子觀察不到。熒光視野下，GFP的表現情況一般有4種：①整個種子的身體，以及根部和幼芽均可觀察到明顯的綠色熒光，其中，根的基部、幼芽基部最為明亮；②根尖、幼芽基部，著生幼芽的種子一端最為明亮（圖1c），這種情況比①的熒光范圍要小，可以看作是①情況下保留的最亮部分；③只有整個種子身體有熒光，其他部位沒有；④只有種子身體的部分有熒光，熒光部位在著生幼芽的種子一端。上述四種情況中，前兩種表現是熒光顯微鏡觀察發芽種子時最常見的兩種情況。

熒光顯微鏡視野下，RFP的觀察情況一般有兩種：①紅色熒光主要集中在根尖、幼芽基部及種子著生幼芽的一端；②紅色熒光集中在幼芽的基部，種子身體呈現微弱熒光，其他部位沒有觀察到明顯熒光（圖1b）。在熒光顯微鏡視野下，RFP和GFP非常相似。可見，紅色熒光的表現狀態不如綠色熒光豐富。

2.2 活體成像儀觀察GFP和RFP效果

通過活體成像儀觀察種子時，與熒光顯微鏡不同，種子不需要發芽（培養皿浸泡1～2 d），甚至干種子，也可直接觀察到明顯熒光。觀察視野下，由于其可觀察范圍遠遠大于普通熒光顯微鏡，所以單次通量高，可以同時觀察較多的種子（圖2），也不需要像熒光顯微鏡一樣旋轉鏡頭，只需要在軟件中更改觀察模式（GFP或RFP）就能實現不同熒光視野之間的切換，操作簡便。用于觀察GFP和RFP的情況時，種子的熒光表現情況相似，在同一視野下有四種：①整個種子身體均可觀察到明顯綠色/紅色熒光，尤其是種子著生幼芽的一端（圖2d，9#、13#、15#）。②只有種子身體的部分有熒光，發光部位呈條狀（圖2d，RFP的3#、7#、8#）。③種子身體的部分有熒光，發光部位呈點狀（圖2b，GFP的2#；圖2d，RFP的1#、10#、14#）。通過對比觀察可以發現，活體成像儀用于熒光觀察時，熒光表現出的特異性較好，相較于熒光顯微鏡而言，背景（WT）清楚無干擾。

2.3 PCR驗證篩選陽性植株

隨機選取在活體成像儀或者熒光顯微鏡下觀察過的部分種子（發芽或者干種子），做好標記。待種子發芽并將幼苗移栽后，在5～7葉期提取DNA，針對目的基因序列設計相關引物進行PCR驗證。RFP（DsRed）引物擴增長度為741 bp，GFP引物擴增長度為596 bp，對標記過的幼苗隨機抽取進行PCR擴增鑒定（圖3）。發現有的樣品只含有一條帶（泳道2、3、7），有的含有兩條（泳道1、4、5等）。為了進一步驗證PCR與熒光是否一致，進行了抽樣分析，發現活體成像儀與熒光顯微鏡鑒定后的樣品均與PCR驗證結果一致，也就是能觀察到熒光的，PCR檢測也有相應的條帶，沒有對應熒光的，PCR檢測沒有條帶。證明用活體成像儀與熒光顯微鏡，觀察植物種子或幼苗的熒光表達情況是可行的。

3 討論

3.1 熒光出現背景噪音的處理

近年來，熒光顯微成像技術由于良好的特異性、高的對比度和信噪比，以及熒光成像具有直觀方便、標記位點多樣等性能優勢，被廣泛應用于動、植物學、神經科學等各個研究領域^[23]，在微觀光學研究領域占有重要地位[24～26]。然而，傳統的熒光顯微鏡仍然存在分辨率、成像速度、成像視場的影響，尤其是很多植物體內物質在受到激發光激發后，會產出非特異性熒光，這種熒光對目標樣品的檢測會產生干擾，導致較大的試驗誤差。本研究通過熒光顯微鏡的觀察使用，發現有的野生型（WT）植物幼苗或者種子，會觀察到微弱熒光的情況，尤其是RFP（DsRed）觀察的過程中，更容易出現此類現象，而有的陽性苗有時檢測熒光表現較弱，甚至看不到明顯熒光，即使改換不同儀器再觀察也是同樣的情形，這可能與植物組織內部物質有關，也可能與目標基因的表達量有關，此類現象尚未見報道說明。這就表明用熒光顯微鏡觀察目標樣品的過程中，有時會產生干擾，容易出現假陽性或者假陰性，影響鑒別篩選的效率和準確性。由于這類情況較少，本研究在試驗過程中將野生型直接丟掉，換干凈無干擾的做對照，對轉基因苗只有微弱熒光而難以取舍的，進行再次種植觀察，效果有較大改善，多數可清晰地觀察到相應熒光。

3.2 活體成像儀的優點

活體成像儀能夠直觀地、動態地觀察到動物體綠色/紅色熒光表達情況，常用于活體動物體內目標產物的動態變化過程研究[27～29]，例如小動物體內腫瘤的生長和轉移，以及細胞增殖和擴散活動，甚至可以觀測特定基因的表達、細菌或病毒感染到發病等生物學過程[20，30]，但是在植物研究領域應用的比較少。本研究將活體成像儀應用在植物的種子與剛發芽的幼苗上，該儀器使用過程中，不光是通量高，能同時觀察大量的材料，而且亮度非常高，準確度也較高，完全可以代替普通體視熒光顯微鏡的功能。本試驗發現，活體成像儀觀察GFP和RFP時，都能與野生型明顯的區分開，特異性較好，不會出現背景噪音。GFP觀察效果與熒光顯微鏡觀察效果相似，反而RFP的標準值（color bar）更高，也更明亮。而熒光顯微鏡觀察時，情況正好相反，即：GFP觀察到的熒光通常來說較明亮，容易觀察，熒光亮度要大于RFP，RFP有時會出現陽性苗難以捕捉到熒光的情況，GFP無此情況。說明活體成像儀觀察植物組織的時候，更加的準確、分辨率更高。

4 結論

本研究利用活體成像儀進行了植物的觀察和分析，經過驗證，證明活體成像儀是可以用于植物的研究和篩選的。本文對活體成像儀及熒光顯微鏡的應用做了詳細的對比，進一步通過分子技術的驗證和分析，證明了兩種設備均可用于植物的篩選和研究，且活體成像儀通量高，可同時處理大批量的試驗材料，而熒光顯微鏡更適合于單株或個體局部的精細觀察。

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收稿日期：2024-01-30 修回日期：2024-03-20

基金項目：陜西省教育廳重點科學研究計劃項目（21JY008）；商洛學院科學與技術研究基金項目（20SKY010）。

第一作者簡介：薛曉東（1983-），博士，講師，研究方向為分子生物學及環境微生物學。

通信作者：薛曉東。