‘紅仁’核桃炭疽病病原菌的鑒定和室內藥劑篩選

摘 要：核桃炭疽病對核桃種植危害嚴重，每年會造成很大的產量損失。為確定陜西商洛‘紅仁’核桃炭疽病的主要病原菌，采集典型發病葉片，通過組織分離和純化，結合形態學和分子生物學鑒定得到果生炭疽菌，并通過科赫氏試驗驗證了其為核桃炭疽病的病原菌。為篩選高效的防治藥劑，使用了菌絲生長速率法測試了6種常用殺菌劑對果生炭疽菌的抑菌能力。結果顯示，多菌靈和咯菌腈對菌株的菌絲生長抑制作用較好，EC50分別為0.16 mg/L和0.32 mg/L。在6種供試藥劑中代森錳鋅的抑制效果較差，EC50值為41.67 mg/L，其他藥劑的抑制效果均不錯。在核桃炭疽病發病的不同期間輪換使用多菌靈、甲基硫菌靈、氰烯菌酯、戊唑醇、咯菌腈等殺菌劑，可以有效控制核桃炭疽病。

關鍵詞： 核桃炭疽病；果生炭疽菌；科赫氏實驗；殺菌劑

中圖分類號：S432.1 文獻標識碼：A 文章編號：0488-5368（2025）01-0084-04

Identification of Colletotrichum fructicola Causing Anthracnose in 'Red Kernel' Walnuts and Screening of Indoor Agents

LEI Qiong ， LIN Xin ZHANG Zhiyou3，QU Jianan3，" WANG Wenjun3

（1.Yangling Vocational amp; Technical College， Yangling， Shaanxi 712100， China;2.Center for Returning Farmland to Forestry and Grassland， Shangzhou District Forestry Bureau， Shangluo， Shaanxi 726000， China;3.Shangluo Walnut Research Institute of China， Shangluo， Shaanxi 726099， China）

Abstract：Walnut anthracnose poses a significant threat to walnut cultivation， causing considerable yield losses annually. This study aimed to identify the primary pathogen associated with anthracnose in \"Red Kernel\" walnuts cultivated in Shangluo， Shaanxi. Typical symptomatic leaves were collected and underwent tissue isolation and purification. Morphological and molecular biological analyses identified the pathogen as Colletotrichum fructicola， which was further confirmed through Koch's postulates. To screen for effective fungicides， the mycelial growth rate method was used to evaluate the inhibitory effects of six commonly used fungicides against "C. fructicola. The results demonstrated that carbendazim and fludioxonil exhibited strong inhibitory effects on mycelial growth， with effective concentration for 50% inhibition （EC50） values of 0.16 mg/L and 0.32 mg/L， respectively. Among the six fungicides tested， mancozeb showed the least effective inhibition， with an EC50 value of 41.67 mg/L. The other fungicides also demonstrated satisfactory results. It is recommended to apply fungicides such as carbendazim， thiophanate-methyl， phenamacril， tebuconazole， and fludioxonil in rotation during different stages of walnut anthracnose development for effective disease management.

Key words：Walnut anthracnose; Colletotrichum fructicola; Koch's postulates; Fungicides

核桃（ Juglans regia "L.）屬于核桃科核桃屬，富含亞油酸、油酸、α-亞麻酸等不飽和脂肪酸、蛋白質和維生素，具有很高的營養價值，是我國重要的經濟林木^[1，2]。炭疽病是核桃生產過程中的重要真菌病害，不但會侵染核桃果實也會侵染葉片、芽、花苞和嫩梢等部位，嚴重制約著核桃產業的健康發展^[3]。核桃炭疽病的病原菌主要有膠孢炭疽菌（ Colletotrichum gloeosporioides）^[4，5]、果生刺盤孢菌（Colletotrichum fructicola）^[6]、核桃盤二孢菌（Marssonina juglandis）^[7]、暹羅刺盤孢菌（Colletotrichum siamense）^[8]和尖孢刺盤孢復合種（Colletotrichum acutatum ）^[9]。近年來，陜西渭南地區種植的‘紅仁’核桃炭疽病大面積發生，但是病原種類尚不明確。本研究通過病原菌分離，致病性測定以及病原細菌的表型特征，鑒定了引起陜西省商洛地區‘紅仁’核桃炭疽病的病菌種類，并篩選獲得高效防治藥劑，為核桃炭疽病的田間防控提供支持。

1 材料與方法

1.1 供試樣品的采集以及供試藥劑

本試驗中供試病樣采集于陜西省商洛市商州區板橋鎮袁河村，該村種植的核桃品種為紅仁核桃，樹齡5 a，選取有典型癥狀的核桃葉片采集并拍照。試驗所用的藥劑為本實驗室保存的農藥原藥，分別為戊唑醇、多菌靈、氰烯菌酯、代森錳鋅、甲基硫菌靈、咯菌腈。

1.2 病原菌的分離與純化

將核桃葉片發病處剪下，使用75%的乙醇侵泡30 s進行表面消毒，然后使用無菌水清洗三次后，晾干水分使用無菌鑷子將發病葉片接種至PDA平板上，25 ℃培養5 d，待到PDA平板上長出菌后用無菌牙簽挑取菌落邊緣處接種至新的PDA平板上進行純化，得到純化后的真菌保存備用。

1.3 病原菌分子生物學鑒定

將分離純化出來的病原菌接種至PDA平板上倒置培養5 d，待菌絲長滿平板后使用藥勺刮取菌絲，使用乙醇沉淀粗提DNA的方法提取出真菌DNA，保存至-20 ℃備用。我們分別使用四對鑒定引物，ITS1： TCCGTAGGTGAACCTGCGG/ITS4： TCCTCCGCTTATTGATATGC；ACT-512F： ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC/ACT-783R：TACGAGTCCTTCTGGCCCAT；CL1C：GAATTCAAGGAGGCCTTCTC/CL2C：CTTCTGCATCATGAGCTGGAC；gpd1：CAACGGCTTCGGTCGCATTG/gpd2：GCCAAGCAGTTGGTTGTGC對提取出來的DNA進行PCR擴增^[10]，使用諾唯贊公司的2 × Rapid Taq Master Mix（P222），PCR反應體系為50 μL，擴增條件為95 ℃ 3 min（預變性）；95 ℃ 15 s（變性）；60 ℃ 15 s（退火）；72 ℃ 15 s/kb（延伸），32個循環；72 ℃ 5 min（徹底延伸）。PCR反應結束后使用電泳檢測是否有預期條帶，將有條帶的PCR產物送至上海生工生物工程有限公司進行測序，測序成功后將測序結果使用NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）進行序列比對，并根據比對結果構建進化樹，確定病原菌具體的分類。

1.4 病原菌回接致病力鑒定

將之前保存的病原菌接種至PDA平板上進行活化，在25 ℃培養5 d后準備致病力接種試驗。從田間采集到新鮮健康的‘紅仁’核桃葉片進行表面消毒后將葉片置于鋪有無菌水侵濕的濾紙的方皿中，使用無菌牙簽刺破葉片后將病原菌新鮮菌餅接種至葉片傷口處，每種處理3次重復，封口后將方皿放置在25 ℃培養3 d，觀察葉片發病情況并記錄，然后對發病葉片上的菌再次進行分離，并通過形態學驗證分離的菌是否與接種菌形態學一致。

1.5 病原菌室內藥效試驗

采用菌絲生長速率法進行室內藥效試驗測定。使用含有不同供試藥劑濃度的PDA平板進行接種，以不含藥劑的PDA平板作為空白對照，每個藥劑不同濃度都進行3次重復試驗。活化致病菌后在25 ℃培養箱培養5 d，使用滅菌黃槍頭打孔打出直徑為7 mm的新鮮菌餅，將菌餅接種至不同藥劑不同濃度的平板上，25 ℃培養5 d后使用十字交叉法測定菌落生長直徑，按照（對照菌落直徑-處理病菌直徑）/對照菌落直徑×100，計算不同藥劑的抑制率，并根據抑制率計算不同藥劑的EC50值。

2 結果與分析

2.1 核桃炭疽病田間癥狀

核桃葉片田間發病癥狀主要有：初期發病葉片上的病斑呈單點分布，病斑邊緣呈褐色或黑色，中間呈灰白色；隨著病害發生時間變長病斑變大，后期多個病斑會逐步變大至連片，最后核桃葉片全部壞死，該病害還會侵染核桃果實。

2.2 病原菌鑒定

將田間采回的病葉進行病原菌的分離與純化，形態特征觀察發現，供試菌株在PDA培養基上菌落生長近圓形，前期菌絲為白色，邊緣整齊，后期菌絲由白色變為黑色，通過PDA平板上生長的病原菌的形態特征，初步鑒定核桃葉片炭疽病的病原菌屬于炭疽菌（圖1A和圖1B）。為了進一步明確分離出的病原菌的種類，提取純化后的病原菌DNA后，然后使用四對引物進行PCR擴增，將擴增得到的片段進行測序。通過多基因位點序列串聯構建系統發育樹，結果顯示該菌與果生炭疽菌（ Colletotrichum fructicola CMTJ18）聚在同一分支（圖2C）。因此，結合形態學和分子生物學將該病原菌鑒定為果生炭疽菌。

2.3 病原菌致病力測試

按照科赫氏法則采用當地同品種核桃葉片對分離純化出來的果生炭疽菌病菌進行回接實驗。將果生炭疽菌在PDA平板上培養7 d后，用滅菌黃槍頭對其進行打孔，將菌餅接種在健康的核桃葉片上，同時接種一個無菌PDA菌餅于健康核桃葉片上作為對照。將接種葉片放置在用無菌水打濕無菌濾紙片上，放入無菌方皿中，置于25 ℃恒溫培養箱培養5 d，重復3次，并拍照記錄試驗數據。結果顯示，接種3 d后開始發病類似田間發病葉片小病斑，接種5 d后發病最為明顯，且發病癥狀與標本采集時的癥狀一致，對照葉片無明顯癥狀（圖2A）。從病斑部位再次進行分離純化后所得菌株與接種菌株一致（圖2B），因此驗證表明，引起商洛市‘紅仁’核桃炭疽病的病原菌為果生炭疽菌。

2.4 不同殺菌劑對果生炭疽病菌的室內毒力測定

使用菌絲生長速率法測定6種殺菌劑對果生炭疽菌的抑制作用，結果見表1所示，6種供試藥劑對果生炭疽菌均表現出抑制效果，但是不同的藥劑抑制結果有差異。其中多菌靈和咯菌腈的抑制結果較好，EC50分別為0.16 mg/L和0.32 mg/L。其次為戊唑醇、氰烯菌酯、甲基硫菌靈以及代森錳鋅，EC50分別為1.57 mg/L、4.92 mg/L、5.79 mg/L、41.67 mg/L。

3 討論

一般殺菌劑作用于病原菌主要功能是抑制病原菌菌絲生長，分生孢子的萌發以及芽管的形成^[10]。本試驗中用到咪唑類藥劑的多菌靈以及甲基硫菌靈是通過干擾病菌菌絲體的形成，抑制孢子的萌發，阻礙細胞分裂實現殺菌效果[11，12]。代森錳鋅可以利用要集中的錳離子和鋅離子對病原菌的細胞壁以及細胞膜進行破壞從而到達抑菌效果，此外過量的錳和鋅離子可以抑制病原菌的生長^[13]。戊唑醇的殺菌原理主要是通過抑制微生物的DNA或RNA的復制和合成，從而破壞細胞的代謝過程和生命活動，導致微生物死亡^[14]。氰烯菌酯可以抑制馬達蛋白的肌球蛋白-5^[15]。咯菌腈是一種非內吸性殺菌劑，其作用機理是通過抑制病原菌的菌絲生長和孢子萌發來達到殺菌的效果。具體來說，咯菌腈能夠抑制病原菌細胞膜的合成，從而破壞細胞膜的結構和功能，導致病原菌死亡^[14]。

近幾年來陜西地區的核桃種植面積逐年擴大，伴隨著種植面積的擴大核桃的病蟲害發生也日益加重，目前關于陜西地區核桃炭疽病病原菌的分離以及藥劑防治的相關研究較少。本研究從田間核桃病葉中分離出病原菌果生炭疽菌，并測定了六種殺菌劑的抑菌效果，其中多菌靈對病原菌的毒力最強，戊唑醇，咯菌腈，甲基硫菌靈，氰烯菌酯對果生炭疽菌也有著不錯的毒力，代森錳鋅是六個殺菌劑中毒力最低的。以上結果表明，多菌靈、戊唑醇、咯菌腈、甲基硫菌靈、氰烯菌酯均可有效抑制引起陜西地區核桃炭疽病的果生炭疽菌的菌絲生長。為了預防病原菌抗藥性的產生，建議在田間核桃發病期間使用多菌靈、戊唑醇、咯菌腈、甲基硫菌靈、氰烯菌酯進行輪換用藥防治。

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收稿日期：2024-06-19 修回日期：2024-08-01

基金項目：陜西林業科技創新重點專項（SXLK2022-02-10）;楊凌職業技術學院院內基金項目（ZK 22-48）。

第一作者簡介：雷瓊（1977-）， 女， 副教授，主要從事安全農產品保護研究。

通信作者：雷 瓊。