基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與Dijkstra模型的柴胡抗肝癌機(jī)制研究

摘要：以柴胡為君藥的復(fù)方逍遙散、四逆散與小柴胡湯等常用于臨床肝癌治療。前期研究發(fā)現(xiàn)，柴胡具有抗肝癌活性，且其低極性部位能顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。然而，柴胡低極性部位治療肝癌的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制尚未得到系統(tǒng)和深入地研究。本研究采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Liquid Chromatography-mass Spectrometry，LC-MS）解析柴胡低極性部位化學(xué)成分，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與最短路徑算法（Dijkstra）傳播模型解析柴胡低極性部位抗肝癌關(guān)鍵成分-靶點(diǎn)藥效網(wǎng)絡(luò)，最后通過分子對(duì)接驗(yàn)證柴胡低極性部位關(guān)鍵成分與靶點(diǎn)相互作用。結(jié)果顯示，柴胡低極性部位共鑒定35 個(gè)化學(xué)成分；通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選“hithubs”靶點(diǎn)40個(gè)，主要涉及癌癥通路、癌癥中蛋白聚糖、卡波西肉瘤（Kaposi Sarcoma）相關(guān)皰疹病毒感染、磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B通路（Phosphatidylinositol-3 Kinase-akt Protein Kinase b Pathway，PI3K-Akt）信號(hào)通路、化學(xué)致癌作用-受體激活等通路。進(jìn)一步根據(jù)“hithubs”各靶點(diǎn)在核心通路中的數(shù)量篩選出3個(gè)最為關(guān)鍵的靶點(diǎn)包括表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal Growth FactorReceptor，EGFR）、基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMP）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（Matrix Metalloproteinase，STAT3）。Dijkstra 傳播模型結(jié)果顯示柴胡低極性中柴胡多炔8（RB-8）、柴胡多炔4（RB-4）和柴胡皂苷元G為關(guān)鍵抗肝癌成分。分子對(duì)接顯示柴胡皂苷元G與EGFR，RB-8、RB-4 和柴胡皂苷元G與STAT3 具有很強(qiáng)的親和力。本文結(jié)果表明RB-8、RB-4 和柴胡皂苷元G可能是柴胡低極性部位的主要活性成分群，通過阻斷EGFR的表達(dá)，抑制Janus 激酶2（Janus Kinase 2，JAK2）/STAT3 通路，最終減緩肝癌的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。該研究為解釋中醫(yī)治療肝癌的潛在機(jī)制提供了參考，為柴胡治療肝癌臨床用藥及相關(guān)藥物制劑開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：柴胡；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；Dijkstra傳播模型；肝癌；分子對(duì)接

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2395（2025）02-0265-13

0引言

肝癌是全球第六大常見惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。英國(guó)癌癥研究中心指出，至2035年，肝癌將成為增長(zhǎng)速度最快的惡性腫瘤之一［1］。預(yù)計(jì)到2025 年，原發(fā)性肝癌將影響超過100 萬人。超過一半的肝癌病例和死亡發(fā)生在東亞地區(qū)，其中我國(guó)每年肝癌發(fā)病和死亡人數(shù)分別為46.6 萬和38.3 萬，這將帶來巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)和健康挑戰(zhàn)［2］。肝癌的發(fā)生與吸煙、飲酒和食物中的致癌物質(zhì)有關(guān)，遺傳與環(huán)境因素也在其發(fā)病過程中起重要作用［3］。炎癥反應(yīng)，細(xì)胞周期異常和代謝網(wǎng)絡(luò)異?？赡苁歉伟┑闹饕虏C(jī)制［4］。近幾十年來，肝癌的治療主要包括化療、放療和手術(shù)切除。然而，盡管肝癌治療取得了一定進(jìn)展，但許多藥物未能為患者帶來令人滿意的效果，有效率低且毒副作用較大。此外，外科手術(shù)對(duì)于患者的疾病進(jìn)程與肝臟功能要求較高，且具有較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［5］。中藥由于其多成分、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的效應(yīng)優(yōu)勢(shì)，為肝癌治療提供了一種替代方法，例如提高人體免疫力、減輕化療的毒副作用、增強(qiáng)化療敏感性以及延長(zhǎng)患者生存期［6］。因此，發(fā)展中醫(yī)藥作為肝癌的一種新治療方法具有重要意義。

柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC. 或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根。其味辛、苦，性微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣等作用。中醫(yī)臨床研究發(fā)現(xiàn)，肝郁脾虛證是原發(fā)性肝癌患者中最常見證型，以柴胡為君藥的逍遙散、四逆散與小柴胡湯等常用于肝癌治療［7］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，柴胡具有顯著的抗肝癌活性，其中，柴胡注射液能夠?qū)θ烁伟㏒MMC-7721 細(xì)胞發(fā)揮抑制和促凋亡的作用；而小柴胡湯的含藥血清則能誘導(dǎo)人肝癌HepG2 細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬。柴胡的有效成分，如柴胡皂苷A、B2和D等，均展現(xiàn)出抗肝癌的潛力，其機(jī)制包括激活轉(zhuǎn)錄因子3（ATF3）以誘導(dǎo)鐵死亡，以及通過調(diào)節(jié)STK4/IRAK1/NF- κB 通路發(fā)揮抗炎抗腫瘤的作用，同時(shí)抑制腫瘤血管生成的VEGF/ERK/HIF?1α 信號(hào)通路等［8-10］。然而，柴胡其他有效成分如柴胡多炔、揮發(fā)油類等抗肝癌作用尚不清楚。課題組前期對(duì)柴胡不同極性部位對(duì)肝癌SMMC-7721 細(xì)胞的影響及機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，柴胡低極性部位組和中極性部位組干預(yù)后能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡，肝癌細(xì)胞阻滯于G1 期主要與Npas2-CDC25A-CDK2-Cyclin E 復(fù)合物有關(guān)，阻滯于G2 期主要與CDC25B-CDK1-Cyclin B1復(fù)合物有關(guān)，凋亡主要與Npas2-CDC25A 靶點(diǎn)以及激活線粒體凋亡途徑相關(guān)［11］。然而，柴胡低極性部位成分復(fù)雜，課題組前期發(fā)現(xiàn)其含有多種新型多炔類成分，這些成分具有抗抑郁生物活性，也可能具有抗肝癌作用。因此，本研究采用LC-MS 結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，鑒定柴胡低極性部位治療肝癌的關(guān)鍵成分與靶點(diǎn)，并解析相關(guān)通路。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠在細(xì)胞和分子水平上深入理解藥物在疾病治療中的作用機(jī)制，并系統(tǒng)分析藥物、疾病和靶點(diǎn)之間的相互作用，從而探索其復(fù)雜的生物學(xué)過程和信號(hào)通路［12］。目前，許多學(xué)者開發(fā)了多種網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)新方法，在中藥抗癌的研究中取得了新進(jìn)展，包括網(wǎng)絡(luò)高通量研究策略［13］、基于靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的藥物- 靶標(biāo)預(yù)測(cè)算法（Drug Target Prediction Algorithm，drugCIPHER）方法［14］、進(jìn)化動(dòng)力學(xué)的多尺度模型［15］、機(jī)器學(xué)習(xí)算法［16］與Dijkstra 傳播模型［17］等等。其中，Dijkstra 傳播模型是通過成分- 靶點(diǎn)- 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)計(jì)算藥物靶點(diǎn)與藥物調(diào)控疾病基因的最短距離，并保留節(jié)點(diǎn)數(shù)小于或等于3 的最短路徑。該模型能反映中藥藥效的傳播模式，并將復(fù)雜的成分- 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)簡(jiǎn)化以提取關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)，在靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和成分篩選等方面廣泛應(yīng)用［18］。因此，構(gòu)建基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的柴胡低極性部位治療肝癌傳播模式，將有助于更全面地揭示柴胡低極性部位治療肝癌的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制。

基于此，本研究首先采用UPLC-Q-TOFMS技術(shù)解析柴胡低極性部位化學(xué)成分，進(jìn)一步通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合Dijkstra 傳播模型，預(yù)測(cè)柴胡低極性部位抗肝癌關(guān)鍵成分、作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路，最終通過分子對(duì)接解析關(guān)鍵成分與靶點(diǎn)的相互作用，揭示柴胡低極性部位抗肝癌的藥效物質(zhì)和作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療肝癌臨床用藥及相關(guān)藥物制劑開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1. 1藥材

柴胡由山西省華陽藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)鑒定為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.，習(xí)稱“北柴胡”。

1. 2藥品與試劑

分析純甲醇、石油醚與乙腈（天津四方化工有限公司，中國(guó)），質(zhì)譜純甲醇與乙腈（Thermo fisher 公司，美國(guó)），色譜純甲酸（Thermo fisher 公司，美國(guó)），二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，天津富宇精細(xì)化工有限公司，中國(guó)）。

1. 3儀器

賽默飛U3000超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC，Thermofisher 公司，美國(guó)），賽默飛Q ExactiveTM Orbitrap質(zhì)譜（Mass Spectrometry，MS，Thermo fisher公司，美國(guó)），，KQ-300E 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，中國(guó)），SartoriusBSA124S 分析天平（Sartorius 公司，美國(guó)），Neofuge13R 高速冷凍離心機(jī)（上海力申科學(xué)儀器有限公司，中國(guó)），Milli-Q Integral Water Purification System 純水儀（Millipore公司，美國(guó)），HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司，中國(guó)）。

1. 4數(shù)據(jù)庫與軟件

建立柴胡化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫：通過文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫（Web of Science，https：//www. isiknowledge.com；Pubmed，https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov；CNKI，http：//www.cnki.net）和中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫（TCMSP，https：//old. tcmsp-e. com/tcmsp. php；TCMID，http：//47.100.169.139/tcmid），收集并整理柴胡化合物及其結(jié)構(gòu)信息，建立柴胡化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫：SwissTargetPrediction（http：// swisstargetprediction. ch/）和Pharmmapper（http：// lilab-ecust. cn/pharmmapper/）。此外，從文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫Web of Science，Pubmed 和CNKI 中收集成分靶點(diǎn)。

以“l(fā)iver cancer”“hepatocellular carcinoma”“intrahepatic" cholangiocarcinoma”為檢索詞，在各個(gè)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫檢索：DisGenet（https：// www.disgenet. org/）、Genecards（https：//www. genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）和TTD（http：//ttd.org/）。結(jié)合這些數(shù)據(jù)并刪除重復(fù)值后，通過UniProt （https：//www.uniprot.org/），將目標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)化為“Homo sapiens”的物種。

1.5柴胡低極性部位制備

參照實(shí)驗(yàn)室前期方法，取適量柴胡藥材，混勻后加入8 倍量體積分?jǐn)?shù)95% 乙醇，加熱回流2 次（每次2 h），合并回流液，過濾，回收乙醇至無醇味，然后加入等體積的石油醚超聲萃?。?0 min/次），至萃取液近乎無色。合并石油醚提取液，濃縮至浸膏，于真空干燥箱（60 ℃）中干燥，即得柴胡低極性部位。

供試液的制備：稱取柴胡低極性部位樣品100 mg，加入體積分?jǐn)?shù)95% 甲醇5 mL，渦旋1min，超聲提取20 min，高速離心（13 000 r/min）15 min，取其上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后進(jìn)樣分析。

1.6色譜、質(zhì)譜條件與成分分析策略

色譜條件：超高效液相色譜條件色譜柱為Waters HSS T3 液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% 甲酸水溶液（A）和甲醇（B），柱溫為40 ℃，流速為0.20 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL。梯度條件：0 min～1 min，10%～10%B；1 min～2 min，10%～60%B；2 min～9 min，60%～60%B；9 min～11 min，60%～70%B；11 min～25 min，70%～98%B；25 min～26 min，98%～10%B；26 min～30 min，10%B。

質(zhì)譜條件：ESI 離子源于正、負(fù)離子兩種模式下采集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集范圍為50～1 500 m/z，離子噴霧電壓為3.5 kV（+）和2.5 kV（-）；去簇電壓和入口電壓為70 V 和10 V；碰撞氣霧化氣、輔助加熱氣和氣簾氣分別為50、50 和35 kPa；去溶劑溫度為320 ℃。采用數(shù)據(jù)依賴性采集（Data-Dependent Acquisition，DDA）方法，強(qiáng)度閾值為5 000 選取強(qiáng)度最高的15 個(gè)離子進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

分析策略：Compound Discoverer 3.1（CD）軟件分析，利用Chemspider、mzVault、mzCloud 等在線數(shù)據(jù)庫對(duì)逍遙散質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行非靶向搜索，得到由樣品名稱、保留時(shí)間、分子式、質(zhì)荷比以及對(duì)應(yīng)的離子強(qiáng)度組成的數(shù)據(jù)集。

綜合分析建立的本地化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫和Compound Discoverer 3.1計(jì)算結(jié)果。通過Xcalibur3.2 軟件（美國(guó)Thermo 公司）提取一級(jí)質(zhì)譜與二級(jí)質(zhì)譜信息，結(jié)合診斷離子、碎片離子、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步鑒定柴胡低極性部位化學(xué)成分。

1.7蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

柴胡低極性部位成分靶標(biāo)和肝癌疾病靶標(biāo)用于構(gòu)建蛋白交互網(wǎng)絡(luò)圖。兩種蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)由Cytoscape 軟件構(gòu)建，從柴胡低極性部位成分靶標(biāo)和肝癌疾病靶的交叉點(diǎn)間獲得網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)屬性值是通過CytoNCA 插件獲得的，degree 大于所有degree 中位數(shù)兩倍的節(jié)點(diǎn)被認(rèn)為是“Hithub”關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，用于后續(xù)通路富集分析。

1.8"GO和KEGG通路富集分析

使用DAVID 6.7 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），對(duì)KEGG 通路和GO通路進(jìn)行富集分析。KEGG 生物途徑富集分析選擇的途徑P值≤0.05，Benjamin value≤0.05，對(duì)前15名KEGG通路進(jìn)行可視化分析。GO 富集分析包括細(xì)胞成分、分子功能和生物過程三個(gè)方面。利用生物信息學(xué)平臺(tái)（http：// www. bioinformatics.com.cn/），進(jìn)行了可視化分析，以制作氣泡圖和直方圖。

1.9"Dijkstra模型傳播系數(shù)計(jì)算

本研究采用的Dijkstra 模型，基于成分- 靶點(diǎn)- 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，檢測(cè)柴胡低極性部位成分與其調(diào)控基因的最短距離，并保留不超過3 個(gè)節(jié)點(diǎn)的路徑。初始節(jié)點(diǎn)被認(rèn)為是成分的直接靶點(diǎn)，終端節(jié)點(diǎn)被認(rèn)為是調(diào)控的代謝基因。將第一或中間節(jié)點(diǎn)定義為繁殖模式，當(dāng)節(jié)點(diǎn)數(shù)小于3 時(shí)，意味著成分靶點(diǎn)與肝癌代謝基因直接相關(guān)，這是最理想的結(jié)果。當(dāng)節(jié)點(diǎn)數(shù)等于3 時(shí)，表示成分靶點(diǎn)通過其他中間基因與代謝基因相關(guān)。中間基因越多，成分靶點(diǎn)與代謝基因相關(guān)的方式就越多，也更容易影響代謝基因。終端節(jié)點(diǎn)定義為通過增殖模式到達(dá)的效應(yīng)蛋白。具有更多繁殖模式和更多效應(yīng)蛋白的靶標(biāo)通常具有更好的干預(yù)效果。我們計(jì)算每個(gè)成分傳播模式數(shù)量。

將成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)定義為圖形G（H，L），H和L 分別代表節(jié)點(diǎn)和邊。給定一個(gè)隨機(jī)初始節(jié)點(diǎn)u，c_u，x"是從節(jié)點(diǎn)u到節(jié)點(diǎn)x的邊的權(quán)重。H分為兩組P和Q，P中的節(jié)點(diǎn)到u的距離已經(jīng)確定，Q中包含的節(jié)點(diǎn)到u 的距離尚未確定。距離Q中從初始節(jié)點(diǎn)u 到節(jié)點(diǎn)x定義為從u到Q中節(jié)點(diǎn)x 不經(jīng)過Q中其他節(jié)點(diǎn)的最短路徑長(zhǎng)度。算法的思路如下：

（4）繼續(xù)上述步驟，直到Q 為空集。

（5）在計(jì)算du，x 以路徑小于或等于3個(gè)節(jié)點(diǎn)為最短距離DMIN，在具有3 個(gè)節(jié)點(diǎn)的路徑中，第1 個(gè)節(jié)點(diǎn)和第2 個(gè)節(jié)點(diǎn)代表傳播模式，第3個(gè)節(jié)點(diǎn)代表藥物調(diào)控的代謝基因。

1.10分子對(duì)接

EGFR、MMP 和STAT3 靶點(diǎn)蛋白PDB 文件是從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）下載。RB-8、RB-4 與柴胡皂苷元G 的mol2 文件從Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站下載或者Chemdraw 17.1 軟件繪制。分子對(duì)接采用SYBYL2.1.1藥物設(shè)計(jì)學(xué)工具，運(yùn)用軟件刪去靶蛋白的原配體和分子，補(bǔ)充非完整的氨基酸殘基，加氫加電荷，以原活性配體為原型分子，創(chuàng)建對(duì)接口袋，以成分作為配體進(jìn)行分子對(duì)接并打分（Total score），分值越高，表示化合物與受體的結(jié)合力可能越強(qiáng)。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1基于LC-MS的柴胡低極性部位化學(xué)成分分析

通過總結(jié)課題組前期工作、文獻(xiàn)調(diào)研Webof Science、Pubmed、CNKI和網(wǎng)絡(luò)在線數(shù)據(jù)庫TCMSP、TCMID，我們建立柴胡本地化學(xué)成分庫。該化學(xué)成分庫包含了各化合物名稱、分子式、結(jié)構(gòu)式和精確分子量，部分化合物通過Massbank （http：//massbank. eu//） 和Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫收集質(zhì)譜碎片離子信息。最終，本地化學(xué)成分庫的包含335 個(gè)化合物。在化學(xué)成分鑒定過程中，手動(dòng)提取本地化學(xué)成分庫中成分的一級(jí)質(zhì)譜與二級(jí)質(zhì)譜信息，并與數(shù)據(jù)庫中的質(zhì)譜信息進(jìn)行比對(duì)，最終鑒定化學(xué)成分。柴胡低極性部位在正、負(fù)離子模式下的總離子流圖見圖1，共分析鑒定出35 種化合物，化合物詳情見表1。

2. 2基于“hithub”的柴胡低極性部位抗肝癌靶點(diǎn)分析

通過對(duì)柴胡低極性部位的35 個(gè)成分進(jìn)行TCMSP、SwissTargetPrediction、Pharmmapper 和PubMed數(shù)據(jù)庫分析，去除重復(fù)后，我們獲得了502 個(gè)成分靶點(diǎn)。同時(shí)，通過DisGene、Genecards、OMIM和TTD數(shù)據(jù)庫，獲得6673個(gè)肝癌相關(guān)靶點(diǎn)。如圖2 所示，這兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)分別由502個(gè)節(jié)點(diǎn)與6 461 條邊，以及6673節(jié)點(diǎn)與258269條邊組成。結(jié)合這兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)，獲得了柴胡低極性部位抗肝癌靶點(diǎn)303 個(gè)，并構(gòu)建了包括303個(gè)節(jié)點(diǎn)與3633條邊的網(wǎng)絡(luò)。將degree大于所有degree 中位數(shù)兩倍的節(jié)點(diǎn)作為“hithub”關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。最終我們獲得了35個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，并構(gòu)建了柴胡低極性部位抗肝癌“hithubs”靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)包括35 個(gè)點(diǎn)與490條邊。

2.3柴胡低極性部位抗肝癌靶點(diǎn)富集分析及核心靶點(diǎn)篩選

為了探討柴胡低極性部位治療肝癌的機(jī)制，我們采用DAVID 數(shù)據(jù)庫對(duì)柴胡低極性部位抗肝癌的35 個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG與GO富集分析，如氣泡圖所示（圖3）。柴胡低極性部位治療肝癌涉及許多與癌癥相關(guān)的信號(hào)通路，包括癌癥通路、癌癥中蛋白聚糖、Kaposi sarcoma相關(guān)皰疹病毒感染、PI3K-Akt信號(hào)通路、化學(xué)致癌作用-受體激活、前列腺癌、催乳素信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥、內(nèi)分泌抵抗、人巨細(xì)胞病毒感染、FoxO 信號(hào)通路、膀胱癌、C 型凝集素受體信號(hào)通路與Th17 細(xì)胞分化。GO富集分析包括生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）三個(gè)模塊（圖4），結(jié)果顯示柴胡低極性部位與肝癌相互作用在生物過程模塊主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ 對(duì)轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)的正向調(diào)控、DNA 模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控和細(xì)胞群增殖的正向調(diào)節(jié)等；細(xì)胞成分模塊主要涉及細(xì)胞質(zhì)、nucleus、胞質(zhì)溶膠、核質(zhì)和含蛋白復(fù)合物等；同時(shí)，分子功能模塊主要涉及蛋白結(jié)合、ATP 結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合和RNA 聚合酶II 特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。

為了進(jìn)一步分析柴胡低極性部位抗肝癌核心靶點(diǎn)，我們根據(jù)各靶點(diǎn)所涉及的KEGG與GO通路數(shù)量進(jìn)行排名（圖5）。結(jié)果表明，EGFR 、MMP 和STAT3 參與了大多數(shù)的通路，這可能是柴胡低極性部位抗肝癌的核心靶點(diǎn)。

2.4基于Dijkstra算法篩選柴胡低極性部位抗肝癌核心藥效成分群

我們分析計(jì)算柴胡低極性部位的每個(gè)成分的傳播模式。根據(jù)計(jì)算結(jié)果，排名前三的成分分別是RB-8、RB-4 和柴胡皂苷元G，這三個(gè)成分可能是柴胡低極性部位抗肝癌最關(guān)鍵的成分。RB-8 和RB-4 是本課題組前期分離鑒定的多炔類化合物，具有抗抑郁活性并能抑制單胺類神經(jīng)遞質(zhì)再攝取的活性［19］，但是其在肝癌癌癥方面的作用尚未報(bào)道?，F(xiàn)階段尚無報(bào)道柴胡皂苷元G 的生物活性，僅有關(guān)于柴胡皂苷元G的網(wǎng)絡(luò)藥理預(yù)測(cè)顯示其有抗抑郁活性。因此，這三個(gè)成分作為柴胡低極性部位抗癌最關(guān)鍵的成分，需要進(jìn)一步的分子對(duì)接驗(yàn)證。

2.5柴胡低極性部位抗肝癌藥效成分群與靶點(diǎn)分子對(duì)接

柴胡低極性部位的代表性活性成分主要為RB-8、RB-4 和柴胡皂苷元G，同時(shí)EGFR、MMP 和STAT3 是柴胡低極性部位抗肝癌的核心靶點(diǎn)。將3 種核心成分與3 種靶點(diǎn)的結(jié)合姿勢(shì)、相互作用與每次相互作用的結(jié)合能進(jìn)行分析（圖7，表2）。分子對(duì)接的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是0 到5分，一般認(rèn)為綜合打分在4以上表示有較好地結(jié)合。結(jié)果表明，每種候選藥物通過可見的氫鍵和強(qiáng)靜電相互作用與其蛋白質(zhì)靶標(biāo)結(jié)合。此外，每個(gè)靶點(diǎn)的疏水口袋被3 種候選藥物成功占據(jù)。對(duì)于結(jié)合能進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，RB-8、RB-4與柴胡皂苷元G 與EGFR 具有-4.58、-5.44 與-8.12 kcal/mol的結(jié)合能（ 對(duì)接打分gt;4），表明這些各成分與EGFR 結(jié)合高度穩(wěn)定。RB-8、RB-4 與MMP2具有-0.17 與-0.22kcal/mol 的弱結(jié)合能，柴胡皂苷元G 與MMP2 未能結(jié)合（對(duì)接打分lt;4），各成分與MMP2 結(jié)合能力較弱。RB-8、RB-4 和柴胡皂苷元G 與STAT3 分別具有-3.97、-3.97 和-5.69 kcal/mol 的結(jié)合能（對(duì)接打分gt;4），表明這些成分與STAT3 結(jié)合高度穩(wěn)定。

3討論與總結(jié)

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中排名第二，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［2］。近年來，中醫(yī)結(jié)合現(xiàn)代治療方法在改善癥狀、促進(jìn)療效、減少毒副作用方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。柴胡歸肝、膽經(jīng)，具有疏肝解郁等功效。目前，臨床上以柴胡為君藥的中藥方劑用于治療肝癌，如逍遙散、四逆散與和小柴胡湯等，在改善晚期肝癌患者的癥狀方面發(fā)揮了更有利的作用［7］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，柴胡具有抗肝癌活性，其低極性部位能抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與甘油磷脂代謝、鞘磷脂代謝有關(guān)［11］。然而，柴胡低極性部位抗肝癌的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制仍然不清楚。在本研究中，我們采用LCMS解析了柴胡低極性部位化學(xué)成分，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與Dijkstra傳播模型解析柴胡低極性部位抗肝癌關(guān)鍵成分- 靶點(diǎn)藥效網(wǎng)絡(luò)，通過分子對(duì)接驗(yàn)證柴胡低極性部位關(guān)鍵成分與靶點(diǎn)相互作用。該方法闡述了柴胡低極性部位成分治療肝癌的傳播模式，并發(fā)現(xiàn)RB-8、RB-4 和柴胡皂苷元G 可能是柴胡低極性部位的主要活性成分群，通過阻斷EGFR 的表達(dá)，抑制JAK2/STAT3 通路以及抑制MMP 表達(dá)，最終減緩肝癌的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。該研究為解釋中醫(yī)治療肝癌的潛在機(jī)制提供了參考，為柴胡治療肝癌臨床用藥及相關(guān)藥物制劑開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

Dijkstra 算法是一種用于尋找圖中最短路徑的算法。該算法由計(jì)算機(jī)科學(xué)家艾茲赫爾·迪克斯特拉（Edsger W. Dijkstra）于1956 年提出，其基本思路是通過不斷選擇當(dāng)前已知的最短路徑節(jié)點(diǎn)，逐步擴(kuò)展到其他節(jié)點(diǎn)，直到找到目標(biāo)節(jié)點(diǎn)的最短路徑［20］。近年來，Dijkstra算法作為一種經(jīng)典的最短路徑算法，在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)領(lǐng)域中發(fā)揮了重要作用，為分析中藥與生物網(wǎng)絡(luò)之間的復(fù)雜關(guān)系提供了有效工具，促進(jìn)了靶點(diǎn)識(shí)別、藥物發(fā)現(xiàn)及網(wǎng)絡(luò)交互分析等方面的研究。在中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中，其作用往往不僅限于單一靶點(diǎn)，而是通過多成分與多靶點(diǎn)之間的相互作用，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［21］。Dijkstra算法可用于識(shí)別各成分通過生物網(wǎng)絡(luò)作用于多個(gè)靶點(diǎn)的路徑，從而揭示潛在的關(guān)鍵成分與靶點(diǎn)。同時(shí)，該算法還能夠分析成分與蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)系，以幫助理解藥物的作用機(jī)制。Dijkstra算法能夠追蹤成分藥物從靶點(diǎn)出發(fā)，經(jīng)過多個(gè)中介分子，到達(dá)其他靶點(diǎn)的路徑，這對(duì)于多成分多靶點(diǎn)效應(yīng)及其網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的研究具有重要意義［22］。本研究從柴胡低極性部位抗肝癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)出發(fā)，運(yùn)用Dijkstra算法尋找與靶點(diǎn)相關(guān)的關(guān)鍵成分，最終發(fā)現(xiàn)RB-8、RB-4 和柴胡皂苷元G，這三個(gè)成分可能是柴胡低極性部位抗癌的最關(guān)鍵成分。然而，這些關(guān)鍵成分僅僅是預(yù)測(cè)的結(jié)果，后續(xù)的體內(nèi)外藥理學(xué)驗(yàn)證是非常必要的。

EGFR（表皮生長(zhǎng)因子受體）是HER 家族成員之一，其在許多惡性腫瘤如肝癌、肺癌和胃癌均有高表達(dá)［23］。研究表明，EGFR 可通過受體激活形成二聚體，使酪氨酸自磷酸化，進(jìn)而激活細(xì)胞質(zhì)部分的酪氨酸激酶。下游信號(hào)通路蛋白可以與EGFR 上磷酸化的酪氨酸位點(diǎn)結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)不同的信號(hào)應(yīng)答，從而導(dǎo)致一系列生物效應(yīng)［24］。下游信號(hào)通路主要包括JAK/STAT 和RAS/RAF/MAPK 等信號(hào)通路。大量研究結(jié)果顯示STAT3 在腫瘤中存在異常高表達(dá)，同時(shí)信號(hào)通路中STAT3的表達(dá)與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)［25］。既往研究表明，STAT1和STAT3 在肝癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于相應(yīng)的癌旁組織，并且STAT3 的高表達(dá)與HCC 的分化程度和臨床分期呈正相關(guān)［26］。越來越多的證據(jù)表明，STAT3是JAK2/STAT3 信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控基因［27］。JAK2/STAT3 信號(hào)通路的激活可以增加細(xì)胞中p-STAT3 的蛋白含量，并影響腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲［28］。此外，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)柴胡低極性部位能作用于肝癌細(xì)胞周期G1 期Npas2-CDC25ACDK2-Cyclin E 通路，與G2 期CDC25B-CDK1-Cyclin B1通路。STAT3在細(xì)胞周期的調(diào)控中也扮演著重要的角色，STAT3 可以通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白Cyclin E促進(jìn)G1 期向S期的過渡［29］。STAT3 可以通過直接結(jié)合到Cyclin B1基因的啟動(dòng)子區(qū)域來促進(jìn)Cyclin B1的轉(zhuǎn)錄。這種直接調(diào)控機(jī)制使得STAT3 在細(xì)胞周期的G2/M 期轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用［30］。因此，EGFR/AK2/STAT3 信號(hào)通路在柴胡低極性部位調(diào)控細(xì)胞周期過程中發(fā)揮重要作用。我們的結(jié)果表明，柴胡低極性部位RB-8、RB-4 和柴胡皂苷元G 成分可以作用于EGFR/JAK2/STAT3，柴胡低極性部位治療可能抑制EGFR 的表達(dá)，從而阻斷JAK2/STAT3 通路發(fā)揮抗肝癌作用。

MMP是一類鋅離子和鈣離子依賴的蛋白酶家族，能夠靶向并降解ECM 中的多種蛋白。MMP是與腫瘤發(fā)生相關(guān)的最突出的蛋白酶家族，越來越多的研究報(bào)道了MMP 家族與肝癌的關(guān)聯(lián)［31］。研究表明，MMP 可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，加速腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液或淋巴系統(tǒng)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［31］。MMP 可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，加速腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液或淋巴系統(tǒng)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。課題組的前期研究表明，柴胡低極性部分可以降低MMP9 的蛋白表達(dá)，降低肝癌細(xì)胞的遷移能力。此外，MMP在腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)細(xì)胞間的相互作用，影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活和遷移。Juric 等報(bào)道，MMP-9 抑制劑可以增加CXCL10和其他T 細(xì)胞相關(guān)刺激因子的表達(dá)，包括IL-12p70 和IL18［32］。此外，MMP 在血管生成中起著重要作用。通過降解基質(zhì)成分，MMP 促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖，從而支持腫瘤的生長(zhǎng)。某些MMP 的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲性和預(yù)后相關(guān)。例如，MMP-2 和MMP-9 在多種癌癥中高表達(dá)，且與腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移相關(guān)，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生過程中潛在的生物標(biāo)志物［33］。我們的結(jié)果表明，柴胡低極性部位RB-8、RB-4成分可以作用于MMP 靶點(diǎn)，柴胡低極性部位能抑制肝癌MMP 表達(dá)，減緩肝癌的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。

綜上所述，我們的研究為揭示柴胡低極性部位作為肝癌的有前途的治療選擇提供了科學(xué)基礎(chǔ)。因此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與Dijkstra 傳播模型解的整合揭示了柴胡低極性部位在肝癌中的多成分與多靶點(diǎn)藥理機(jī)制。盡管我們使用分子對(duì)接分析來驗(yàn)證我們的結(jié)果，后續(xù)仍需要額外的體內(nèi)和體外研究來驗(yàn)證當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的有效性。此外，我們的研究有幾個(gè)局限性。首先，需要額外的體內(nèi)和體外研究來確認(rèn)我們的發(fā)現(xiàn)。其次，需要一個(gè)更大的傳統(tǒng)藥物和靶基因數(shù)據(jù)庫來提高網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。第三，即使將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果與分子對(duì)接相結(jié)合，我們也無法完全理解柴胡低極性部位確切治療機(jī)制。因此，多學(xué)科的整合對(duì)于了解柴胡低極性部位在肝癌中的作用機(jī)制是必要的。

肝癌是一種生長(zhǎng)速度較快的致命疾病。面對(duì)疾病異質(zhì)性、抗癌耐藥性和缺乏治療靶點(diǎn)，研究人員和臨床醫(yī)生需要更有效的治療方案。本研究采用LCMS技術(shù)解析了柴胡低極性部位化學(xué)成分，并整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與Dijkstra傳播模型確定柴胡低極性部位抗肝癌的多成分與多靶點(diǎn)機(jī)制。進(jìn)一步采用分子對(duì)接驗(yàn)證這些成分與靶點(diǎn)的相互作用。我們的結(jié)果表明RB-8、RB-4和柴胡皂苷元G可能是柴胡低極性部位的主要活性成分群，通過阻斷EGFR的表達(dá)，抑制JAK2/STAT3通路以及抑制MMP表達(dá)，最終減緩肝癌的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。該研究為解釋中醫(yī)治療肝癌的潛在機(jī)制提供了參考，為柴胡治療肝癌臨床用藥及相關(guān)藥物制劑開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。