外源鈣及鈣離子抑制劑對低溫條件下冬油菜種子萌發及相關基因表達的影響

摘 要 為探明低溫條件下外源鈣離子對冬油菜種子萌發的影響，以及受鈣離子調控的與低溫響應相關基因的表達情況，本研究以冬油菜為試驗材料，研究了4" ℃低溫脅迫下外源Ca2+（CaCl2）及鈣調蛋白抑制劑（W-7）對不同抗寒性冬油菜種子萌發特性的影響；篩選適宜的處理濃度進行外源噴施，研究調控Ca2+轉運及低溫響應相關基因的表達模式，初步探究了Ca2+參與冬油菜抗寒性機理。研究結果表明，Ca2+能夠緩解低溫對冬油菜種子萌發的影響，與低溫脅迫相比較，添加外源Ca2+能顯著提高種子的發芽勢、發芽率、下胚軸及胚根長度，其中20 mmol/L CaCl2處理對種子萌發的緩解作用最大；與低溫處理相比，添加鈣調蛋白抑制劑（W-7）使種子的發芽勢、發芽率明顯降低，下胚軸與胚根長度降低，其中1.0 mmol/L W-7對種子萌發抑制作用最大。低溫脅迫后，基因CRLK1、 MEKK1、 MPK3、 MPK6在白菜型冬油菜中上調表達幅度較大，而MKK5、CBF1和CBF3在甘藍型冬油菜中上調表達較大，外源CaCl2處理后所有基因在不同品種中的表達量均有不同程度的增加，而噴施W-7后，8個基因在所有品種中的表達量均受到抑制。

關鍵詞 白菜型油菜；甘藍型油菜；外源鈣；鈣離子抑制劑；低溫；種子萌發; 相關基因

鈣離子作為植物細胞內重要的第二信使，可以參與多種信號的應答[1]。許多逆境脅迫反應能使細胞內Ca2+濃度提高，然后通過鈣結合蛋白如鈣調蛋白（CAM）、鈣依賴性蛋白激酶（CDPK）以及鈣調磷酸酶B類似蛋白（CBL）等將信號向下游轉導并放大[2]。在許多逆境響應過程中，鈣信號可以將其他信號整合在一個共同的水平，通過對環境變化做響應來協調不同環境與生長發育的關系，保證植物適應不同的環境條件[3]。低溫是影響作物產量的一個重要因素，在農業生產中常常造成作物減產[4-6]。研究發現，用不同濃度的CaCl2處理亞麻種子后，可以顯著提高亞麻種子的萌發能力[7]。呂亞慈[8]研究發現，Ca2+可以使藜麥細胞的通透性增大，進而提高種子的萌發力。李小白[9]研究發現，CaCl2可以提高干旱脅迫下谷子的發芽勢和發芽率，代勛等[10]研究發現，CaCl2可以提高干旱脅迫下干小桐種子的萌發能力，任永霞等[11]發現，CaCl2可以促進干旱脅迫下苜蓿種子的萌發。在鹽脅迫下Ca2+的緩解作用因濃度而異，濃度過低或過高都會使緩解鹽脅迫的作用不明顯[12]。鈣調結合蛋白抑制劑，如：" W-7 HCl，可以阻止Ca2+與CaM的結合進而影響種子的發芽率[13]

植物可以通過激活各種防御機制來改變其生理代謝，進而持續感知和接收溫度信號，維持其生命活動。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯反應是一個在真核生物中高度保守的信號通路，主要作為下游信號將細胞外信號傳遞到細胞內[14]。據報道植物MAPK級聯途徑在溫度信號的感知和轉導過程中發揮著重要作用；例如，類受體激酶CRLK1可以通過激活由MEKK1介導的MAPK途徑（MEKK1-MKK2-MPK4/6），來增強植物的耐冷性[15]。擬南芥中，MKK4/5可以激活MPK3/6，進而磷酸化下游ICE1并破壞其穩定性，降低植株對低溫的耐受性[16-17]。

本試驗選用抗寒性不同的冬油菜品種，在" 4" ℃低溫處理下噴施不同濃度的CaCl2和W-7溶液，研究其對發芽勢、發芽率、下胚軸及胚根長度的影響，篩選適宜的外源施用濃度；利用篩選的濃度，研究4" ℃低溫處理下外源噴施CaCl2和W-7后與鈣轉運及鈣調控相關基因的表達模式，初步探討Ca2+參與冬油菜抗寒性的作用機理，為進一步研究強冬性冬油菜抗寒性機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白菜型和甘藍型冬油菜品種共12份，其中白菜型冬油菜品種6份，甘藍型冬油菜品種6份，材料如表1所示。

1.2 濃度篩選試驗

1.2.1 試驗設計 參考已發表的研究成果[8-11]，本試驗共設計4個處理，如表2所示。

1.2.2 試驗方法 取成熟、飽滿且大小均勻一致的健康種子，用1%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min，后用無菌水沖洗3次，進行發芽試驗。

標準發芽試驗：將消毒后的種子置于鋪有2層濾紙，直徑為90 mm的培養皿內，每皿30粒種子，加入培養液8 mL，對照和低溫脅迫處理只加1/2 Hoagland營養液，CaCl2處理組加入不同濃度的CaCl2溶液和1/2 Hoagland營養液，抑制劑處理組加入不同濃度的W-7溶液和1/2 Hoagland營養液。

處理期間，將對照組和試驗組分別置于24" ℃和4" ℃恒溫培養箱中，光照條件設為16 h光照和8 h黑暗。共培養10 d，第3天測定發芽勢（GE），第7天測定發芽率（GP）[18]，10 d后測定下胚軸長和胚根長。

1.3 外源噴施試驗

1.3.1 試驗設計 試驗共設4個處理，分別為CK（常溫）、低溫4" ℃、4" ℃+20 mmol/L CaCl2和4" ℃+1 mmol/L W-7，每個處理重復3次，分別于處理后1 h、3 h、6 h、12 h以及24 h采集葉片相同部位，用蒸餾水清洗干凈，用濾紙吸干水份后，立即用液氮冷凍并做好標記，保存于-80" ℃冰箱中。

1.3.2 試驗方法 試驗材料種植在甘肅農業大學伏羲堂。每個品種12盆，每盆4株幼苗，幼苗生長至5～6葉期時進行相應的處理。

總RNA的提取按照提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）說明書進行；隨后用DeNovix DS-11（美國丹諾爾公司）測定濃度和純度；反轉錄按照反轉錄試劑盒說明書進行，得到cDNA，并在-20" ℃冰箱中保存，備用[19]。

用反轉錄得到的cDNA為模板，Actin為內參基因，設計特異性引物并合成，進行實時熒光定量PCR（qPCR）擴增。采用2步法設定程序，40個循環，重復3次。5個濃度梯度，繪制標準曲線，根據 E=10-1/標準曲線斜率-1 計算基因的擴增效率，修正 2-△△Ct為（1+E）-△△Ct計算相對定量結果[20]。

篩選出MAPK級聯途徑中的8個調控且響應低溫的基因，白菜型冬油菜參考‘隴油7號’基因組（http：//brassicadb.cn/），甘藍型冬油菜參考‘中雙11號’基因組（http：//cbi.hzau.edu.cn/bnapus/）設計引物（表3）。

1.4 數據分析

采用Excel 2016處理試驗數據，圖表主要采用Origin 2021制作完成，顯著性分析采用SPSS 22.0完成。

2 結果與分析

2.1 發芽試驗篩選濃度

2.1.1 低溫對種子萌發特性的影響 與CK相比，4" ℃處理后，各品種的發芽勢與發芽率均有所下降，同時各品種的下胚軸長及胚根長都變小，可見，低溫處理對冬油菜種子萌發的抑制作用很大。綜合比較相對發芽勢、相對發芽率、相對下胚軸長及相對肧根長，發現其中白菜型冬油菜‘隴油" 6號’‘隴油8號’和甘藍型冬油菜‘GAU-30’‘隴油88號’受低溫影響最小，表現較強的耐受性" （表4）。

2.1.2 低溫條件下CaCl2對冬油菜種子萌發特性的影響 不同濃度CaCl2對冬油菜種子萌發能力的影響如表5所示，低溫條件下，適宜濃度的CaCl2能夠促進冬油菜種子的萌發。隨著CaCl2處理濃度的增加，各品種的發芽勢和發芽率均是先升高后降低，當濃度為5 mmol/L時，各品種的發芽勢、發芽率有小幅的升高，隨后降低，濃度為20 mmol/L時再次升高。綜合所有品種的發芽勢、發芽率可以得出，當CaCl2濃度為20 mmol/L時，對冬油菜種子萌發的促進作用最大。

此外，CaCl2處理后能促進種子下胚軸與胚根的生長，當CaCl2濃度分別為5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L和20 mmol/L時，所有品種的下胚軸長分別在0.2～0.6 cm、0.32～0.5 cm、0.32～0.56 cm及0.47～1.8 cm之間，而胚根長分別在0.3～2.38 cm、" 0.32～2.2 cm、" 0.32～2.2 cm、0.86～2.04 cm以及0.97～2.53 cm之間。當CaCl2濃度為5 mmol/L時，GAU-30的下胚軸和胚根最長；當濃度為10 mmol/L時，下胚軸最長的是17-2251，胚根最長的是‘隴油88號’；當濃度為15 mmol/L時，下胚軸最長的是‘16-2444’，胚根最長的為‘天油7號’；當濃度為20 mmol/L時，下胚軸最長的為‘天油14號’，胚根最長的為‘16-2444’和‘17-2251’。分析試驗結果可以得出，CaCl2處理對甘藍型油菜下胚軸長和胚根長的促進效果更明顯。

2.1.3 低溫條件下W-7對冬油菜種子萌發特性的影響

不同濃度W-7對冬油菜種子萌發能力的影響如表6所示，當W-7濃度為0.5 mmol/L時，與低溫處理相比，各品種的發芽勢、發芽率大幅度降低（表4、表6）?？梢?，W-7可以明顯抑制種子的萌發和生長。隨著處理濃度的增加，各品種的發芽勢和發芽率均是先升高后降低，當濃度為1 mmol/L時，各品種的發芽勢、發芽率有小幅的升高，隨后降低。由此可以看出，當W-7濃度為" 1 mmol/L時對種子萌發的抑制作用最大。

W-7的抑制作用不僅表現在種子的萌發上，而且對種子萌發后下胚軸和胚根的生長也有抑制作用。當W-7濃度為0.5 mmol/L時，所有品種的下胚軸長在0.2～0.5 cm之間，胚根長在" 0.26～1 cm之間；當濃度為1 mmol/L時，下胚軸長在0.15～0.46 cm之間，胚根長在0.1～" 0.48 cm之間；當濃度為1.5 mmol/L時，下胚軸長度在0.22～0.44 cm之間；胚根長為0.1 cm。當濃度為2 mmol/L時，下胚軸長度在0.18～" 0.36 cm之間，胚根長在0.1～0.14 cm之間。可見，當W-7濃度為1 mmol/L時對種子萌發生長的抑制作用最大。

2.2 相關基因的表達分析

2.2.1 CRLK1基因的表達分析 低溫脅迫下，CRLK1基因在白菜型油菜中的表達量總體高于甘藍型油菜，其中‘隴油6號’‘隴油16號’‘天油7號’上調表達幅度最大（圖1）；甘藍型油菜中除‘GAU-30’之外，在其他品種中都下調表達。CaCl2處理后，與低溫脅迫相比，基因在各品種中的表達量均小幅上調，其中在白菜型冬油菜中的上調幅度更明顯；鈣調蛋白抑制劑處理后，基因表達下調，且在白菜型冬油菜中的下調幅度更大。

2.2.3 MKK5基因的表達分析 低溫處理后，MKK5基因在‘隴油6號’和‘隴油12號’中上調表達（圖3）；總體比較發現，基因在白菜型冬油菜中的表達量普遍低于甘藍型冬油菜。CaCl2處理后，基因仍然上調表達；并且出現了在白菜型冬油菜中表達較低，而在甘藍型冬油菜中表達較高的情況。而W-7處理后，基因在各品種中均下調表達，白菜型冬油菜中的下調幅度更大。

2.2.4 MPK3和 MPK6基因的表達分析 在不同處理、不同品種中， MPK3（圖4）和 MPK6（圖5）的表達模式相似。低溫處理后， MPK3和 MPK6基因在白菜型冬油菜中均上調表達（除‘天油7號’）；在甘藍型油菜中，除了‘隴油88號’和‘GAU-30’之外，其他品種均表現為下調表達。CaCl2處理后，與低溫處理相比，基因在各品種中的表達量均增加。鈣調蛋白抑制劑處理后，基因在各品種中均下調表達，但在甘藍型冬油菜中下調幅度更大。

2.2.5 CBF1和 CBF3基因的表達分析 低溫脅迫處理開始后，CBF1在白菜型冬油菜中下調表達，隨著處理時間的延長，基因在‘隴油6號’和‘隴油12號’中出現上調表達；噴施CaCl2后，各品種表達趨勢與低溫處理相似，但表達量增加。而在不同處理的甘藍型冬油菜中，各品種的CBF1均上調表達（圖6）。

低溫脅迫后，CBF3基因均上調表達（除‘天油7號’外），其中在甘藍型冬油菜中的表達量顯著高于白菜型冬油菜（圖7）。噴施CaCl2后，在甘藍型冬油菜中表達較高，在白菜型冬油菜中表達較低。鈣調蛋白抑制劑處理后，均下調表達，但在白菜型冬油菜中下調明顯。

3 討論與結論

鈣信使作為植物細胞重要的第二信使，在植物的生長發育和抗逆過程中發揮著重要作用[21-23]，種子的發芽勢、發芽率能體現種子本身的品質與活力，其發芽指標越高，表明種子質量越好，活力越高[24]。外源鈣離子處理能提高低溫脅迫下種子的發芽指標，表明鈣離子能增強植物的抗寒性[25-26]

本研究通過外源添加不同濃度CaCl2和W-7，發現CaCl2能夠緩解低溫對種子造成的影響，這種緩解作用在不同類型的冬油菜中表現不同。當CaCl2濃度為20 mmol/L時，可以顯著提高種子的發芽勢、發芽率、下胚軸長及胚根長；相反的，鈣調蛋白抑制劑W-7對種子萌發會造成不利影響。由此推斷，外源CaCl2促進了鈣信號的傳遞從而影響了種子對低溫的耐受性；相反，鈣調蛋白抑制劑則抑制Ca2+與CaM的結合，降低種子的耐低溫能力，使種子的發芽勢和發芽率降低。

在植物中，MAPK級聯途徑在調節細胞周期、生長發育以及對生物和非生物脅迫反應（如病原體感染、鹽、干旱、高溫、低溫、活性氧（ROS）和重金屬）中發揮著重要作用[27-29]；MAPK的激活需要 CRLK1與 MEKK1在冷脅迫下相互作用， CRLK1在調節植物的耐寒性中起重要作用[30]。MAPKK家族基因不僅與多種非生物脅迫下的信號傳遞有關，還在植物的抗病中扮演著重要角色。研究發現，油菜中 BnMEKK1基因在多個非生物脅迫和不同激素處理后都能響應，而擬南芥 MEKK1是植物中最具特征的MAPKKK之一[31]。CBFs在調節COR基因的表達和在植物耐寒性方面發揮的功能是保守的，水稻、玉米、甘藍型油菜、小麥和其他植物物種中的CBF基因過度表達會顯著提高轉基因植物的抗凍性[32-35]。本研究發現在低溫脅迫后，基因CRLK1、MEKK1、MPK3和 MPK6在白菜型冬油菜中表達較高，MKK5、CBF1和CBF3在甘藍型冬油菜中表達較高，但外源CaCl2處理后所有基因的表達量均有不同程度的增加，這可能是因為外源Ca2+能夠影響鈣信號與CaM結合，激活CRLK1，從而影響MEKK1磷酸化，進一步通過MAPK級聯反應和ICE1-CBF-COR反應網絡提高基因的表達量來緩解低溫脅迫，使得植物可以更好地適應低溫來進行正常的生長發育。而噴施W-7后8個基因在所有品種中表達量均受到抑制，可能是由于鈣調蛋白抑制劑W-7阻礙了Ca2+和CaM結合，影響了MEKK1磷酸化和MAPK級聯反應使得鈣信號無法正常向下游基因傳遞，從而影響植物正常的生長發育，但是具體調控網絡是如何發揮作用的，還需要進一步研究。

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Effects of Calcium and Calcium Ion Inhibitors on Seed Germination and Gene Expression in Winter Rape" Seed under Low Temperature

WANG Kaizu1，LI Rong1，LI Peng1，LIU Lijun2，MA Li2，SUN Wancang1， PU Yuanyuan1，YANG Gang1，WANG Wangtian3 and"" WU Junyan1

（1.Agronomy College of Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China;" 2.Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science，Lanzhou 730070，China; 3.College of Life Science and Technology of Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

Abstract This study investigates the effect of exogenous calcium ions on seed germination in winter oilseed rape， alongside the expression of genes associated with calcium-ion-mediated responses to low temperatures. Using winter rapeseed as experimental material，this study evaluated the effects of exogenous calcium （CaCl2） and the calcium ion inhibitor （W-7） on seed germination characteristics under low-temperature stress in varieties with differing cold resistance.The study identified optimal concentrations for external spraying to elucidate gene expression patterns related to Ca2+ transport and low-temperature response pathways and preliminarily explored the role of Ca2+ in the cold resistance of winter rapeseed. The results showed that Ca2+ alleviated the effect of low temperature on seed germination. Compared to 4 ℃ stress，exogenous Ca2+ significantly improved seed germination rate and germination potential，as well as enhanced radicle elongation，with the 20 mmol/L CaCl2" treatment showing the most pronounced effect.Conversely，treatment with the calcium ion inhibitor W-7 under low-temperature conditions markedly reduced germination potential，germination rate，and the lengths of hypocotyl and radicle. The 1.0 mmol/L W-7 concentration exerted the strongest inhibitory effect on seed germination. After low-temperature stress，the genes CRLPK1，MEKK1，MPK3，and MPK6 were significantly up-regulated in" B.rapa，whereas MKK5，CBF1，and CBF3" were significantly up-regulated in B.napus. The expression levels of all genes increased across different varieties after exogenous CaCl2 treatments. Furthermore，the expression levels of eight genes were inhibited in all varieties after exogenous W-7 application.

Key words Brassica" rapa L.; Brassica napus L.; Exogenous calcium; Calcium ion inhibitor; Low temperatures; Seed germination; Related gene

Received 2024-03-04 Returned 2024-05-15

Foundation item Youth Mentor Support Fund" of" Gansu Agricultural University（No.GAU-QDFC-2021-13）; College Industry Support Project of Gansu Province （No.2023CYZC-51）; Construction of National Modern Agricultural Industry Technology System， Project of Ministry of Finance and Ministry of Agriculture and Rural Affairs （No.CARS-12）; National Key Research and Development Program （No.2022YFD1100500）.

First author WANG" Kaizu，male，master" student.Research area：crop genetics and breeding." E-mail：3240086292@qq.com

Corresponding"" author WU Junyan，female，professor.Research area：rape" seed genetics and breeding." E-mail： wujuny@gsau.edu.cn

（責任編輯：潘學燕 Responsible editor：PAN Xueyan）

收稿日期：2024-03-04 修回日期：2024-05-15

基金項目：甘肅農業大學青年導師扶持基金（GAU-QDFC-2021-13）；甘肅省高校產業支撐計劃項目（2023CYZC-51）；財政部和農業農村部國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-12）；國家重點研發計劃專項（2022YFD1100500）。

第一作者：王凱祖，男，碩士研究生，研究方向為作物遺傳育種。E-mail：3240086292@qq.com

通信作者：武軍艷，女，教授，研究方向為油菜遺傳育種。E-mail：wujuny@gsau.edu.cn