生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)Ruminiclostridium papyrosolvens DSM2782的全基因組測(cè)序及生物功能挖掘

Ruminiclostridium papyrosolvens（溶紙梭菌，R. papyrosolvens）DSM2782作為嗜中溫產(chǎn)纖維小體厭氧梭菌中進(jìn)化程度最高的纖維素降解梭菌，由于其基因組信息缺失會(huì)影響進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探究。為了能夠有效地挖掘R. papyrosolvens DSM2782的生物學(xué)功能，并探究其是否具有合成有活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛力。采用二代Illumina 聯(lián)合三代PacBio 測(cè)序技術(shù)，對(duì)R. papyrosolvens DSM2782進(jìn)行全基因組測(cè)序和功能分析，并與同類型的嗜中溫產(chǎn)纖維小體梭菌進(jìn)行比較基因組學(xué)分析，最后對(duì)其不同碳源下的發(fā)酵液采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）進(jìn)行非靶向代謝檢測(cè)。研究結(jié)果表明R. papyrosolvens DSM2782 基因組序列全長(zhǎng)為5027861 bp，GC含量為37.1%。將完整的基因組序列提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center forBiotechnology Information，NCBI）獲得GenBank 登錄號(hào)為CP119677.1。通過(guò)原核生物基因組注釋工具（ProkaryoticGenome Annotation Pipeline，PGAP）共注釋了4274個(gè)蛋白編碼基因、4 個(gè)ncRNA、24 個(gè)rRNA 以及62 個(gè)tRNA。為進(jìn)一步對(duì)R. papyrosolvens DSM2782基因組的功能進(jìn)行分析，使用直系同源簇（Cluster of Orthologous Group，COG）、基因本體（Gene Ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其編碼基因序列進(jìn)行注釋，分別有3503、1301、2009個(gè)編碼基因被注釋。通過(guò)dbCAN3數(shù)據(jù)庫(kù)在R. papyrosolvens DSM2782 基因組中檢測(cè)到231個(gè)不同的碳水化合物活性水解酶。通過(guò)與其他梭菌屬基因組進(jìn)行ANI比較，結(jié)果顯示R. papyrosolvens" DSM2782 與R. sp. BNL1100、R. cellulolyticum H10以及R. papyrosolvens C7 具有較高的同源性。同時(shí)對(duì)R. papyrosolvens DSM2782與R. papyrosolvens C7 進(jìn)行共線性分析，結(jié)果表明R. papyrosolvensDSM2782與R. papyrosolvens C7 之間的大部分區(qū)域的序列高度同源。利用生物合成基因預(yù)測(cè)軟件antiSMASH預(yù)測(cè)R. papyrosolvens DSM2782 基因組中存在23 個(gè)生物合成基因簇。通過(guò)非靶向代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)R. papyrosolvensDSM2782 可能產(chǎn)生4-羥基苯甲酸、尼泊金丙酯、丁酸、四氫嘧啶、去甲哈爾滿、左旋多巴等物質(zhì)，這也表明R. papyrosolvens DSM2782 能夠產(chǎn)生具有活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。R. papyrosolvens DSM2782 全基因測(cè)序以及代謝組學(xué)結(jié)果表明其具有降解木質(zhì)纖維素的功能，同時(shí)也能夠產(chǎn)生多種具有活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。本研究為后續(xù)深入開(kāi)展R. papyrosolvens DSM2782 生物功能研究提供了豐富的基因組信息和基因資源。

關(guān)鍵詞：溶紙梭菌；全基因組測(cè)序；碳水化合物活性水解酶；生物合成基因簇

中圖分類號(hào)：Q93 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2395（2025）02-0416-13

0引言

作為世界上最豐富的可持續(xù)性的自然資源，木質(zhì)纖維素是化石能源的一種有前途的替代品，可以緩解化石燃料面臨的資源枯竭問(wèn)題［1］。但是木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以降解，從而限制了其開(kāi)發(fā)利用。嗜中溫厭氧纖維素降解梭菌，如Ruminiclostridium papyrosolvens （R.papyrosolvens） DSM2782［2-3］，能夠分泌高效降解纖維素的纖維素酶復(fù)合體-纖維小體（cellulosome）［4-7］。因此，闡明這類嗜中溫厭氧纖維素降解梭菌通過(guò)纖維小體降解纖維素的機(jī)制，對(duì)于通過(guò)這類纖維素降解細(xì)菌對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行有效降解并生產(chǎn)清潔能源和具有附加價(jià)值的化學(xué)品具有重要的研究意義。

另一方面，這類嗜中溫厭氧纖維素降解梭菌相對(duì)于其他致病梭菌和產(chǎn)溶劑梭菌，含有更多的生物合成基因簇。我們通過(guò)基因組分析比較發(fā)現(xiàn)纖維素降解梭菌基因組中含有編碼次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的數(shù)量遠(yuǎn)多于致病梭菌和產(chǎn)溶劑梭菌。研究人員陸續(xù)從非致病性的厭氧梭菌中發(fā)現(xiàn)了許多具有臨床價(jià)值的天然產(chǎn)物，例如從R. cellulolyticum H10 中分離出來(lái)的聚合硫酰胺化合物-Closthioamide［8-9］，是人類首次從厭氧纖維素降解梭菌中分離出來(lái)的具有抗耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌以及耐萬(wàn)古霉素的腸球菌的天然活性產(chǎn)物［10］。這一研究成果揭開(kāi)了從厭氧纖維素降解梭菌中發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物的序幕。

本研究利用二代Illumina 聯(lián)合三代PacBio測(cè)序技術(shù)對(duì)R. papyrosolvens DSM2782 進(jìn)行全基因組測(cè)序。通過(guò)COG（Cluster of OrthologousGroup）、GO（Gene Ontology）、KEGG（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes）、CAZyme 以及anti?SMASH 等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)R. papyrosolvens DSM2782進(jìn)行基因功能注釋和生物合成基因簇的預(yù)測(cè)分析，并通過(guò)非靶向代謝組學(xué)探究R. papyrosol?vens DSM2782 是否能夠產(chǎn)生具有活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。以此為深入開(kāi)展該類型的具有產(chǎn)纖維小體的木質(zhì)纖維素降解特性的厭氧梭菌產(chǎn)生具有活性的天然產(chǎn)物的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌種培養(yǎng)

本研究所用的R. papyrosolvens DSM2782來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室挑取的R. papyrosolvensDSM2782［3］單克隆菌株。先通過(guò)平板劃線法從培養(yǎng)R. papyrosolvens DSM2782 的GS-2 固體厭氧培養(yǎng)基［11］平板上挑取R. papyrosolvensDSM2782 的單克隆菌落，接種至5 mL 的GS-2液體厭氧培養(yǎng)基中，35 ℃ 培養(yǎng)1 d ，取1.5 mL菌液接種于50 mL 的GS-2 液體厭氧培養(yǎng)基中，35 ℃ 培養(yǎng)1 d ，收集菌體并放置-80 ℃ 超低溫冰箱備用。

1.1.2儀器和設(shè)備

厭氧培養(yǎng)箱，龍躍儀器設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái)，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；移液槍，艾本德國(guó)際貿(mào)易有限公司；pH計(jì)，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司；超微量紫外分光光度計(jì)，英國(guó)柏楉有限公司；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，艾本德國(guó)際貿(mào)易有限公司等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GS-2厭氧培養(yǎng)基配制

無(wú)水磷酸二氫鉀1.5g，無(wú)水磷酸氫二鉀3.8 g，尿素2.1 g，L- 半胱氨酸1.0 g，MOPs10.0g，酵母提取物6.0g，二水合檸檬酸三鈉3.0 g，六水氯化鎂1.0 g，無(wú)水氯化鈣0.11 g，七水硫酸亞鐵0.00134g，0.1% 刃天青500 μL，加入蒸餾水溶解，定容至1 000 mL，并調(diào)整pH 為7.4（固體培養(yǎng)基另需要加入瓊脂15 g）。通過(guò)厭氧培養(yǎng)箱對(duì)培養(yǎng)基溶液進(jìn)行除氧操作，待除氧完成后進(jìn)行各種規(guī)格的液體培養(yǎng)基的分裝，最后通過(guò)高壓滅菌鍋在121 ℃ 下對(duì)GS-2 厭氧培養(yǎng)基進(jìn)行20min高壓蒸汽滅菌，待液體厭氧培養(yǎng)基冷卻備用。

1.2.2 R. papyrosolvens DSM2782的DNA提取

通過(guò)FastPure Bacteria DNA Isolation MiniKit試劑盒（Vazyme）提取收集好的R. papyrosolvensDSM2782單克隆菌株的基因組DNA。使用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)提取的DNA 的純度和濃度。DNA 樣品檢測(cè)合格后，通過(guò)干冰將提取的R. papyrosolvens DSM2782基因組DNA 以及收集好的R. papyrosolvens DSM2782的菌體運(yùn)輸至派森諾生物科技有限公司（Personalbio）進(jìn)行全基因組測(cè)序。

1.2.3 R. papyrosolvens DSM2782基因組測(cè)序、質(zhì)控與組裝

使用上海派森諾生物科技股份有限公司的Illumina NovaSeq和PacBio Sequel測(cè)序平臺(tái)對(duì)R. papyrosolvens DSM2782 進(jìn)行全基因組測(cè)序，使用AdapterRemoval［12］以及SOAPec［13］對(duì)二代數(shù)據(jù)進(jìn)行清洗。同時(shí)使用Canu 軟件［14］對(duì)由PacBio 獲得的下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，得到contig 序列。將清洗后的二代高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)使用Pilon［15］軟件對(duì)通過(guò)PacBio 平臺(tái)獲取的contigs 結(jié)果進(jìn)行校正，最后使用Unicycler［16］軟件拼接得到完整的基因組序列。

1.2.4基因組序列分析

將完整的R. papyrosolvens DSM2782基因組序列上傳至NCBI（National Center for" BiotechnologyInformation）數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)自帶的注釋工具PGAP（Prokaryotic" Genome Annota?tion Pipeline）［17］對(duì)R. papyrosolvens DSM2782 完整的基因組序列進(jìn)行注釋。使用COG 數(shù)據(jù)庫(kù)［18］對(duì)R. papyrosolvens DSM2782 基因組序列進(jìn)行同源蛋白簇功能注釋；使用dbCAN3 數(shù)據(jù)庫(kù)［19］對(duì)R. papyrosolvens DSM2782 基因組序列進(jìn)行注釋；使用FastANI 軟件［20］對(duì)R. papyrosol?vens DSM2782 的基因組序列以及其他類型的梭菌基因組序列進(jìn)行對(duì)比分析，探究R. papyrosol?vens DSM2782 與參考菌株之間的同源關(guān)系。利用MCScanX［21］對(duì)R. papyrosolvens DSM2782 與R. papyrosolvens C7 進(jìn)行共線性分析，通過(guò)pfam數(shù)據(jù)庫(kù)［22］預(yù)測(cè)cohesin 和dockerin 結(jié)構(gòu)域，使用Easyfig［23］對(duì)R. papyrosolvens DSM2782 與R. pa?pyrosolvens C7 含有的纖維小體基因簇cip-cel 以及xyl-doc 進(jìn)行同源性比對(duì)分析。使用antiSMASH［24］在線預(yù)測(cè)R. papyrosolvens DSM2782 中的生物合成基因簇，并統(tǒng)計(jì)R. papyrosolvensDSM2782 基因組中存在的生物合成基因簇。最后，將在不同碳源下培養(yǎng)的R. papyrosolvensDSM2782 的發(fā)酵液通過(guò)Vanquish（Thermo" FisherScientific）超高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)WatersACQUITY UPLC BEH Amide （2.1 mm ×100 mm， 1.7 μm）色譜柱以及Phenomenex KinetexC18 （2.1 mm×100 mm 2.6 μm）色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離，進(jìn)樣體積均為2 μL。使用Xcalibur 軟件控制Orbitrap Exploris 120 質(zhì)譜儀進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。使用ProreoWizard軟件將質(zhì)譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)成mzXML 格式，與BiotreeDB 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，得到代謝物的鑒定結(jié)果和相對(duì)定量值。從而探究不同的碳源是否能夠誘導(dǎo)R. papyrosolvens DSM2782 合成具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

2結(jié)果

2.1 R. papyrosolvensDSM2782基因組組裝結(jié)果和基因組分析

利用Illumina NovaSeq 二代測(cè)序技術(shù)和PacBio Sequel 三代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的測(cè)序方式對(duì)R. papyrosolvens DSM2782 進(jìn)行測(cè)序（表1），通過(guò)Illumina NovaSeq二代測(cè)序技術(shù)共得到6893190條讀長(zhǎng)（reads），總計(jì)1033978500bp。通過(guò)PacBio Sequel 三代測(cè)序技術(shù)共得到196472條reads，總計(jì)1947591954 bp，Reads N90為7187bp，reads N50 為10 890 bp。將測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)過(guò)濾分析過(guò)濾掉0.75% 的低質(zhì)量reads 之后，最終得到高質(zhì)量的堿基1016433614bp?；贗llumina 平臺(tái)的二代測(cè)序結(jié)果和PacBio 平臺(tái)的三代測(cè)序結(jié)果對(duì)R. papy?rosolvens DSM2782 的Clean Data 進(jìn)行組裝，最終得到一條全長(zhǎng)為5027861bp 的環(huán)狀基因組序列，GC 含量為37.1%（圖1）。將所得的R. pa?pyrosolvens DSM2782 完整的基因組序列上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得GenBank 登錄號(hào)為CP119677.1?；蜃⑨尳Y(jié)果顯示R. papyrosol?vens DSM2782 的蛋白編碼基因數(shù)量為4 274 個(gè)，此外還注釋R. papyrosolvens DSM2782 含有4 個(gè)ncRNA、24 個(gè)rRNA 和62 個(gè)tRNA。

2.2 COG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果分析

在R. papyrosolvens DSM2782基因組中，一共有3503個(gè)基因在COG 數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋（圖2）。結(jié)果顯示在R. papyrosolvens DSM2782 中共存在4 大類、22 小類功能基因。其中未知功能（S）最多，占總數(shù)的19.13%。其他功能主要集中在轉(zhuǎn)錄（K，9.53%）、碳水化合物的運(yùn)輸和代謝（G，7.83%）、氨基酸運(yùn)輸和代謝（E，6.66%）、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換（C，6.31%）、復(fù)制、重組和修飾（L，6.29%）、無(wú)機(jī)離子運(yùn)輸和代謝（P，5.29%）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（T，5.21%）、細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生（M，5.15%）、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生（J，5.05%）、輔酶運(yùn)輸和代謝（H，4.48%）等方面。特別地，在R. papyrosol?vens" DSM2782 基因組中，注釋為轉(zhuǎn)錄功能的基因數(shù)量有353個(gè)，說(shuō)明R. papyrosolvensDSM2782 能夠較好地適應(yīng)外界環(huán)境的變化。此外，碳水化合物的運(yùn)輸和代謝功能基因有290 個(gè)，反映其具有高效降解木質(zhì)纖維素的能力。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)R. papyrosolvens DSM2782 在細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的生物反應(yīng)方面有191 個(gè)基因得到注釋，暗示R. papyrosolvens DSM2782 具有生成生物膜的能力。

2.3GO注釋結(jié)果分析

通過(guò)GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)R. papyrosolvens DSM2782全基因組進(jìn)行注釋（圖3）。結(jié)果顯示在生物學(xué)過(guò)程中，共有1 134 個(gè)基因被注釋到，translation以及carbohydrate metabolic process 擁有最多的基因注釋數(shù)量，分別為57、50 個(gè)，表明R. papy?rosolvens DSM2782自身的復(fù)雜性以及碳代謝的多樣性。在細(xì)胞組分中，有346 個(gè)基因被注釋到，membrane 以及cytoplasm 占主導(dǎo)地位，分別為77、50個(gè)，表明其在物質(zhì)的結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)和催化上都有較強(qiáng)的能力。在分子功能中，有1485個(gè)基因被注釋到，這個(gè)數(shù)值在該大類甚至在整個(gè)注釋結(jié)果中數(shù)量都是最多的，其中ATP binding、DNA binding以及hydrolase activity， hydrolyzingO-glycosyl" compounds 的數(shù)量分別為92、72和60個(gè)，顯示出該菌的蛋白功能主要表現(xiàn)在細(xì)胞組成、遺傳信息調(diào)控和能量代謝等方面，反映出R. papyrosolvens DSM2782的生物活躍性。

2.4KEGG注釋結(jié)果分析

通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)R. papyrosolvensDSM2782 全基因組序列進(jìn)行注釋，共發(fā)現(xiàn)7 大類功能基因（圖4）。在注釋的代謝途徑中，最主要的途徑是氨基酸代謝、蔗糖和淀粉代謝以及丙酮酸代謝等，其中，蔗糖和淀粉代謝途徑中的內(nèi)切葡聚糖酶能夠?qū)⒗w維素降解為纖維二糖，這表明R. papyrosolvens DSM2782 具有降解木質(zhì)纖維素的潛力。在細(xì)胞過(guò)程中，關(guān)于Transporters 的基因注釋數(shù)量最多，有365 個(gè)，Two-component system 為189 個(gè)，ABC transporters為162 個(gè)，同時(shí)Ribosome 也有108 個(gè)基因注釋數(shù)量，表明R. papyrosolvens DSM2782 能夠利用多種類型的ABC 物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化。另外，R. papyrosolvens DSM2782 在Enzymeswith EC numbers 方面為105 個(gè)，說(shuō)明該菌能夠充分適應(yīng)環(huán)境的變化并且同時(shí)具有較強(qiáng)的碳水化合物代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)能力。另外，有19 個(gè)基因被注釋到聚酮化合物合成酶基因途徑，推測(cè)這些基因和R. papyrosolvens DSM2782 能夠產(chǎn)生生物活性物質(zhì)有關(guān)。

2.5 CAZy注釋結(jié)果分析

碳水化合物活性水解酶能夠參與各種碳水化合物的分解代謝，R. papyrosolvens" DSM2782的KEGG代謝通路分類結(jié)果顯示注釋到碳水化合物代謝通路下的功能基因數(shù)目最多。碳水化合物活性水解酶數(shù)據(jù)庫(kù)（CAZy）是關(guān)于能夠合成或分解復(fù)雜碳水化合物的數(shù)據(jù)庫(kù)，主要包括糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases， GHs）、糖基轉(zhuǎn)移酶（Glycosyltransferases， GTs）、多糖裂解酶（Polysaccharide Lyases， PLs）、碳水化合物酯酶（Carbohydrate Esterases， CEs）、輔助活性酶類（Auxiliary Activities，AAs）和碳水化合物結(jié)合模塊（Carbohydrate binding modules， CBMs）這6類能催化碳水化合物降解、修飾以及生物合成的相關(guān)酶系家族。結(jié)果表明在R. papyrosolvensDSM2782的基因組中檢測(cè)到231個(gè)不同的碳水化合物活性水解酶（圖5），包括56個(gè)CBM家族，23個(gè)CE家族，111個(gè)GH家族，37個(gè)GT 家族，3個(gè)PL家族以及1個(gè)AA家族。其中，GH家族數(shù)量和種類最為豐富，其中GH9、GH43、GH5、GH10 的數(shù)量分別為14、13、9、6。CBM家族中含有數(shù)量最多的種類為CBM6、CBM3、CBM9，數(shù)量分別為17、7、5。CE 家族中數(shù)量最多的分別為CE4、CE1，數(shù)量分別為8、6。此外，在GH 家族、CBM 家族、CE 家族以及PL 家族中，分別含有51、32、7、3 個(gè)纖維小體基因，相應(yīng)地在GH 家族、CBM 家族、CE 家族以及AA 家族中，分別含有60、24、16、1個(gè)游離酶基因。這些結(jié)果表明R. papyrosolvens DSM2782 擁有種類和數(shù)量豐富的纖維小體基因以及游離酶基因，能夠高效調(diào)控不同種類的碳水化合物活性水解酶的表達(dá)以此從環(huán)境中獲取營(yíng)養(yǎng)來(lái)維持自身的生命活動(dòng)。

2.6梭菌屬同源性分析

本研究對(duì)11個(gè)不同種類的梭菌屬進(jìn)行ANI分析，結(jié)果顯示（ 圖6）。R. cellobioparumDSM1351 與R. termitidis CT1112 以及R. hunga?tei DSM14427 之間同源關(guān)系最為相近，ANI 值為96.5% 以及77.5%。C. acetobutylicum ATCC824與C. cellulovorans 743B 之間同源關(guān)系最為相近，ANI 值為74.5%。R. papyrosolvens DSM2782 與R. cellulolyticum H10、R. sp. BNL1100、R. josuiJCM17888 以及R. papyrosolvens C7 之間同源關(guān)系最為相近，ANI 值分別為83.4%、88.7%、85.1以及88.4%。R. herbifermentans MA18 與R. suf?flavum DSM19573 之間同源關(guān)系最為相近，ANI值為77.6%。這些結(jié)果表明R. papyrosolvensDSM2782 與R. cellulolyticum H10、R. sp.BNL1100、R. josui JCM17888 以及R. papyrosol?vens C7 的同源性較高，同時(shí)也表明了Rumini?clostridium 與Clostridium 之間的種間差異性。

對(duì)R. papyrosolvens DSM2782 與R. papyro?solvens C7進(jìn)行基因組比較分析探究R. papyro?solvens 不同菌株之間的差異性。結(jié)果表明R.papyrosolvens DSM2782 與R. papyrosolvens C7 之間的大部分區(qū)域的序列高度同源（圖7（a））。由于R. papyrosolvens C7 基因組信息嚴(yán)重缺失，這也可能導(dǎo)致ANI 分析結(jié)果中R. papyrosolvensC7 與R. papyrosolvens DSM2782 的同源性略低于R. papyrosolvens DSM2782 與R. sp. BNL1100之間的同源性（ 圖6）。對(duì)R. papyrosolvensDSM2782 與R. papyrosolvens C7 含有的纖維小體基因簇進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)纖維素降解基因簇cip-cel 之間的基因同源性很高。但由于R. papyrosolvens C7 中降解半纖維素的基因簇xyl-doc 的信息缺失嚴(yán)重，導(dǎo)致無(wú)法準(zhǔn)確得出R. papyrosolvens DSM2782 與R. papyrosolvens C7所含有的纖維小體基因簇之間的整體同源性（ 圖7（b））。盡管如此，R. papyrosolvensDSM2782 與R. papyrosolvens C7 之間的同源性仍然高于其他類型的梭菌。

2.7 R. papyrosolvens DSM2782的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇分析結(jié)果

使用antiSMASH對(duì)R. papyrosolvens DSM2782是否含有生物合成基因簇進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明R. papyrosolvens DSM2782 基因組中含有23個(gè)生物合成基因簇，這些生物合成基因簇類型大多為編碼非核糖體肽合成酶（NRPS）、核糖體合成和翻譯修飾后的多肽（RiPP）［25］以及聚酮化合物合成酶（PKS）（表2）。其中，數(shù)量最多的生物合成基因簇編碼非核糖體肽合成酶，剩下的大多編碼核糖體合成和翻譯修飾后的多肽以及聚酮化合物合成酶等。在R. papy?rosolvens DSM2782 基因組含有的生物合成基因簇中，P0092_RS14160-P0092_RS14255 與合成Rc-AIP1 的基因簇相似性為83%［26］，P0092_RS11420-P0092_RS11760 與合成macrobrevin 的基因簇相似性為66%［27］。此外，R. papyrosolvensDSM2782 含有的大多數(shù)生物合成基因簇與anti?SMASH 數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的生物合成基因簇的相似度總體較低，暗示R. papyrosolvens DSM2782具有合成不同于現(xiàn)有生物活性化合物結(jié)構(gòu)的潛力。

2.8不同碳源培養(yǎng)下的R. papyrosolvens DSM2782代謝產(chǎn)物結(jié)果分析

使用非靶向代謝技術(shù)檢測(cè)在以纖維二糖以及秸稈為碳源培養(yǎng)下的R. papyrosolvensDSM2782產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在R. papyrosol?vens DSM2782中能檢測(cè)到具有生物活性的物質(zhì)分別有4-羥基苯甲酸、尼泊金丙酯、丁酸、阿魏酸、四氫嘧啶、去甲哈爾滿以及左旋多巴等具有不同結(jié)構(gòu)的次級(jí)代謝產(chǎn)物（表3）。研究表明這些次級(jí)代謝產(chǎn)物均具有一定的生物活性。例如，去甲哈爾滿屬于有機(jī)雜環(huán)化合物［28］，是一種很有前景的抗癌光敏劑，也能夠用作抗生素佐劑，具有增強(qiáng)常規(guī)抗生素的功效。丁酸屬于脂質(zhì)和類脂分子化合物［29］，對(duì)于宿主的健康起著非常重要的作用。阿魏酸屬于苯丙素類和聚酮類化合物［30］，是R. papyrosolvens DSM2782降解秸稈時(shí)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，能夠起到緩解血管痙攣等作用。這些結(jié)果表明R. papyrosolvensDSM2782能夠產(chǎn)生各種具有不同結(jié)構(gòu)的并且具有不同活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。這些結(jié)果將進(jìn)一步為后續(xù)研究R. papyrosolvens DSM2782 產(chǎn)生具有活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物提供更多的參考信息。

3討論與結(jié)論

本研究通過(guò)基因組二代和三代測(cè)序技術(shù)對(duì)R. papyrosolvens DSM2782 進(jìn)行全基因組測(cè)序，獲得了R. papyrosolvens DSM2782 的完整基因組序列。通過(guò)一系列生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明R. papyrosolvens DSM2782 在木質(zhì)纖維素降解方面具有很高的應(yīng)用潛力。此外，通過(guò)antiSMASH預(yù)測(cè)結(jié)果表明，在R. papyrosolvensDSM2782基因組內(nèi)還含有數(shù)量相當(dāng)豐富的生物合成基因簇，暗示其具有能夠合成有應(yīng)用價(jià)值的生物活性化合物的潛力。

通過(guò)全基因組測(cè)序與分析，表明在R. papy?rosolvens DSM2782基因組中含有數(shù)量相當(dāng)豐富的纖維小體基因以及基因簇，例如纖維小體基因簇主要為cip-cel 以及xyl-doc，數(shù)量較多的纖維小體酶為GH43、GH5、GH9等家族。其中，GH43的種類和功能較為復(fù)雜，GH5和GH9 則主要是纖維素酶，這表明R. papyrosolvensDSM2782能夠高效降解纖維素，同時(shí)也能夠降解其他種類的復(fù)雜多糖，例如半纖維素、木聚糖等。聯(lián)合基因組學(xué)結(jié)合蛋白組學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)，我們能夠探究在復(fù)雜多糖下R. papy?rosolvens DSM2782基因組中不同種類的纖維小體基因的表達(dá)變化，有望為構(gòu)建高效降解木質(zhì)纖維素的纖維小體的人工合成與應(yīng)用提供新的纖維小體酶基因。

隨著基因組測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，極大地推動(dòng)了對(duì)嗜中溫纖維素降解梭菌的基因組研究進(jìn)展。通過(guò)結(jié)合基因組挖掘、一株多種化合物（One Strain Many Compounds，OSMAC）策略［31］以及代謝組學(xué)等研究方法，能夠不斷地?cái)U(kuò)大嗜中溫纖維素降解梭菌資源庫(kù)，并在嗜中溫纖維素降解梭菌中發(fā)現(xiàn)更多的生物合成基因簇以及結(jié)構(gòu)新穎的次級(jí)代謝產(chǎn)物。通過(guò)基因編輯技術(shù)改造R. papyrosolvens DSM2782，使其在降解木質(zhì)纖維素的同時(shí)也產(chǎn)生具有活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。這樣不僅能夠避免因?yàn)槟举|(zhì)纖維素難以降解造成資源的浪費(fèi)，而且還能夠進(jìn)一步豐富微生物天然產(chǎn)物資源庫(kù)及合成途徑。這將極大地?cái)U(kuò)展嗜中溫纖維素降解梭菌的應(yīng)用范圍。因此，對(duì)于通過(guò)OSMAC策略是否能夠誘導(dǎo)R. pa?pyrosolvens DSM2782產(chǎn)生具有生物活性的化合物還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。此外還需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究如何激活在實(shí)驗(yàn)室條件下R. papyrosol?vens DSM2782基因組中沉默的生物合成基因簇，從而開(kāi)發(fā)R. papyrosolvens" DSM2782產(chǎn)生具有活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛力。

綜上所述，本研究利用全基因組測(cè)序技術(shù)首次揭示了R. papyrosolvens DSM2782作為嗜中溫纖維素降解菌株以及其本身含有數(shù)量和種類豐富的生物合成基因簇的特點(diǎn)，表明其作為嗜中溫厭氧纖維素降解梭菌不僅能夠應(yīng)用于纖維素降解，而且還具有產(chǎn)生有活性的天然產(chǎn)物的潛力的雙重研究提供了科學(xué)的理論依據(jù)。