基于Nrf2/GPX4介導的鐵死亡探討異葒草素對非小細胞肺癌細胞增殖和凋亡的影響

〔摘要〕 目的 基于核因子E2相關因子2（Nrf2）/谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）信號通路，探究異葒草素（ISO）對非小細胞肺癌（NSCLC）細胞惡性生物學表型的影響。方法 以人NSCLC細胞HCC827為研究對象，實驗分為對照組、異葒草素+oe-NC組、異葒草素+oe-Nrf2組、oe-Nrf2組、oe-NC組。MTT檢測細胞活力，Edu實驗檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞凋亡及脂質過氧化水平，試劑盒檢測細胞中丙二醛（MDA）、鐵、還原型谷胱甘肽（GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG）水平，Western blot檢測細胞中Nrf2（細胞核）、GPX4、前列腺素過氧化物合酶2（PTGS2）及溶質載體家族7成員11（SLC7A11）蛋白的表達水平，免疫熒光實驗檢測Nrf2核轉位情況。結果 相對于oe-NC組，異葒草素+oe-NC組Edu陽性細胞數減少（Plt;0.05），細胞凋亡率增加（Plt;0.05），細胞中的脂質過氧化、MDA、鐵水平升高（Plt;0.05），細胞中的GSH/GSSG水平降低（Plt;0.05），細胞中的Nrf2（細胞核）、GPX4、SLC7A11蛋白的表達下調（Plt;0.05），PTGS2蛋白的表達上調（Plt;0.05），Nrf2核轉位減少；相對于異草紅素+oe-NC組，異草紅素+oe-Nrf2組Edu陽性細胞數增加（Plt;0.05），細胞凋亡率降低（Plt;0.05），細胞中的脂質過氧化、MDA、鐵水平降低（Plt;0.05），細胞中的GSH/GSSG水平升高（Plt;0.05），細胞中的Nrf2（細胞核）、GPX4、SLC7A11蛋白的表達水平上調（Plt;0.05），PTGS2蛋白的表達水平下調（Plt;0.05），Nrf2核轉位增加。結論 ISO能夠抑制非小細胞肺癌細胞的增殖，并促進其凋亡，所涉及機制可能與抑制Nrf2/GPX4信號通路來誘導鐵死亡有關。

〔關鍵詞〕 非小細胞肺癌；異葒草素；Nrf2/GPX4；鐵死亡；增殖；凋亡

〔中圖分類號〕R285.5" nbsp; " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０25.03.008

Effects of isoorientin on proliferation and apoptosis of non-small cell lung cancer cells based on Nrf2/GPX4-mediated ferroptosis

JIANG Xiaohong1， KU Xiong2， WEI Congbing1*

1. Hospital of China University of Geosciences （Wuhan）， Wuhan， Hubei 430070， China; 2. Wuhan University of Science and Technology， Wuhan， Hubei 430070， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of isoorientin （ISO） on the malignant biological phenotypes of non-small cell lung cancer （NSCLC） cells based on the nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）/glutathione peroxidase 4 （GPX4） signaling pathway. Methods Human NSCLC cells HCC827 were used as the research object. Control group， ISO+oe-NC group， ISO+oe-Nrf2 group， oe-Nrf2 group， and oe-NC group were divided in the experiment. Cell viability was measured by MTT assay， cell proliferation was checked by Edu assay， cell apoptosis and lipid peroxidation levels were identified by flow cytometry， levels of malondialdehyde （MDA）， iron， reduced glutathione （GSH）/oxidized glutathione （GSSG） in cells were measured by kits， expression levels of Nrf2 （nuclear）， GPX4， prostaglandin-endoperoxide synthase 2 （PTGS2）， and solute carrier family 7 member 11 （SLC7A11） proteins in cells were measured by Western blot， and Nrf2 nuclear translocation was examined by immunofluorescence assay. Results Compared with the oe-NC group， the isoorientin+oe-NC group had significantly decreased number of Edu-positive cells （Plt;0.05）， significantly higher apoptosis rate （Plt;0.05）， the significantly higher levels of lipid peroxidation， MDA， and iron in cells （Plt;0.05）， the significantly lower GSH/GSSG level in cells （Plt;0.05）， the significantly reduced expression of Nrf2 （nuclear）， GPX4， and SLC7A11 proteins in cells （Plt;0.05）， the significantly up-regulated PTGS2 protein expression level （Plt;0.05）， and reduced Nrf2 nuclear translocation; compared with the ISO+oe-NC group， the ISO+oe-Nrf2 group showed significantly increased Edu positive cells （Plt;0.05）， the significantly decreased apoptosis rate （Plt;0.05）， the significantly decreased levels of lipid peroxidation， MDA， and iron in cells （Plt;0.05）， the significantly increased GSH/GSSG level in cells （Plt;0.05）， the significantly up-regulated expression of Nrf2 （nuclear）， GPX4， and SLC7A11 proteins in cells （Plt;0.05）， the significantly down-regulated expression of PTGS2 protein （Plt;0.05）， and increased Nrf2 nuclear translocation. Conclusion ISO can inhibit the proliferation of NSCLC cells and promote their apoptosis， and the mechanism involved may be related to the induction of ferroptosis by inhibiting the Nrf2/GPX4 signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 non-small cell lung cancer; isoorientin; Nrf2/GPX4; ferroptosis; proliferation; apoptosis

肺癌是最常見的癌癥之一，也是全球癌癥相關死亡的主要原因，根據GLOBOCAN的數據，2022年全球肺癌新發病例近250萬，死亡人數近180萬[1]。肺癌分為兩大組織學亞型：小細胞肺癌和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC），其中NSCLC約占所有病例的85%[2]。作為肺癌的主要組織學亞型，NSCLC對人類健康構成了重大威脅。目前，NSCLC的主要治療方案包括手術切除、放療、化療、免疫治療和分子靶向治療，然而，這些方法尚無法完全滿足患者的生存預期[3]。異葒草素（isoorientin，ISO）為來源于決明子、夏枯草等中藥的天然黃酮類化合物，現代藥理學研究表明其具有抗腫瘤、抑炎、鎮痛等功效[4]。大量研究已證實，ISO對腫瘤有較好的抑制作用。XU等[5]研究發現，ISO能夠誘導人肺癌細胞A549發生凋亡及細胞周期阻滯。FENG等[6]研究發現，ISO能通過調控核因子E2相關因子2（nuclear factor-erythrocyte 2-related factor 2， Nrf2）/谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）信號通路促進鐵死亡，從而逆轉肺癌耐藥性。KIM等[7]研究發現，ISO能通過抑制CXC趨化因子受體4的表達來抑制乳腺癌和結腸癌細胞的侵襲。然而，ISO抑制NSCLC進展的分子機制尚未完全闡明。

鐵死亡是一種鐵依賴性進程性細胞死亡，是一種與許多代謝途徑緊密相關的新型腫瘤抑制機制[8]。研究表明，通過誘導肺癌細胞鐵死亡，能逆轉肺癌化療耐藥，抑制肺癌的惡性表型[9]。Nrf2是調節細胞氧化還原平衡和炎癥相關基因表達的主要轉錄因子[10]。GPX4在鐵死亡通路中起著至關重要的作用，GPX4失活是鐵死亡的關鍵特征之一[11]。相關研究發現，通過調控Nrf2/GPX4信號通路可以誘導NSCLC細胞發生鐵死亡[12]。然而，ISO是否能夠通過調控Nrf2/GPX4信號通路介導的鐵死亡影響NSCLC惡性表型尚未可知。因此，本研究通過引入Nrf2過表達載體（over expression Nrf2， oe Nrf2），探究ISO是否能夠通過調控Nrf2/GPX4信號通路調控鐵死亡而抑制NSCLC細胞的惡性表型。

1 材料與方法

1.1" 藥物及試劑

ISO（上海源葉生物有限公司，批號：4261-42-1）；脂質體lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司，批號：11668019）；oe Nrf2及其過表達載體陰性對照（over expression NC， oe NC）（上海吉瑪公司）；MTT試劑（批號：C0009S）、Edu細胞增殖試劑盒（批號：ST067）、丙二醛（malonatdehyde， MDA）測定試劑盒（批號：S0131S）均購自上海碧云天公司；GSH/GSSG測定試劑盒（批號：ab138881）、鐵測定試劑盒（批號：ab83366）、Nrf2抗體（批號：ab62352）、GPX4抗體（批號：ab125066）、前列腺素過氧化物合酶2（prostaglandin peroxide synthase 2， PTGS2）抗體（批號：ab179800）、溶質載體家族7成員11（solute carrier family 7 members11， SLC7A11）抗體（批號：ab307602）均購自美國Abcam公司。倒置熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss AG公司，型號：XSP-2CA）；流式細胞儀（美國FC500-MCL公司，型號：CytoFLEX S）；電泳及轉膜裝置（美國Bio-Rad公司，型號：DYY-60）。

1.2" 細胞培養

人NSCLC細胞HCC827購自上海鈺博生物科技有限公司，貨號：CL-0094，培養于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的培養基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱。

1.3" 細胞處理及轉染

細胞轉染：按照說明書利用脂質體lipofectamine 2000將oe NC、oe Nrf2、轉染至HCC827細胞中[13]，轉染后24 h進行轉染效率驗證或ISO給藥處理。ISO處理：將ISO加入HCC827細胞中孵育24 h后收集細胞進行分子生物學實驗測定。

1.4" 檢測指標

1.4.1" MTT實驗" 參照既往研究，用10、20、40、80、120、160、200 μmol/L梯度濃度的ISO處理HCC827細胞[14-15]。取對數生長期的HCC827細胞接種于96孔板中，每組3個復孔，培養24 h，更換為含1% FBS的培養基同步化細胞24 h，隨后進行細胞轉染及給藥處理，結束后每孔加入100 μL MTT溶液孵育4 h，棄去MTT溶液，避光加入DMSO溶液搖床上孵育10 min，于酶標儀中測量每孔在490 nm處的吸光度值。

1.4.2" Edu染色實驗" 取對數生長期的HCC827細胞接種于12孔板中，每組3個復孔，細胞轉染及給藥處理后按照Edu細胞增殖試劑盒說明書進行操作，最后用倒置熒光顯微鏡拍照并記錄。

1.4.3" 流式細胞術" 檢測細胞凋亡：取各組HCC827細胞，將10 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL碘化丙啶加入200 μL含有1×106個細胞的PBS溶液中，在4 ℃的暗室中作用30 min，上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況，依據公式“細胞凋亡率=凋亡細胞/總細胞×100%”計算細胞凋亡率（流式細胞分析圖右上區為晚期凋亡細胞，右下區為早期凋亡細胞）。

檢測脂質過氧化水平：HCC827細胞用10 μmol/L 的BODIPY 581/591 C11探針處理30 min，細胞用流式細胞術進行分析。

1.4.4" 細胞內鐵水平及MDA、GSH/GSSG含量的測定" 按鐵測定試劑盒說明書，將相關試劑加入細胞中，采用酶標儀在波長593 nm處測定吸光度值。收集并裂解細胞，按照MDA測定試劑盒及GSH/GSSG測定試劑盒測定細胞裂解液中MDA、GSH/GSSG含量。

1.4.5" 免疫熒光染色實驗" 將處于對數生長期的HCC827細胞接種于24孔板中（含細胞爬片），將細胞爬片放于24孔板中，4%多聚甲醛固定10 min，0.5% TritonX-100滲透，5% BSA室溫封閉，Nrf2一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，DAPI染細胞核，熒光顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.4.6" Western blot實驗" 用細胞質細胞核蛋白提取試劑盒提取細胞核蛋白，用RAPI組織裂解液提取細胞總蛋白，BCA法定量蛋白濃度。樣品蛋白加等體積的變性液，煮沸10 min。加樣、電泳、轉膜、封閉2 h、一抗孵育過夜、二抗孵育1 h、顯影。用Image J軟件分析目標條帶灰度值，以GAPDH或Lamin B為內參，根據灰度值半定量目標蛋白的表達水平。目標蛋白表達水平=目標蛋白條帶灰度值/GAPDH或Lamin B蛋白條帶灰度值。

1.5" 統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據處理，計量資料以“ｘ±s”表示，多組間比較采用One-Way ANOVA分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。均以Plt;0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1" ISO作用于肺癌細胞濃度的篩選

由MTT實驗可知，ISO作用于HCC827細胞的IC50濃度為101.1 μmol/L，因此，本研究選取100 μmol/L的ISO進行后續實驗。詳見圖1。

2.2" Nrf2過表達逆轉ISO誘導的鐵死亡

相對于對照組，oe-NC組HCC827細胞中Nrf2（細胞核）、GPX4、PTGS2、SLC7A11蛋白表達水平比較差異無統計學意義（Pgt;0.05）；相對于oe-NC組，oe-Nrf2組HCC827細胞中Nrf2（細胞核）、GPX4、SLC7A11蛋白表達水平上調（Plt;0.05），PTGS2蛋白表達水平下調（Plt;0.05），異葒草素+oe-NC組HCC827細胞中Nrf2（細胞核）、GPX4、SLC7A11蛋白表達水平下調（Plt;0.05），PTGS2蛋白表達水平上調（Plt;0.05）；相對于異葒草素+oe-NC組，異葒草素+oe-Nrf2組HCC827細胞中Nrf2（細胞核）、GPX4、SLC7A11蛋白表達水平上調（Plt;0.05），PTGS2蛋白表達水平下調（Plt;0.05）。詳見圖2及表1。

相對于對照組，oe-NC組HCC827細胞中脂質過氧化、MDA、鐵、GSH/GSSG水平比較差異無統計學意義（Pgt;0.05）；相對于oe-NC組，oe-Nrf2組HCC827細胞中脂質過氧化、MDA、鐵水平降低（Plt;0.05），GSH/GSSG水平升高（Plt;0.05），異葒草素+oe-NC組HCC827細胞中脂質過氧化、MDA、鐵水平升高（Plt;0.05），GSH/GSSG水平降低（Plt;0.05）；相對于異葒草素+oe-NC組，異葒草素+oe-Nrf2組HCC827細胞中脂質過氧化、MDA、鐵水平降低（Plt;0.05），GSH/GSSG水平升高（Plt;0.05）。詳見表2。

2.3" Nrf2過表達逆轉ISO對Nrf2核轉位的影響

相對于對照組，oe-NC組HCC827細胞Nrf2熒光強度無變化；相對于oe-NC組，oe-Nrf2組HCC827細胞Nrf2熒光強度增強，而異葒草素+oe-NC組HCC827細胞Nrf2熒光強度減弱；相對于異葒草素+oe-NC組，異葒草素+oe-Nrf2組HCC827細胞Nrf2熒光強度增強。詳見圖3。

2.4" Nrf2過表達逆轉ISO對細胞增殖的影響

相對于對照組，oe-NC組HCC827細胞的Edu陽性細胞數比較差異無統計學意義（Pgt;0.05）；相對于oe-NC組，oe-Nrf2組HCC827細胞的Edu陽性細胞數顯著增加（Plt;0.05），異葒草素+oe-NC組的Edu陽性細胞數顯著減少（Plt;0.05）；相對于異葒草素+oe-NC組，異葒草素+oe-Nrf2組HCC827細胞的Edu陽性細胞數顯著增加（Plt;0.05）。詳見表3及圖4。

2.5" Nrf2過表達逆轉ISO對細胞凋亡的影響

相對于對照組，oe-NC組HCC827細胞的凋亡率比較差異無統計學意義（Pgt;0.05）；相對于oe-NC組，oe-Nrf2組HCC827細胞的凋亡率顯著降低（Plt;0.05），而異葒草素+oe-NC組細胞的凋亡率顯著升高（Plt;0.05）；相對于異葒草素+oe-NC組，異葒草素+oe-Nrf2組HCC827細胞的凋亡率顯著降低（Plt;0.05）。詳見表4及圖5。

3 討論

NSCLC包括肺腺癌、肺鱗狀細胞癌和大細胞癌，由于其易復發和易轉移的特點，NSCLC患者的預后并不理想[16]。ISO屬于天然的黃酮類物質，廣泛存在于藜麥、蓮子、葛根等植物中，具有抗癌、抗炎、止痛等藥理作用[17]。目前，相關研究已發現ISO能夠通過促進肺癌細胞凋亡及細胞周期阻滯，并抑制其遷移而發揮抗癌作用[5，18]。然而，ISO治療肺癌的報道較少，其作用效果及分子機制仍需進一步探究。首先，本研究通過MTT實驗發現ISO對NSCLC細胞有較高的細胞毒性，其作用于HCC827細胞的IC50濃度為101.1 μmol/L。其次，本研究發現，ISO能夠顯著抑制NSCLC細胞的增殖并促進其凋亡，表明ISO能有效抑制NSCLC細胞的惡性表型。上述研究提示，ISO可能對NSCLC有良好的抗腫瘤作用。

鐵死亡是一種獨特的程序性細胞死亡類型，于2012年被首次記錄，由細胞內鐵超載引起的ROS和脂質過氧化所驅動[19]。研究表明，通過促進鐵死亡可以抑制非小細胞肺癌病理進程。OUYANG等[20]研究發現，苦參-蒲公英湯通過誘導鐵死亡和調節腫瘤免疫微環境抑制NSCLC。XU等[21]研究發現，CircPOLA2使非小細胞肺癌細胞對鐵死亡敏感，并通過Merlin-YAP信號通路抑制腫瘤發生。LIN等[22]研究發現，富硒多金屬氧酸鹽通過誘導NSCLC鐵死亡和凋亡發揮抗腫瘤效應。脂質構成質膜和線粒體膜的主要成分，脂質過氧化是鐵死亡的關鍵因素[23]。MDA是膜脂過氧化反應的產物，是氧化應激的重要指標之一[24]。此外，GSH和GSSG的比值經常被用來確定氧化還原狀態，為評估氧化應激的重要指標[25]。PTGS2能促進氧化應激狀態，從而增強鐵死亡[26]。SLC7A11是一種跨膜胱氨酸谷氨酸轉運蛋白，在鐵死亡中起中心負調節作用，臨床數據顯示，SLC7A11在各種類型的人類癌癥中過表達，SLC7A11水平越高，患者的總生存率越低[27]。本研究發現，ISO能夠促進非小細胞肺癌細胞中脂質過氧化、MDA、鐵、PTGS2的水平，抑制GSH/GSSG、SLC7A11水平，表明ISO能夠促進NSCLC細胞的鐵死亡。

Nrf2作為一種轉錄因子，能從細胞質轉位到細胞核調控幾乎所有與鐵死亡相關基因的轉錄，包括GPX4和SLC7A11[28]。相關研究報道，ISO能夠通過調控Nrf2信號影響疾病進展。TAN等[29]研究發現，ISO可通過調節Nrf2/HO-1信號通路抑制脂多糖誘導的小膠質細胞活化，發揮神經保護作用；CAO等[30]研究發現，ISO通過上調OPG分子和調控Nrf2/ARE信號通路，改善絕經后大鼠的骨質疏松癥。此外，通過調控Nrf2/GPX4信號通路能影響癌癥病理進展。袁育珺等[31]研究發現，中藥靛玉紅衍生物E804可能通過抑制Nrf2/GPX4信號通路，抑制非小細胞肺癌的增殖及遷移，并促進其凋亡。胡玲等[32]研究發現，熊果酸能夠通過抑制Nrf2/GPX4信號通路，誘導肝癌細胞發生鐵死亡。首先，本研究發現ISO能夠顯著抑制非小細胞肺癌細胞中Nrf2（細胞核）、GPX4的表達及Nrf2核轉位，表明ISO能夠抑制非小細胞肺癌細胞中的Nrf2/GPX4信號通路。其次，本研究引入了Nrf2過表達載體（oe Nrf2），發現過表達Nrf2能夠顯著逆轉ISO對非小細胞肺癌細胞中Nrf2/GPX4信號通路、鐵死亡相關指標及增殖、凋亡的影響，表明ISO能夠通過抑制Nrf2/GPX4信號通路促進鐵死亡而抑制非小細胞肺癌細胞的惡性表型。

綜上所述，ISO能夠抑制非小細胞肺癌細胞的增殖，并促進其凋亡，所涉及機制可能與抑制Nrf2/GPX4信號通路來誘導鐵死亡有關。

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