黑龍江省天然黃檗種群遺傳多樣性SSR分析

摘要：" 為明確黑龍江省黃檗天然種群的遺傳分化機(jī)制，揭示不同地區(qū)黃檗天然種群的遺傳關(guān)系，本研究利用 SSR 分子標(biāo)記對325份來自黑龍江省的黃檗群體進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，黃檗期望雜合度（He）為0.481，觀測雜合度（Ho）為 0.422，信息指數(shù)（I）為0.965，說明黃檗遺傳多樣性較高，遺傳分化系數(shù)為 Fst=0.067，說明遺傳分化水平也處于較高狀態(tài)，AMOVA分析顯示，黃檗遺傳變異中4%發(fā)生在種群間，83%發(fā)生在個體間，說明種間變異小；對黃檗14個種群遺傳結(jié)構(gòu)分析，遺傳分化系數(shù)p=0.031＜0.05，說明黃檗分布在不同種群之間存在顯著的遺傳分化。

關(guān)鍵詞：" 黃檗； 遺傳多樣性； SSR分析

中圖分類號：" "Q 792. 31" " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：" "A" " " " " " " " 文章編號：１００1 － 9499（２０25）02 － 0014 － 05

SSR Analysis of Genetic Diversity of Natural Phellodendron

amurense Populations in Heilongjiang Province

YUAN Xianlei WANG Yutong ZHOU Zhijun LIU Zhongling ZHANG Jianying**

（Heilongjiang Academy of Forestry，" Heilongjiang Harbin 150081）

Abstract In order to clarify the genetic differentiation mechanism of natural Phellodendron amurense populations and to reveal the genetic relationship of natural Phellodendron amurense populations in different regions， this study analyzed the genetic diversity and genetic structure of 325 Phellodendron amurense populations from Heilongjiang Province using SSR molecular markers. The results showed that the expected heterozygosity （He） of Phellodendron amurense was 0.481， the observed heterozygosity （Ho） was 0.422， and the information index （I） was 0.965， indicating that the genetic diversity of Phellodendron amurense was high. 0.965， indicating that Phellodendron amurense has high genetic diversity， and the coefficient of genetic differentiation is Fst=0.067， indicating that the level of genetic differentiation is also in a high state. AMOVA analysis showed that 4% of Phellodendron amurense genetic variations occurred between populations， and 83% of the genetic variation occurred between individuals， indicating that interspecific variations were small; the analysis of 14 Phellodendron amurense populations of genetic structure， and the coefficient of genetic differentiation， P=0.031＜0.05， indicated that Phellodendron amurense was distributed in different populations. This indicates that Phellodendron amurense is distributed among different populations with significant genetic differentiation.

Key words Phellodendron amurense； genetic diversity； SSR analysis

黃檗（黃柏，黃菠蘿Phellodendron amurense）作為東北三大硬闊樹種之一，是重要的用材和藥用樹種。在用材上主要為我國東北闊葉紅松林重要的伴生喬木；在藥用上是我國傳統(tǒng)中藥黃柏藥源植物[ 1 ]。由于人類過度開發(fā)用于中藥和木材，野生黃檗種群急劇下降，遭受棲息地碎片化和喪失。因此，它被列為《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》（2021）國家二級保護(hù)植物[ 2 - 3 ]，由于過度的開發(fā)利用，黃檗這一野生植物已處于瀕危狀態(tài)，急需保護(hù)和修復(fù)。瀕危物種的長期生存幾乎完全取決于它在適應(yīng)持續(xù)的環(huán)境變化時(shí)保持足夠的遺傳變異的能力[ 4 ]。利用分子標(biāo)記估計(jì)遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)已成為瀕危物種保護(hù)的一種常見且最有效的方法[ 5 ]。

已有研究通過利用 ISSR 標(biāo)記、AFLP 標(biāo)記對黃檗的遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析[ 1 ， 6 ]。有關(guān)遺傳多樣性方面的工作較少，以至于無法提出有針對性的保護(hù)策略。SSRs（微衛(wèi)星標(biāo)記）具有共顯性、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)[ 7 - 8 ]，被廣泛用于遺傳多樣性評價(jià)和群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究。例如，AFLP標(biāo)記已經(jīng)被用來測量山毛松的遺傳多樣性[ 9 ]。簡單序列重復(fù)序列（SSR）具有高度的多態(tài)、共顯性、高重復(fù)性和廣泛的基因組覆蓋率等特點(diǎn)，已被證明是野生物種群體遺傳學(xué)研究的高效分子工具[ 10 - 11 ]。

本研究利用 SSR 分子標(biāo)記對325份來自黑龍江省地區(qū)的黃檗群體進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，揭示不同地區(qū)黃檗天然種群的遺傳關(guān)系，探討黃檗天然種群的遺傳分化機(jī)制，旨在為黑龍江省黃檗種質(zhì)資源的有效保護(hù)和高效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

根據(jù)黑龍江省山脈地理位置及森林資源調(diào)查確定了 14個有代表性的天然種群（表1）。林分要求立地較好的近熟林分，采樣時(shí)間是2023 年7月。為使樣本具有代表性，各樣本間相互距離要在 50 m以上，采集完整幼嫩葉片并使用硅膠干燥，放入冰盒后迅速轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)室，儲存到-80 ℃冰箱，待用。

1. 2 DNA提取與SSR擴(kuò)增

利用DNA試劑盒（天根）提取黃檗葉片總DNA，從黃檗的參考文獻(xiàn)中篩選26對 SSR引物[ 6 ]。本試驗(yàn)中所采用的 PCR 反應(yīng)體系：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，62～52 ℃梯度退火30 s，72℃延伸30 s，運(yùn)行10個循環(huán)；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，運(yùn)行25個循環(huán)；72 ℃延伸20 min，最后4 ℃保存。反應(yīng)在PCR（Veriti 384well，Applied Biosystem）儀進(jìn)行。PCR反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)熒光毛細(xì)管電泳（DYY-6C，北京六一）在 ABI 3730xl DNA分析儀中檢測。

1. 3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

利用GenAlEx version 6.501軟件，計(jì)算SSR位點(diǎn)和群體的各項(xiàng)遺傳多樣性指標(biāo)，包括觀測等位基因（Na）、有效等位基因（Ne）、香農(nóng)指數(shù)（I）、多態(tài)性信息指數(shù)（PIC）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和近交系數(shù)（Fis）。利用powermarker軟件計(jì)算各群體間的遺傳距離。利用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，并繪制聚類圖。利用STRUCTURE 2.3.4對325個樣本進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。根據(jù)群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，在GenAlEx version 6.501 軟件中計(jì)算各群體間和群體內(nèi)的變異、分化并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)；計(jì)算遺傳分化系數(shù)（Fst）和基因流（Nm）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 黃檗種群遺傳多樣性分析

2. 1. 1 引物多態(tài)性分析

利用 26 對 SSR 引物對黑龍江省天然林下黃檗14個種群325份樣本進(jìn)行遺傳多樣性評價(jià)，SSR引物擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性分析顯示見表2。26對SSR引物共檢測出184個等位基因（Na），平均每個位點(diǎn)等位基因數(shù)為7.0769。在擴(kuò)增出的 184個等位基因中有62.404個有效等位基因（Ne），平均每個位點(diǎn)有效等位基因數(shù)為2.4002。這表明黃檗不同種群下特異帶和種群間共有帶的某些位點(diǎn)上差異明顯。從整體來看，供試種質(zhì)的觀測雜合度（Ho）為 0.034（Par100）～0.968（Par068），平均值為0.421 7；期望雜合度（He）為 0.045（Par100）～0.869（P34-1），平均值0.481 3，兩者均值表現(xiàn)為 Holt;He，說明供試種質(zhì)之間存在一定程度的近交現(xiàn)象，導(dǎo)致純合子過量。Shannon′s信息指數(shù)（I）為0.109（Par100）～2.391（P34" -1），平均值0.9649。引物多態(tài)性信息含量（PIC）為0.044（Par100）～0.857（P34-1），平均值0.4355，其中 PICgt;0.5 的高多態(tài)性位點(diǎn)有13個，0.25lt;PIClt;0.5的中度多態(tài)性位點(diǎn)有7個；PIClt;0.25的低度多態(tài)性位點(diǎn)有3個。這表明這26對SSR引物在黃檗上有較高水平的擴(kuò)增位點(diǎn)多態(tài)性不同SSR位點(diǎn)的多態(tài)性有明顯差異。遺傳分化系數(shù)（Fst）范圍為 0.220～0.005。基因流 （Nm）范圍為48.478～0.886。

2. 1. 2 種群的分子方差分析

為確定14個天然種群的變異特征，遺傳分子變異分析顯示（表3），黃檗自然種群間遺傳分化系數(shù)Fst為0.043，總遺傳變異中有83%變異存在于個體內(nèi)，種群間遺傳變異的發(fā)生率僅為4%，且種群內(nèi)和種群間差異均極顯著（Plt;0.001）。分子方差分析是一種通過進(jìn)化距離來度量并計(jì)算單倍型（或基因型）間遺傳變異的方法。分子方差分析表明，4%的遺傳變異存在于居群，有96%的遺傳變異存在于個體，個體的變異是總變異的主要來源。

2. 1. 3 種群遺傳多樣性分析

遺傳多樣性結(jié)果（表4）表明，等位基因數(shù)（Na）范圍為4.346（HN）～3.308（BWS）。有效等位基因數(shù)（Ne）范圍為2.428（AC）～1.859（BWS）。信息指數(shù)（I）范圍為0.937（HJY）～0.635（BWS）。觀測雜合度（Ho）范圍為0.447（HB）～0.321（BWS）。期望雜合度（He）范圍為0.504（AC）～0.344（BWS）。綜合來看，小興安嶺種群的遺傳多樣性水平最高，完達(dá)山脈種群的遺傳多樣性水平最低。

2. 2 黃檗遺傳結(jié)構(gòu)分析

2. 2. 1 種群間主成分分析

利用 GenAlEx6.5進(jìn)行主成分分析（圖1），他們在圖中的距離代表親緣關(guān)系的距離，三個坐標(biāo)的貢獻(xiàn)率分別為5.95%、4.55%和4.27%。14個種群分成2個類群：第1類群包括HJY、YC、RH、BWS共4個種群；第2類群包括 FZ、SY、HN、HB、SF、TB、DHL、AC、SHT、DJC 共 10個種群。在中心位置有高度重合，各種群間差異性小，其中HJY差異最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2. 2. 2 種群聚類分析

14個群體間遺傳距離最大為0.179" 549 （YC/HJY），最小為0.044 252 （SHT/AC），對黃檗14個種群進(jìn)行基于遺傳距離的UPGMA 聚類分析（圖2），與主成分分析結(jié)果一致。

對黃檗14個種群325份種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析（圖3，圖4）發(fā)現(xiàn)，當(dāng)K=2時(shí)，ΔK達(dá)到最大值，說明遺傳變異來源于2個基因池，可以將325份材料分為2個亞群，亞群Ⅰ、亞群Ⅱ，分別包含了158份、167份種質(zhì)。黃檗14個種群遺傳分化系數(shù)P=0.031＜0.05，表明黃檗分布在不同種群之間存在顯著的遺傳分化。

3 討 論

20世紀(jì)60年代開始東北林區(qū)長期大規(guī)模砍伐黃檗加工木材加上盜剝樹皮，野生資源遭到嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致黃檗的成林面積逐漸減少，至今種群規(guī)模未得到較好的恢復(fù)。目前野外已經(jīng)很少有成片分布的黃檗天然林[ 13 ]。分子方差分析是一種通過進(jìn)化距離來度量并計(jì)算單倍型（或基因型）間遺傳變異的方法。本研究種群AMOVA分析顯示，黃檗遺傳變異中4%的遺傳變異存在于居群，有96%的遺傳變異存在于個體，說明個體的變異是總變異的主要來源。黃檗分布區(qū)內(nèi)隨著山脈的走向的氣候條件差異顯著，尤其大興安嶺地區(qū)遺傳距離最遠(yuǎn)，黃檗天然林長勢最弱。黃檗花為單性且雌雄異株，天然黃檗的繁殖主要靠種子繁殖，并依靠鳥類的采食把種子傳播到較遠(yuǎn)的地方，通過異花授粉促進(jìn)了個體間的基因交流、增加了有效種群的大小、減少了基因漂變對遺傳結(jié)構(gòu)的改變[ 14 ]。在實(shí)地調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)，種群個體間差異很大，發(fā)現(xiàn)了個別優(yōu)良性狀或者特殊性狀的黃檗植株。這樣的黃檗個體間豐富性差異可以為遺傳改良提供了有效資源。但是，目前黃檗天然種群的更新能力極差，現(xiàn)存的黃檗種質(zhì)資源流失嚴(yán)重，相互隔離的小種群使黃檗的遺傳變異性更加減少，使這些種群也存在較高的滅絕風(fēng)險(xiǎn)。

利用SSR 熒光標(biāo)記具有構(gòu)建林木種質(zhì)分子身份證和鑒別雌雄株等優(yōu)勢[ 15 - 16 ]，本研究利用SSR熒光標(biāo)記后，從整體上看黃檗期望雜合度（He）為0.481，觀測雜合度（Ho）為 0.422，信息指數(shù)（I）為0.965，說明黃檗遺傳多樣性較高，遺傳分化系數(shù)為 Fst=0.067，遺傳分化水平也處于較高水平。有限的基因流是居群形成空間遺傳結(jié)構(gòu)的主要原因。遺傳變異對任何物種保持其進(jìn)化潛力以應(yīng)對不斷變化的環(huán)境的能力起著至關(guān)重要的作用。因此，保持遺傳變異是大多數(shù)瀕危物種保護(hù)計(jì)劃的主要目標(biāo)[ 17 - 20 ]。但基于本研究的結(jié)果，黃檗保持了較高的遺傳多樣性，所以該物種瀕臨滅絕的主要原因可能是對野生種群的過度開發(fā)，而不是缺乏整體遺傳多樣性。因此，必須制定政策，禁止在野外非法砍伐的同時(shí)提高人工栽培力度，以提高生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

參考文獻(xiàn)

［1］ 李紹臣， 李鳳明， 張立民， 等. 吉林省天然黃檗種群遺傳多樣性ISSR分析［J］. 生態(tài)學(xué)報(bào)， 2016， 36（13）： 4006 - 4012.

［2］ 傅立國. 中國珍稀瀕危保護(hù)植物名錄［M］. 北京： 科學(xué)出版社，1992.

［3］ 方文培， 張澤榮. 中國植物志： 第 52 卷： 第 2 分冊［M］. 北京：科學(xué)出版社， 1983： 94.

［4］ COTE C T. Genetic variation in rare and common plants［J］. Annu. Rev. Ecol. Syst. 2003，34（5）： 213 - 237.

［5］ GROOM M J， MEFFE G K， CARROLL C R. Principles of Conservation Biology［M］. USA： Sinauer Associates， Inc.， 2006.

［6］ 陳常美. 東北林區(qū)主要珍貴用材樹種種質(zhì)遺傳多樣性評價(jià)與保護(hù)策略［D］." 哈爾濱： 東北林業(yè)大學(xué)， 2013.

［7］ 程瑋哲， 樊軍鋒， 周永學(xué). 基于熒光 SSR 標(biāo)記的10個白楊 派種質(zhì)資源遺傳多樣性分析［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)， 2021， 36（3）：88 - 93.

［8］ 姚建忠. 中國北方青楊派楊樹遺傳多樣性研究［J］. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)， 2024， 39（2）： 79 - 84.

［9］ 閆志峰， 張本剛， 張昭， 等. 珍稀瀕危藥用植物黃檗野生種群遺傳多樣性的 AFLP 分析［J］. 生物多樣性， 2006， 14（ 6） ： 488 - 497．

［10］ LI X L， LI S C， CHU H J， et al. Genetic diversity and population structure of the endangered alpine quillwort Isoetes hypsophila （Isoetaceae） revealed by SSR analysis［J］. Biochem. Syst. Ecol. 2013，" "47（2）： 11 - 20.

［11］ MENG F J， LIU L， PENG M， et al. Genetic diversity and" population structure analysis in wild strawberry （Fragaria nubicola L.） from Motuo in Tibet Plateau based on simple sequence repeats （SSRs） ［J］. Biochem. Syst. Ecol. 2015， 63（1）： 113 - 118.

［12］ HAMRICKJL. Isozymes and the analysis of genetic structure in plant populations［J］. Plant Biology，1989（2）： 87 - 105.

［13］ 張志鵬， 張陽， 張昭. 我國黃檗野生種群生存現(xiàn)狀及化學(xué)表征研究［J］. 植物科學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 34（3）： 381 - 390.

［14］ 閆平玉， 張磊， 王佳興， 等. 紅松天然種群遺傳多樣性分析及核心種質(zhì)構(gòu)建［J］. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2024， 1 - 17.

［15］ 秦宇， 郭榮琨， 農(nóng)惠蘭. 利用SSR熒光標(biāo)記構(gòu)建山楂種質(zhì)分子身份證［J］. 園藝學(xué)報(bào)， 2024（3）： 1 - 14.

［16］ 齊鳳慧， 孫宏冉， 詹亞光. EST-SSR標(biāo)記在水曲柳雌雄鑒定中的應(yīng)用［J］. 西北植物學(xué)報(bào)， 2015， 35（3）： 472 - 479.

［17］ AVISE J C， HAMRICK J L. Conservation Genetics： Case Histo- ries from Nature［M］. New York， USA： Chapman and Hall，1996.

［18］ HAMRICK J L， GODT M J W. Effects of life history traits on" " genetic diversity in plant species［J］. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B 1996， 351（4）： 1291 - 1298.

［19］ 劉寶富. 13份油茶種質(zhì)資源的表型遺傳多樣性分析［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2022， 50（23）： 93 - 95.

［20］ 游書梅， 曹應(yīng)江， 鄭家奎， 等. 73份亞洲水稻恢復(fù)系農(nóng)藝性狀的主成分與聚類分析［J］. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2015， 16（2）： 250 - 256.