文冠果HD-Zip基因家族成員鑒定及其對鹽脅迫的響應

摘要：【目的】對文冠果同源異型域—亮氨酸拉鏈（Homedomain-leucine zipper，HD-Zip）基因家族成員進行鑒定，并分析其在鹽脅迫條件下的表達情況，為挖掘文冠果耐鹽基因及培育文冠果耐鹽新品種提供理論依據。【方法】以文冠果全基因組數據為基礎，鑒定獲得HD-Zip基因家族成員，通過生物信息學工具對HD-Zip基因家族的理化性質、保守基序、基因結構、順式作用元件、系統發育進化關系進行預測分析和雙酶切法亞細胞定位。對2個月苗齡的文冠果幼苗進行鹽脅迫處理（NaCl濃度為50、100、150 mmol/L），以NaCl濃度0 mmol/L為對照組（CK），并采用實時熒光定量PCR對文冠果鹽脅迫下根和葉HD-Zip基因家族的組織表達模式進行分析。【結果】從文冠果全基因組中共鑒定出29個HD-Zip基因家族成員，命名為XsHB1～XsHB29，除XsHB29外，XsHB1～XsHB28基因均定位到文冠果的12條染色體上。HD-Zip家族成員編碼的氨基酸數量為202～838個，分子量為23567.07～92421.90 kD，理論等電點（pI）為4.75～8.98；亞細胞定位結果顯示該家族蛋白均定位于細胞核中。系統進化發育分析將29個HD-Zip基因家族成員分為4個亞家族（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），各亞家族成員基因和蛋白結構具有相似性。通過啟動子順式作用元件預測發現，HD-Zip基因家族啟動子共有22種順式作用元件，如非生物脅迫和植物激素響應元件。實時熒光定量PCR結果顯示，50 mmol/L NaCl處理的葉片中，XsHB1、XsHB12、XsHB13和XsHB29基因的相對表達量均顯著升高（Plt;0.05，下同）；而XsHB5、XsHB12、XsHB13、XsHB24、XsHB29基因相對表達量在150 mmol/L NaCl處理后的根中均顯著下調。亞細胞定位和瞬時轉化結果顯示，XsHB5是定位于細胞核上的蛋白，能負調控文冠果耐鹽性。【結論】從文冠果基因組中鑒定出29個XsHD-Zip基因家族成員，分為4個亞家族，各亞家族成員基因和蛋白結構具有相似性。其中，XsHB1、XsHB5、XsHB12、XsHB13、XsHB24和XsHB29等基因在文冠果鹽脅迫響應中可能發揮重要作用，文冠果HD-Zip基因家族參與調控文冠果的生長發育、新陳代謝及其他應急反應過程。

關鍵詞：文冠果；HD-Zip基因家族；鹽脅迫；基因表達

中圖分類號：S685.99文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2025）02-0378-14

Identification of HD-Zip gene family members in Xanthoceras sorbifolium Bunge and their response to salt stress

ZHU Hua-li1，CHEN Yu-xia2，QIAN Cheng1，CHEN Yu-jin1，YU Han1，JIANG Tao2，LI Lu-lu1*，LU Yi-zeng3*

（1College of Landscape and Forestry，Qingdao Agricultural University/Shandong Key Laboratory for Germplasm Innova‐tion of Saline-alkaline Tolerant Grasses and Trees，Qingdao，Shandong 266109，China；2Jinan Baihe Gardening GroupCo.，Ltd.，Jinan，Shandong 250014，China；3Shandong Forest and Grass Germplasm Resources Center，Jinan，Shandong 250102，China）

Abstract：【Objective】The members of homedomain-leucine zipper（HD-Zip）gene family in Xanthoceras sorbifo-liumBunge were identified，and their expression under salt stress conditions was analyzed to provide theoretical basis for mining salt tolerant genes in X.sorbifolium and for breeding new salt tolerant varieties.【Method】Based on the whole-genome data of X.sorbifolium，the members of the HD-Zip gene family were identified.The physicochemical properties，conserved motifs，gene structures，cis-acting elements，and phylogenetic evolutionary relationships of the HD-Zip gene family were predicted and analyzed using bioinformatics tools.Subcellular localization was performed by double enzyme digestion.Two-month-old X.sorbifolium seedlings were subjected to salt stress treatments with NaCl concentrations of 50，100，and 150 mmol/L，with a control group（CK）treated with 0 mmol/L NaCl.The tissue expression patterns of HD-Zip family genes under salt stress in roots and leaves of X.sorbifolium were analyzed using real-time fluorescence quanti-tative PCR.【Result】A total of 29 HD-Zip gene family members were identified from the full genome ofX.sorbifolium，named XsHB1-XsHB29.Except for XsHB29，XsHB1-XsHB28 genes were all located on the 12 chromosomes of X.sorbifo-lium.The number of amino acids encoded by HD-Zip family members ranged from 202 to 838，with molecular weights ranging from 23567.07 to 92421.90 kD，and theoretical isoelectric points（pI）ranging from 4.75 to 8.98.Subcellular lo-calization results showed that proteins of the family were located in the nucleus.Phylogenetic analysis divided the 29 HD-Zip gene family members into 4 subfamilies（I，II，III，IV），and the genes and proteins of each subfamily member had similarities in structure.Through the prediction of cis-acting elements in the promoter，it was found that the pro-moters of HD-Zip genes family had 22 types of cis-acting elements，such as abiotic stress and plant hormone response ele-ments.Real-time fluorescence quantitative PCR results showed that the relative expression levels of XsHB1，XsHB12，XsHB13 and XsHB29 genes in leaves treated with 50 mmol/L NaCl were significantly up-regulated（Plt;0.05，the same below）；while the relative expression levels of XsHB5，XsHB12，XsHB13，XsHB24 and XsHB29 genes were signifi-cantly down-regulated after treatment with 150 mmol/L NaCl.Subcellular localization and transient transformation results showed that XsHB5 was a nuclear-localized protein and could negatively regulate the salt tolerance of X.sorbifolium.【Conclusion】A total of 29 members of XsHD-Zip gene family can be screened from X.sorbifolium，they are divided into 4 subfamilies，and the members of each subfamily have similar gene and protein structure.Among them，genes such as XsHB1，XsHB5，XsHB12，XsHB13，XsHB24 and XsHB29 may play important roles in the salt stress response ofX.sorbi-folium.The HD-Zip gene family is involved in regulating the growth，development，metabolism，and other emergency re-sponse processes ofX.sorbifolia.

Key words：Xanthoceras sorbifolium Bunge；HD-Zip gene family；salt stress；gene expression

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32201611）；Shandong Department of Natural Re-sources“Precious Tree Species Conservation and Utilization Innovation Team”Project（Luziranzi〔2023〕98）；Scientific and Technological Innovation Cooperation Project of Jinan Baihe Gardening Group Co.，Ltd.（BHYLJY-KT-24-0102）

0引言

【研究意義】文冠果（Xanthoceras sorbifolium Bunge）是無患子科文冠果屬的落葉小喬木，原產于我國北部干旱寒冷地區，具有較強的耐鹽、耐寒、耐旱等特征。文冠果種子含油率為30%～36%，種仁含油率達55%～67%，是我國北方特有的一種優良木本油料能源樹種，具有較高的生態價值和經濟價值（趙彩云等，2008）。土壤鹽堿化是當今全球性資源環境及生態問題，對區域生態環境建設有重要影響，也是影響植物生長發育和林業可持續發展的非生物脅迫因子之一（Adhikari et al.，2021；Eswar etal.，2021）。同源異型域—亮氨酸拉鏈（Homedomain-leucine zip-per，HD-Zip）蛋白是植物特有的一類轉錄因子。包含有1個高度保守的同源異型結構域（HD）和1個亮氨酸拉鏈（LZ）結構域（Ruberti etal.，1991）。HD-Zip蛋白根據基因結構域、保守基序、特異性DNA結合序列以及基因功能等，可分為4個亞家族（Ariel et al.，2007；秦永芳等，2009）。研究表明，HD-Zip基因家族廣泛參與植物的生長發育、激素信號傳導及非生物脅迫響應等生物過程（王宏等，2013）。因此，從基因組水平對文冠果HD-Zip基因家族進行系統的鑒定和分析，對于篩選具有較強抗性的文冠果優良種質以及擴大其分布范圍促進干旱區綠化和生態修復均具有重要意義。【前人研究進展】我國鹽堿地主要集中分布在華北、西北、東北及沿海地區，其面積還在不斷增加，鹽堿化程度不斷加重（胡炎等，2023），鹽堿地區綠化及造林急需選擇合適樹種（李紅霞和厙平，2021）。抗鹽植物大多具有較高的土壤改良及防風固沙等生態效益，但經濟價值較低。文冠果不僅具有較強的抗鹽能力，還具有較高的油用、藥用、茶用、工業利用及觀賞價值（敖妍等，2012；張蕓香等，2019；張璐等，2021），合理栽植文冠果可在改善地區生態環境的同時帶來較高的經濟價值。張曉燕等（2013）對陜西神木文冠果1年生幼苗的研究發現，在一定鹽脅迫范圍內，文冠果可通過調節細胞內滲透壓減緩鹽害。樊興路（2015）研究表明，輕度鹽脅迫對文冠果種子萌發和幼苗生長無顯著抑制，中度鹽脅迫下幼苗生長發育受到限制，重度鹽脅迫下文冠果幼苗短期內可存活，但無法正常生存。田吉等（2016）研究表明，鹽脅迫使文冠果種子吸水發生變化，重度脅迫下文冠果種子吸水速率降低，而輕度和中度鹽脅迫下吸水速率迅速上升。馬劍等（2018）對甘肅張掖文冠果進行研究，發現文冠果幼苗雖在高濃度鹽脅迫時受到明顯傷害，但短期內大多數幼苗仍能存活。近年來，HD-Zip基因在多種植物中有過研究，如番茄（Lin etal.，2010）、桃（Zhang et al.，2012）、大豆（Chen et al.，2014）等。HD-Zip基因在多種植物中能響應鹽脅迫，如楊樹HD-Zip基因Potri.014G103000.1能在根中響應鹽脅迫（張雪梅等，2017）；鹽脅迫下白樺多個HD-Zip家族基因（MH381401、MH381502、MH381603、MH381704、MH381805、MH381906和MH382007）的表達量出現顯著差異（王家啟等，2018）；蘋果MdHB7-like能通過促進細胞的自噬活性及Na+外排增強蘋果耐鹽性（Zhao et al.，2021）。此外，HD-Zip基因家族還可通過與脫落酸（ABA）協同作用增加植物耐鹽性。水稻Oshox22的表達受鹽脅迫和ABA的強烈誘導（張數鑫，2011）；玉米Zmhdz10基因的表達受鹽脅迫和ABA誘導，且Zmhdz10轉基因擬南芥植株對鹽脅迫的耐受性增強，同時ABA信號轉導相關基因表達也有變化，表明Zmhdz10基因通過ABA依賴的信號途徑調節植物的耐鹽性（趙陽，2013）。【本研究切入點】目前，我國許多地區已對文冠果進行引種栽培（高楠，2021），并對文冠果的植物學特性（高述民等，2002）、地理分布現狀（萬群芳等，2010）及化學成分（院軍等，2023）等進行了較成熟的研究，但尚無針對文冠果HD-Zip基因家族鑒定及其對鹽脅迫響應的研究。【擬解決的關鍵問題】利用已公布的文冠果基因組信息（羅少等，2021），對HD-Zip基因家族進行系統分析，包括家族成員理化性質、染色體定位、基因共線性、系統進化、保守基序、基因結構和啟動子順式作用元件等，并通過實時熒光定量PCR檢測不同濃度鹽脅迫下HD-Zip基因的在文冠果根系和葉片中的表達量變化，為挖掘文冠果耐鹽基因及培育文冠果耐鹽新品種提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為山東沃奇農業開發有限公司提供的山油1號文冠果種子。文冠果種子種植于青島農業大學人工培養室內。栽培條件：溫度25℃，光周期16 h光照/8 h黑暗，濕度50%～70%；基質配方為泥炭、蛭石和珍珠巖等體積混合。選取萌發2個月的文冠果幼苗進行鹽（NaCl）脅迫處理，根據前期預試驗觀察結果，設NaCl濃度分別為0、50、100和150 mmol/L，維持目標濃度4周。每處理設3個重復。處理后選取植株上第3～4節成熟的功能葉和正在伸長的根，立即用液氮速凍，于-80℃冰箱保存。

1.2 HD-Zip基因家族鑒定和理化性質分析

文冠果的參考基因組信息從NGDC數據庫（https：//ngdc.cncb.ac.cn/）獲取（BioProject：PRJNA886471），利用HMMER（http：//hmmer.org/）搜索同源結構域和亮氨酸拉鏈結構的隱馬爾可夫模型（PF03634和PF02183）文冠果HD-Zip蛋白序列。鑒定得到的文冠果HD-Zip基因家族成員按照基因位置順序依次命名（Letunic etal.，2004）。利用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）分析候選基因的氨基酸長度、相對分子量和理論等電點；通過Molecular Bioinformatics Center數據庫（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）預測文冠果HD-Zip蛋白的亞細胞定位。

1.3染色體定位和基因結構分析

從文冠果基因組中獲取HD-Zip基因家族染色體定位信息，并使用TBtools繪制染色體定位圖。將文冠果HD-Zip家族所有的基因序列和編碼序列在Gene Structure Display Server（https：//gsds.gao-lab.org/Gsds_help.php）中進行比對，對基因中外顯子和內含子進行鑒定（Hu etal.，2014）。

1.4系統發育進化樹分析

對文冠果HD-Zip家族蛋白序列進行多重比對，使用MEGA 5.0通過最大似然法（Maximum Likeli-hood，ML）構建系統發育進化樹。使用配對間隙刪除模式進行1000次重復計算子展值（Bootstrap）檢驗進化樹分支可信度（Tamura et al.，2011），分別構建包含文冠果29個HD-Zip家族蛋白的無根樹和包含擬南芥、水稻、毛果楊和文冠果4個物種HD-Zip家族所有成員的系統發育進化樹。

1.5蛋白相似性分析和啟動子順式作用元件分析

使用ClustalX 2.0對HD-Zip家族的所有成員進行多序列比對（Thompson et al.，1994），比較文冠果HD-Zip家族蛋白序列相似程度，并進一步分析該同源基因的蛋白保守結構域與HD-Zip所包含的同源異型域和亮氨酸拉鏈結構的異同。提取HD-Zip基因起始密碼子ATG前2000 bp的上游序列，利用在線啟動子分析工具PlantCARE進行分析，利用TBtools對順式調控元件位點結果進行可視化（Lescot，2002）。

1.6實時熒光定量PCR分析

使用植物總RNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取文冠果根和葉的總RNA，并反轉錄合成cDNA。根據基因序列設計熒光定量PCR引物，內參基因為文冠果GAPDH，引物序列見表1。利用ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進行實時熒光定量PCR反應。每個樣品進行3次重復，采用2?ΔΔCt相對定量法計算目的基因相對表達量（祁存英等，2023）。

1.7 XsHB5蛋白亞細胞定位

以文冠果葉片cDNA為模板克隆XsHB5基因CDS全長，利用雙酶切法將XsHB5基因連接到載體1300-XsHB5-GFP上，引物見表1。將過表達載體轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞，利用菌落PCR鑒定陽性克隆后測序進一步鑒定。將測序正確的質粒轉化到農桿菌GV3101感受態細胞，挑取陽性菌落在LB液體培養基中擴繁至OD600 nm在0.6左右，采用浸染液（MS+10 mmol/L MES+0.15 mmol/LAs+10 mmol/LMgCl2）重懸至0.8左右，室溫靜置2 h。采用注射器從本氏煙草葉片下表皮注入，25℃暗培養24 h后，置于光照下培養24 h，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 XsHB5基因功能驗證

選取20棵萌發1周、長勢一致的文冠果幼苗，采用含有pCambia1300-XsHB5-GFP質粒的根癌農桿菌介導的真空浸潤法對文冠果幼苗進行瞬時轉化，以含有pCambia1300-GFP質粒的根癌農桿菌浸染為對照組，真空浸染后暗處理3 d，置于植物培養箱中正常培養，培養條件同1.1。浸染10 d后，取成熟葉片提取RNA，反轉錄成cDNA后通過實時熒光定量PCR檢測XsHB5過表達組和對照組幼苗成熟葉片中的XsHB5基因表達量。

采用浸盆法對浸染后10 d的文冠果幼苗進行鹽脅迫處理，鹽溶液濃度為150 mmol/L。鹽脅迫處理7 d后，使用Dual-PAM-100葉綠素熒光儀（德國WALZ公司）測定文冠果幼苗葉片的PSII最大光化學效率（Fv/Fm）；參照《植物生理生化實驗原理和技術》（李合生，2000）的方法測定過氧化氫（H2O2）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和過氧化物酶（POD）活性。

2結果與分析

2.1文冠果HD-Zip基因家族的鑒定及序列分析

由表2和圖1可知，在文冠果基因組共鑒定出29個具有典型結構域的HD-Zip基因家族成員，根據文冠果HD-Zip基因家族在染色體上分布，分別命名為XsHB1～XsHB29。文冠果HD-Zip基因家族成員編碼的氨基酸數量在202～838個，分子量為23567.07～92421.90 kD，理論等電點在4.75～8.98。蛋白的總平均親/疏水性指數（GRAVY）預測均為負值，表明該家族成員均為穩定的親水性蛋白。亞細胞定位結果顯示，該家族蛋白均定位于細胞核。

2.2文冠果HD-Zip基因家族染色體定位分析

染色體定位分析結果（圖1）表明，28個文冠果HD-Zip基因家族成員在12條染色體上呈現不均勻分布，XsHB29游離在染色體外。LG3、LG5、LG6和LG14染色體上均僅有1個基因，分別是XsHB5、XsHB9、XsHB10和XsHB28；而在LG1和LG8號染色體上基因分布密度較高，各有4個基因；其他6條染色體上均分布著2～3個基因。

2.3文冠果HD-Zip家族成員系統發育分析

為探究該家族成員之間的系統進化關系，根據文冠果HD-Zip蛋白構建系統發育進化樹，結果表明，29個家族成員被聚為4個亞族（圖2）。HD-Zip I亞家族有14個成員，HD-ZipⅡ亞家族有9個成員，HD-ZipⅢ亞家族成員最少，僅有2個，HD-ZipⅣ亞家族有4個成員。

2.4文冠果HD-Zip家族蛋白結構域和保守基序分析

文冠果29個HD-Zip蛋白保守結構域比對結果如圖3所示，其中HD結構域具有高度保守性，而LZ結構域相對多變。由圖4可知，文冠果HD-Zip基因家族均具有高度保守的同源結構域和亮氨酸拉鏈結構域。文冠果HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ亞家族成員均含有START結構域，HD-Zip IV亞家族成員均含有MEKHLA，部分HD-ZipⅡ亞家族成員（XsHB4、XsHB24、XsHB29）含有HD-Zip_N結構域。蛋白保守基序分析如圖5所示，Motif 1和Motif 2是HD結構域的保守基序；而Motif 3與BRLZ結構域有關，Motif 4與HALZ結構域有關。Motif 6存在于HD-Zip_N結構域。Motif 5與MEKHLA結構域相關。結果表明，HD-ZipⅠ和HD-ZipⅡ亞家族成員除具有典型的Homeobox結構域和亮氨酸拉鏈結構域外，僅包含較少的簡單基序；而HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ亞家族成員具有較多基序，結構域也較復雜。HD-ZipⅣ亞家族Motif多集中于蛋白質的N端。

2.5文冠果HD-Zip家族基因結構分析

基因結構分析結果（圖6）表明，29個文冠果HD-Zip家族基因均有內含子，但基因結構存在明顯差異。在HD-Zip I亞家族中，除了XsHB2具有4個外顯子和XsHB7具有6個外顯子外，大多數成員具有2個或3個外顯子，該家族成員的基因結構與其他家族成員相比也較簡單。HD-ZipⅡ亞家族中大部分成員有3個或4個外顯子。HD-ZipⅢ和HD-Zip IV亞家族基因的內含子數量在10個以上。HD-ZipⅢ亞族基因（XsHB5和XsHB17）均具有17個內含子。

2.6啟動子順式作用元件預測

利用PlantCARE數據庫預測HD-Zip家族基因的啟動子序列的順式作用元件，共鑒定到22種順式作用元件（圖7）。29個HD-Zip基因家族成員均含有光響應元件（Light responsiveness）、厭氧誘導元件（Anaerobic induction）、ABA響應元件（ABRE）和MeJA響應元件（MeJA responsiveness）。此外，還有一些HD-Zip家族基因啟動子含有參與防御和應激反應的順式作用元件，如XsHB1、XsHB10、XsHB11、XsHB12、XsHB23基因；XsHB5和XsHB29基因啟動子中含有與干旱響應有關的MYB結合位點。文冠果HD-Zip家族基因啟動子中存在一些植物激素反應元件，其中XsHB13基因啟動子中有ABA響應元件。另外，文冠果HD-Zip家族基因啟動子中還發現一些與分生組織表達相關的順式調控元件、MYB結合位點、參與晝夜節律控制的順式調控元件、參與缺氧特異性誘導元件等。

2.7文冠果HD-Zip基因家族鹽脅迫表達模式分析

由于HD-Zip IV亞家族基因在植物表皮細胞中特異性表達，主要調控表皮細胞及其附屬物的發育（羅少等，2021），因此選擇7個HD-Zip I、HD-Zip II和HD-Zip III亞家族成員進行鹽脅迫下基因表達量檢測。其中5個基因的啟動子（XsHB1、XsHB5、XsHB11、XsHB12、XsHB29）中具有響應非生物脅迫的作用元件，XsHB13基因的啟動子中含有ABA響應元件（圖7）。檢測不同濃度NaCl處理后的文冠果葉片和根中的HD-Zip基因表達量，結果表明部分文冠果HD-Zip基因家族成員能響應鹽脅迫（圖8和圖9）。在50 mmol/L NaCl處理的葉片中，XsHB1、XsHB12、XsHB13、XsHB29基因相對表達量顯著上調（Plt;0.05，下同），而XsHB5和XsHB24基因相對表達量在100和150 mmol/L NaCl處理后顯著下調，XsHB11基因相對表達量在100 mmol/L NaCl處理后顯著下調（圖8）。在根組織中，NaCl處理后，XsHB1和XsHB11基因相對表達量無顯著變化（Pgt;0.05），XsHB5和XsHB13基因相對表達量在100和150 mmol/L NaCl處理后顯著下調，XsHB12、XsHB24和XsHB29基因相對表達量在150 mmol/L NaCl處理后顯著下調，下調基因的最低值均出現在150 mmol/L NaCl處理（圖9）。

2.8文冠果XsHB5蛋白的亞細胞定位

為驗證亞細胞定位預測結果，構建35S：：XsHB5-GFP載體，通過瞬時浸染本氏煙草，驗證XsHB5基因的亞細胞位置。結果顯示，對照組（35S：：GFP）綠色熒光蛋白在全細胞表達，而XsHB5-GFP融合蛋白僅在細胞核中表達，表明XsHB5蛋白定位在細胞核，與預測結果一致（圖10）。

2.9文冠果XsHB5基因功能分析

為驗證文冠果XsHB5基因功能，采用pCam-bia 1300-XsHB5-GFP載體質粒的根癌農桿菌介導的真空浸潤法對文冠果幼苗進行瞬時轉化，以轉化pCambia1300-GFP空載體的根癌農桿菌植株為對照組。在瞬時浸染第10 d時對文冠果對照組株系和轉基因株系進行150 mmol/L NaCl脅迫處理，NaCl脅迫7 d后，對照組與XsHB5過表達的文冠果均出現一定程度的葉片萎蔫，但XsHB5過表達的文冠果葉片在NaCl脅迫下萎縮更嚴重（圖11-A和圖11-B）；相比于對照組，XsHB5過表達的文冠果幼苗葉片邊緣的Fv/Fm顯著升高（圖11-C和圖11-D）；瞬轉載體注射第10 d時，過表達文冠果植株葉片中XsHB5基因表達量相比對照組顯著升高（圖11-E）；在生理指標方面，XsHB5過表達文冠果葉片的H2O2含量顯著高于對照組（圖11-F），POD活性顯著低于對照組（圖11-G），SOD活性顯著高于對照組（圖11-H）。上述結果表明，在濃度為150 mmol/L NaCl脅迫處理下，XsHB5過表達文冠果對NaCl脅迫更敏感，XsHB5基因對文冠果NaCl脅迫起負調控作用。

3討論

在植物生長發育過程中，HD-Zip基因家族在響應生物和非生物脅迫中發揮重要作用。大量研究表明，HD-Zip基因家族廣泛分布于不同植物中，雖然這類蛋白具有較高的保守性，但是蛋白種類與數量在不同的植物中呈現差異，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）HD-Zip基因家族包含48個成員（Ariel et al.，2007），水稻（Oryza sativa）中有48個成員（Aga-lou et al.，2008）；玉米（Zea mays）中有55個成員（趙陽，2013），楊樹（Populus）中有63個成員（杜久軍，2019）。文冠果HD-Zip基因家族數量顯著多于同為無患子科的龍眼HD-Zip數量（19個）（張春渝等，2019）。植物基因家族的擴展主要依賴于串聯、片段和全基因組復制等形式（Xu etal.，2012），推測可能是基因家族在擴增過程中受到基因丟失和復制的影響（姜秀明，2017）。對文冠果HD-Zip基因家族保守結構分析發現，同一亞族的成員大多具有相似的保守元件，如HD-Zip III和HD-Zip IV亞家族成員均含有Motif 4、Motif 6、Motif 7、Motif 8、Motif 9、Motif 10基序，其結構相似表明這些基因可能發揮相似功能（冉靜等，2012）。

基因的表達模式對于基因功能的研究有重要參考價值。前人研究發現，HD-ZipⅠ和HD-ZipⅡ亞家族基因的表達能被高鹽、干旱、低溫等非生物脅迫誘導，提高植物的抗逆性（Perotti etal.，2017）。如苜蓿（Medicago sativa）中HD-ZipⅡ亞家族中MtHB1基因能響應鹽脅迫（Ariel et al.，2010），水稻Oshox22的表達受鹽脅迫和ABA的強烈誘導（張數鑫，2011），表明鹽脅迫下誘導產生的ABA促進植物生長，在特定脅迫下會使基因進行過度表達。此外，文冠果XsHB11、XsHB12、XsHB29是擬南芥ATHB7的同源基因，而XsHB13是擬南芥ATHB13的同源基因，已有研究表明ATHB7和ATHB13參與調控擬南芥的耐鹽性（Cabello and Chan，2012），推測這些基因可能也參與調節文冠果耐鹽性。基因的表達模式對于基因功能的研究有重要參考價值。在文冠果中，XsHB1、XsHB12、XsHB13、XsHB29均屬于HD-Zip I亞家族，且系統進化關系較近，這些基因在50 mmol/L NaCl處理的葉中均上調表達，表明這些基因在調控文冠果耐鹽性中可能具有重要作用。陸地棉（Gos-sypium hirsutum）GhHDZ146基因參與調控鹽脅迫反應（吳翠翠和肖水平，2024），其與擬南芥AtHB13和文冠果XsHB13基因親緣關系較近。XsHB13基因在50 mmol/L NaCl處理后表達量上調，表明其可能參與調控鹽脅迫響應。擬南芥ATHB7基因和楊樹PtrHB7a/b基因在鹽脅迫響應中起重要作用（楊卓然，2022）。文冠果XsHB29基因與ATHB7和PtrHB7a/b基因具有較強的同源性，其表達量在50 mmol/L NaCl處理的葉片中顯著升高，推測其可能參與調控文冠果鹽脅迫響應過程。

啟動子順式元件會影響基因的調控（高永峰等，2018）。有研究表明，HD-Zip基因家族中部分成員能與ABRE元件結合，通過ABA依賴途徑調節下游靶基因的表達，增強植物對水分脅迫的耐受性（Yoshida et al.，2010）。本研究發現，11個文冠果基因啟動子含有ABA響應元件，其中XsHB1和XsHB12基因的表達在鹽脅迫下顯著升高，推測其可能通過響應ABA參與調控文冠果耐鹽性。

前人研究結果表明HD-Zip III基因能調控植物多種非生物脅迫，如水稻OsHB4基因通過調節葉片細胞壁和維管的發育，參與植物的卷葉機制，從而增強水稻對干旱脅迫的耐受性（Zhang et al.，2018）；在冷脅迫下，菖蒲（Acorus calamus）葉片和根系中的HD-ZipⅢ亞族基因DACA002429均下調，可能起負調控作用（Zhang et al.，2024）。在鹽脅迫下，植物HD-Zip III亞家族基因表達量改變，如苜蓿幼苗中MtHDZ5、MtHDZ13和MtHDZ22基因在180和200 mmol/L NaCl脅迫下的表達量顯著降低（Li et al.，2020）。本研究也得出與前人相似的結論，文冠果HD-Zip III基因XsHB5在100和150 mmol/L NaCl脅迫下的表達量均顯著降低。通過在文冠果幼苗中瞬時過表達XsHB5基因，鹽脅迫下過表達植株的耐鹽性顯著降低，表明XsHB5基因能負調控文冠果耐鹽性。

4結論

本研究從文冠果基因組中鑒定出29個HD-Zip基因家族成員，分為4個亞家族，各亞家族成員基因和蛋白結構具有相似性。其中，XsHB1、XsHB5、XsHB12、XsHB13、XsHB24和XsHB29等基因可能在文冠果鹽脅迫響應中發揮重要作用，文冠果HD-Zip基因家族參與調控文冠果的生長發育、新陳代謝及其他應急反應過程。

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（責任編輯：王暉）