高密度培養工藝對質粒菌質粒產量的影響

［摘 要］ 為通過優化質粒pUC57的復制起始位點，提高其在宿主菌中的拷貝數，利用隨機突變PCR技術對質粒pUC57的復制起始位點進行了定向突變，發現突變后的質粒pUC57-Mu-Ori-kana（Mu代表突變）顯示更高的拷貝數。采用分子克隆技術中的同源重組方法，將pUC57-Mu-Ori-kana作為載體，連接新的目的基因片段。通過使用商品化感受態細胞DH10B對質粒進行轉化，發現質粒產量顯著提升。經過傳代穩定性驗證，進一步在生物反應器中使用改良的MLB培養基對新質粒菌進行放大培養。最終，從發酵罐中取得的樣本顯示，質粒的終產量可達到600 mg/L。突變后的復制起始位點顯著提升了質粒的拷貝數，挑取陽性單克隆測序，最終獲得了兩個不同的質粒目的片段序列。通過同源重組技術，將突變后的片段和未突變的片段與原始載體連接起來，對比發現，在相同的轉化情況和提取工藝條件下，pUC57-Mu-Ori-kana提取量是原始pUC57-kana的1.5倍。此外，DH10B-pUC57-Mu-Ori-kana在生物反應器放大培養后，也得到了令人滿意的產量。

［關鍵詞］ 復制起始位點； 質?？截悢?； 生物反應器

［中圖分類號］ R153 ［文獻標識碼］ A

質粒生產的上游技術對其終產量具有顯著影響，涉及多個關鍵因素，這些因素包括質粒的高拷貝數性質、質粒的復制起始位點、質粒的啟動子選擇、不同類型的大腸桿菌感受態以及同一大腸桿菌菌種中個體（即單菌落）之間容納質粒的情況等。在生物反應器中，培養方式、培養條件以及誘導方式對于質粒產量的提升尤為重要。

以往的研究多集中于探索大腸桿菌菌株的生長策略，而非菌株優化[1]。本實驗選用高拷貝pUC類型質粒中pUC57質粒，主要原因是質粒pUC57是pUC系列中堿基最少的質粒，便于目的片段的重組。用于DNA疫苗的質粒通常為高拷貝質粒的衍生物，其存在拷貝數的調控突變，這種突變常常存在于質粒的復制起始位點上，如缺失引物基因抑制物[2]或者點突變G→A[3-4]。在啟動子方面，采用CMV強啟動子以提高質粒終產量。在選擇大腸桿菌感受態時，通過比較實驗室中各類型感受態轉化后的產量，最終選用DH10B感受態。通過質粒菌傳代穩定性驗證，得到產量高、傳代穩定的質粒用于進一步的生物反應器培養。優化了LB培養基和發酵策略，使用生物反應器獲得大量優質且穩定的質粒菌，為下游實驗打下基礎。

質粒發酵旨在實現高生物量和高質粒產量，以提高純化效率[5-6]。這在質粒DNA疫苗的生產中尤其重要，因為可能需要相對較大的劑量[7-8]。補料分批發酵是高細胞密度培養的首選方法[9]，在獲得比搖瓶或發酵罐分批培養更高的特定質粒產量方面也是有用的，因為細胞的特定生長速度可以通過控制營養飼料速率來限制。通常，較低的生長速率會導致質粒拷貝數增加[10-13]。

1 實驗材料

1.1 實驗試劑與耗材

實驗相關試劑及耗材見表1、表2。

1.2 實驗配方

1.2.1 痕量元素 1.2 mol/L濃鹽酸、27 g/L FeCl3·6H2O、2 g/L ZnCl2、2 g/L CoCl2· 6H2O、2 g/L Na22MoO2· 2H22O、1 g/L CaCl2· 2H2O、0.5 g/L H3BO4、1.3 g/L CuCl2·2H2O。

1.2.2 MLB（Modified LB）液體培養基 稱取30 g胰蛋白胨，45 g酵母粉，15 g NaCl和15 g K2HPO4，15 g甘油，加3 L注射水，充分溶解。121℃高壓滅菌30 min，滅菌后加入10 mmol/L MgSO4和1 mL痕量元素。

2 實驗方法

2.1 pUC57-Mu-Ori-kana突變復制起始位點基因的制備

利用隨機突變試劑盒易錯PCR的特性， 將質粒 pUC57-kana 上的復制起始位點為目的片段進行擴增， 擴增的片段有一定概率會發生突變。 目的基因中引入隨機突變可能會導致蛋白水平上氨基酸的突變， 最終影響質?？截悢担?既可能導致拷貝數提升， 也可能造成拷貝數降低， 具體隨機突變PCR反應見表3。 反應程序為：

94℃ 預變性3 min → 94℃變性30 s →55℃退火30 s → 72℃延伸40 s → 反應循環30次 → 72℃徹底延伸10 min后置于4℃保存。

2.2 qPCR檢測pUC57-Mu-Ori-kana菌液拷貝數

為探索菌液OD600在0.4～0.8時與CT值正相關性，以pUC57-kana標準質粒作為對照。將10個單克隆菌株移植至10 mL LB的培養基中，并添加10 μL的卡那霉素（50 μg/μL），然后，將培養基置于37℃、200 r/min的恒溫振蕩條件下進行培養。培養6 h后，取出菌液進行OD值測定，每隔0.5 h測量一次。當OD值在0.4～0.8之間，則立即將其轉移到超凈工作臺進行qPCR檢測。qPCR反應體系詳見表4。反應程序為：95℃預變性1 min→95℃變性15 s→60℃采集熒光信號30 s→反應循環40次。

2.3 質粒菌傳代穩定性驗證

由于同種感受態細胞轉化后的菌落間存在個體差異，且每個菌落對質粒的容納量不同，加之質粒對宿主構成負荷，大腸桿菌在傳代過程中為滿足自身生長可能會將質粒棄去。為判斷大腸桿菌是否會發生以上情況，將搖混的質粒菌分別涂布在含對應抗性和無抗性的平板上，若大腸桿菌無法在抗性板上生長的，則表明質粒丟失。通過此方法，經過4輪傳代，最終篩選出傳代穩定、超螺旋比例高、拷貝數高的質粒菌，作為適合大規模生產質粒菌的種子。

2.3.1 質粒菌保菌 將40%甘油和60% LB在培養基中混合，以1∶1的體積比配制成細菌凍存液，并將其均勻倒入1.5 mL的凍存管內，然后放于-80℃的超低溫冰箱中冷凍保存。

2.3.2 質粒菌涂板 將無抗生素平皿與有抗生素平皿用直尺對半劃分為兩個區域（一半為105區域，一半為106區域），再將質粒菌用LB培養基稀釋至105和106倍，然后取50 μL菌液滴在平皿上，輕輕涂勻直至感到輕微阻力，之后轉移至37℃生化培養箱中倒置培養12～16 h。

2.3.3 比較2個平皿中菌落數 從生化培養箱中取出平皿，比較有抗生素平皿和無抗生素平皿中的菌落數，判定標準為：有抗生素平皿中的菌落數≥（0.75×無抗生素平皿中的菌落數），表示質粒菌傳代穩定性良好。反之，傳代穩定性較差，應舍去該質粒菌。

2.3.4 第1輪傳代穩定性驗證 上述步驟僅代表1輪質粒菌傳代穩定性驗證。為確保完全得到傳代穩定的質粒菌，還需重復3輪穩定性驗證。

2.3.5 第4輪傳代穩定性驗證 最終選取第4輪中質粒濃度高且滿足有抗生素平皿中的菌落數≥（0.75×無抗生素平皿中的菌落數）條件的質粒菌，作為本次篩選的穩定性良好的質粒菌。

2.4 生物反應器培養質粒菌

傳代穩定的DH10B-pUC57-Mu4-Ori-CMV-CD3/PDL1-BsAb-kana質粒菌能夠確保超螺旋比例和質粒產量，這對于大批量生產質粒菌以進行后續純化至關重要，同時也為臨床前和臨床研究提供大量質粒。

2.4.1 罐前準備工作 在反應器完成滅菌并連接至控制系統后，通入冷凝水，啟動攪拌器200 r/min，先使反應器降溫，打開空氣壓縮機，設定系統通氣量3 L/h，至少通入空氣2 h以確保系統穩定。

2.4.2 質粒菌接種 當溫度降低至30℃且通入空氣超過2 h后，校準溶氧電極DO（溶氧）100%，取出約200 mL培養基，用于后續測定OD600值與質粒濃度。將搖床培養的質粒菌按1∶1000的比例接入反應器中，加入預先過濾好的硫酸鎂、鹽酸硫銨、微量元素、抗生素和消泡劑。連接NaOH堿泵以控制pH在7.0左右，并打開控制系統，記錄本次運行起始時間（00：00）。在控制面板上，打開DO控制策略，選擇“DO+攪拌+通氧”的串級功能。

2.4.3 30℃發酵與補料 嚴格控制發酵溫度在30℃。盡管此時質粒菌生長速度緩慢，但不會發生因滿足菌株生長而質粒丟失的現象。由于質粒菌生長過程中代謝物呈酸性，會持續消耗堿，而基礎培養基的營養有限，因此在接種8～11 h時可能會出現pH升高的現象。此時，需要連接補料瓶至補料泵進行補料，并用紫外分光光度計每隔1 h測量其OD600值（即在波長600 nm下菌液的吸光度）。

2.4.4 42℃誘導發酵 持續測量OD600值，直至其達到15～20。然后，調節系統溫度至42℃。這一溫度有利于質粒菌的高密度生長，但此階段時間不宜過長，以免菌株加速衰老死亡；也不宜過短，以免影響致菌液密度和質粒終濃度。42℃誘導時間應盡量控制在補料后12～16 h。

2.4.5 收集菌液在下罐之前3 h，每小時使用Vazyme小提質粒試劑盒對樣品進行提取，并密切關注提取物的濃度變化。一旦發現提取物濃度有明顯的下降，應立即停止提取。

3 實驗結果

3.1 載體片段與目的片段電泳分析

以質粒pUC57-kana為模板，通過PCR擴增去除了質粒復制起始位點的片段，并采用1%瓊脂糖電泳來檢測PCR擴增條帶。如圖1a所示，第1泳道為空載體，第2泳道為隨機突變的質粒復制起始位點的目的片段，理論上，空載體大小為2002 bp，而突變后的質粒復制起始位點大小為589 bp左右，電泳結果與理論預測相符。未突變的質粒復制起始位點的PCR結果如圖1b所示，其大小也為589 bp，與電泳結果相符。

3.2重組產物轉化及電泳分析

重組產物是通過突變的質粒復制起始位點，與載體pUC57-kana空載體的同源重組而得到的，而對照組則是由PCR產物的質粒復制起始位點與載體pUC57-kana空載體同源重組而成。空載體pUC57-kana轉化作為重組產物轉化的陰性對照。經過篩選，挑選了10個未突變和10個突變的單克隆菌落接種擴培，并提取質粒后電泳分析（圖2）。

3.3 qPCR檢測菌液拷貝數、OD值與CT值間的關系

以標準質粒pUC57-kana作為標準品，根據下式計算質?？截悢担?/p>

θ=6.02×1023×cDNA（bp數）×660×10-9

式中：θ為質?？截悢担–opies）；c為質粒濃度（ng/μL）。

經計算，得出的結果是8.0×1011。將質粒拷貝數稀釋至不同濃度8×108、8×107、8×106、8×105、8×104、8×103，做成標準曲線（圖3）。挑選10個單克隆，擴培后控制OD600在0.4～0.8范圍內，測定這10種菌液的CT值，并繪制曲線（圖4）。利用理論OD600值代入曲線計算出理論CT值（表5），CT值越低，表示循環數越小，質粒拷貝數越高。最終，選擇拷貝數高的質粒菌——4號與10號單克隆。

3.4 質粒菌傳代穩定性驗證

對質粒菌進行4輪傳代穩定性驗證，從最初挑選的20個單克隆菌落中篩選出3個優質的單克隆。將這些菌落對應的凍存菌復蘇并進行3輪擴培，使其活化，以獲得最佳的大規模培養效果。四輪傳代穩定性驗證結果如圖5所示。

3.5 質粒菌高密度培養

在0：00時將質粒菌接種至生物反應器中，在30℃培養，11：00開始補料，并且在42℃下誘導大腸桿菌擴增質粒。圖6顯示了發酵過程中質粒產量、OD600及濕菌重的變化，在發酵25 h時，質粒產量達到最高值602.8 mg/L，此時的OD600為55.68，濕菌重為139.38 g/L?？梢园l現，OD600和濕菌重不能完全作為質粒產量的評判標準，尤其是在發酵后期，由于罐體體積限制和營養物質供應不足，會導致菌體的死亡，從而影響OD600和濕菌重的準確性。

從每小時對應的質粒電泳圖（圖7），可以發現質粒條帶由暗變亮再變暗。0：00時的樣本為50 mL離心管擴培的質粒菌，11：00—36：00時的質粒菌均為稀釋50倍后提取的質粒，因此條帶沒有0：00時的亮。

4 結論

本文驗證了質粒菌生長過程中的一個關鍵問題： 質粒對質粒菌構成負擔， 可能導致質粒丟失， 從而使得提取的質粒量顯著降低。 為避免此情況的發生， 通過傳代穩定性驗證篩選出了優勢菌并將其保留下來。 此外， 本文還考察了不同感受態細胞在質粒提取上的差異， 并從中選擇出適用于質粒提取的最優感受態細胞。 在同種感受態細胞中， 筆者也發現了其存在質粒提取的個體差異， 并從中選出了最適合質粒提取的最優單克隆質粒菌。 進一步地， 將保留的優質單克隆質粒菌進行3輪接種， 并轉移至5 L生物反應器擴培。結果表明， 其最高收率可達到600 mg/L左右， 發酵后的菌體數量眾多， 濃度高， 這為后續的生產和純化提供了高質量的原料。

［ 參 考 文 獻 ］

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High Density Culture Technology of Plasmid Bacteria

ZHANG Le， WANG Runyang， SHI Xiaotai， HU Han， WANG Yang， LIU Binlei

（School of Biological Engineering and Food， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068， China）

Abstract： This study first mutated the replication origin of plasmid pUC57 using a random mutation PCR kit， and found that the plasmid copy number of the mutated pUC57 Mu Ori kana （Mu： Mutation） increased. Using molecular cloning technique homologous recombination， plasmid pUC57 Mu Ori kana was used as a vector to connect new target fragments. The plasmid was transformed using commercialized competent cells DH10B and found that the plasmid yield increased. After the stability verification of the new plasmid bacteria through passage， the bioreactor and modified MLB medium were used for amplification culture. Finally， the bacterial liquid in the fermenter was sampled， and the final yield of plasmid in the tank reached 600 mg/L. By mutating the replication origin， the copy number of plasmid was increased， and positive single clones were selected for sequencing. Two different plasmid target fragment sequences were obtained. The mutated and unmutated fragments were connected with the original vector by homologous recombination method. Under the same transformation condition and extraction process， the extraction amount of plasmid pUC57 Mu Ori kana was 1.5 times that of original plasmid pUC57 kana. After amplifying culture of plasmid bacteria DH10B pUC57 Mu Ori kana in bioreactor， a good yield was also obtained.

Keywords： replication origin; plasmid copy number; bioreactor

［責任編校： 張 眾］

［收稿日期］ 2023-03-13

［第一作者］ 張 樂（1998—）， 男， 湖北武漢人， 湖北工業大學碩士研究生， 研究方向為生物工程。

［通信作者］ 劉濱磊（1962—）， 男， 湖北武漢人， 湖北工業大學教授， 研究方向為生物制藥。