龍牙百合LbAGPS1基因克隆與表達分析

摘要：【目的】克隆龍牙百合腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）小亞基編碼基因（LbAGPS1），并分析其表達模式，為通過調節該基因表達進而促進百合鱗莖淀粉合成積累及膨大發育提供理論依據。【方法】利用同源克隆技術從龍牙百合組培苗幼嫩葉片中克隆到LbAGPS1基因，對其進行生物信息學分析及亞細胞定位；采用熒光定量PCR技術對LbAGPS1基因在龍牙百合葉片、鱗片、鱗莖盤等組織部位的表達差異進行分析。【結果】LbAGPS1基因包含1個完整的長度為1569 bp的開放閱讀框（ORF），編碼1個由522個氨基酸組成的親水性蛋白，二級結構由α-螺旋（23.56%）、β-折疊（20.12%）、無規則卷曲（50.38%）、β-轉角（5.94%）組成；LbAGPS1蛋白具有葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉移酶特征結構，屬于cl33437家族蛋白，具有PLN02241、GlgC保守結構域及9個低聚物界面特征與10個配體結合位點。系統發育分析結果表明，LbAGPS1蛋白與亞洲百合AGPase蛋白小亞基具有較近的親緣關系。亞細胞定位結果顯示，LbAGPS1蛋白在煙草葉片中的表達主要定位于葉綠體；實時熒光定量PCR結果顯示，LbAGPS1基因主要在龍牙百合的鱗莖中表達，其相對表達量顯著高于葉片與鱗莖盤的相對表達量，鱗莖中又以內部鱗片相對表達量最高，其次為中部、外部鱗片。【結論】LbAGPS1基因編碼蛋白含有cl33437家族PLN02241、GlgC保守結構域及特征位點，主要在鱗莖的鱗片發育過程中表達，具有明顯的組織表達特異性。

關鍵詞：龍牙百合；LbAGPS1；淀粉；腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶；基因表達

中圖分類號：S644.1文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2025）02-0452-10

Cloning and expression analysis of LbAGPS1 gene in Lilium brownii var.Viridulum

ZHANG Jin-zhong1，2，3，LI Chao-sheng3，WEI Li-ping3，CHEN Cui-yun2，LIU Cui-hua2，SUN Jia-man2*

（1Guangzhou Academy of Agricultural and Rural Sciences，Guangzhou，Guangdong 510335，China；2School of LifeSciences，Jiaying University，Meizhou，Guangdong 514015，China；3Biotechnology Research Institute，GuangxiAcademy of Agricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007，China）

Abstract：【Objective】To clone the small subunit encoding gene for adenosine diphosphate glucose pyrophosphory-lase（AGPase）in Lilium brownii var.viridulum（LbAGPS1），and analyze its expression pattern，which could provide theoretical basis for promoting starch synthesis，accumulation and expansion of lily bulbs by regulating the expression of this gene.【Method】The geneLbAGPS1 was cloned from young leaves of tissue culture seedlings ofL.brownii var.viridu-lum by homologous cloning technique，and bioinformatic analysis and subcellular localization were performed.The expression difference of LbAGPS1 gene in leaf，scale and bulb base disc of L.brownii var.viridulum was analyzed by fluorescence quantitative PCR.【Result】The results showed that the LbAGPS1 gene contained a complete open reading frame（ORF）of 1569 bp，encoding a hydrophilic protein consisting of 522 amino acids，the secondary structures con-sisted ofα-helix（23.56%），β-fold（20.12%），random coil（50.38%）andβ-turn（5.94%）.The LbAGPS1 protein had the characteristic structure of glucose-1-phosphate adenylate transferase and belonged to the cl33437 family protein.It had"PLN02241，GlgC conserved domains，9 oligomer interface features and 10 ligand binding sites.The phylogenetic tree indicated that the LbAGPS1 protein was closely related to the small subunits of AGPase protein in Asian lily.Subcellular localization analysis showed that LbAGPS1 protein was located in chloroplasts of tobacco leaves.Real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that the LbAGPS1 gene was mainly expressed in the bulbs ofL.brownii var.viridulum，and the expression level was significantly higher than that in the leaves and bulb base discs.The relative expression level was the highest in the inner scales of the bulbs，followed by the middle and outer scales.【Conclusion】The protein encoded by LbAGPS1 gene contains the PLN02241 and GlgC conserved domains and characteristic sites of the cl33437 family.It is mainly expressed during the development of scales in bulbs and has obvious tissue expression specificity.

Key words：Lilium brownii var.viridulum；LbAGPS1；starch；adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase；gene expression

Foundation items：Guangxi Natural Science Foundation（2021GXNSFAA196014）；Jiaying University Talent Intro-duction Scientific Research Start-up Project（2022RC97）；Jiaying University Research Project（2023KJY03，2022KJZ03）

0引言

【研究意義】龍牙百合（Lilium brownii var.viridu-lum）屬百合科百合屬植物，是我國主要的食用百合之一，同時也具有重要的藥用和觀賞價值（崔羅敏等，2021；李潤根等，2024）；其鱗莖富含淀粉，除用于鮮食外，通常被加工成百合干片、百合粉，為膳食藥用佳品，深受市場青睞。龍牙百合鱗莖種球繁育主要通過播種鱗片繁育小鱗莖的方式進行，再經2～3年田間種植生長才能成為商品種球（高柱等，2020）。通過組織培養方式繁育百合鱗莖種球是當前的研究熱點，該方法能高效率、高質量獲得統一性狀的脫毒鱗莖種球，但卻難以培育出膨大的、符合田間種植的鱗莖（韋莉萍等，2014；張進忠等，2019）。龍牙百合鱗莖富含淀粉，其淀粉合酶等相關酶在鱗莖種球膨大發育、合成淀粉等代謝途徑中具有重要功能；腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophos-phorylase，AGPase）是利用ATP催化G-1-P合成淀粉原料單元腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）的關鍵酶（姜麗娜等，2008；周彩琴和王麗娟，2011），對AGPase編碼基因進行功能分析和表達調節研究有利于了解淀粉合成代謝關鍵節點及其調控機理，從而為開發高含量淀粉百合鱗莖繁育技術及改良龍牙百合品質提供思路。【前人研究進展】淀粉合成代謝相關酶在水稻、小麥、玉米、馬鈴薯等以收獲富含淀粉谷物或塊莖的糧食作物中研究較多，其中限速酶AGPase為重要的研究熱點。不同作物淀粉合成代謝研究表明，AGPase活性與淀粉含量存在顯著正相關（Sweet-love et al.，1999），提高其編碼基因的表達能有效促進淀粉含量增加。Smidansky（2002）將玉米AGPase大亞基基因Sh2r6hs轉入小麥，其轉化植株籽粒產量和整株生物產量均顯著提高。Crevillén等（2005）通過導入反義RNA片段，轉錄后水平抑制馬鈴薯AGPase小亞基的表達，結果顯示轉基因植株塊莖AGPase活性顯著下調，淀粉含量也急劇下降；而導入AGPase基因glgC16進行過表達，則發現馬鈴薯轉化植株塊莖淀粉含量顯著增加。在非主要農作物及小眾經濟作物中，AGPase編碼基因的克隆及功能分析也有相關報道，主要從基因表達模式對淀粉合成的影響及調節進行研究。臧玉文等（2016）對紅香芋球莖膨大過程中主要淀粉合成相關酶活性的研究表明，芋莖基部膨大時AGPase活性與總淀粉含量呈顯著正相關，并認為淀粉的積累與芋球莖的膨大發育密切相關。李梓銘等（2021）對浙貝母淀粉代謝基因及其鱗莖發育進行研究，發現AGP相關基因在鱗莖中表達量最高，且均與淀粉含量呈顯著正相關。存在AGPase基因多態型的作物，其不同基因型在植株不同部位的表達模式也存在差異，對淀粉的合成積累有不同貢獻。甘曉燕等（2016）從22個不同類型馬鈴薯中分離出5種類型AGPase，當AGPase基因型為ISQV時，馬鈴薯淀粉含量較高。一般認為高等植物AGPase是由2個大亞基與2個小亞基組成的異源四聚體，小亞基主要發揮催化功能，其物種保守性高于大亞基，大亞基可調節小亞基發揮催化作用（周彩琴和王麗娟，2011）；小亞基含有PLN02241、GlgC保守結構域及配體結合位點與低聚物界面特征位點；具有葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉移酶功能（張進忠等，2019）。前人研究認為，AGPase是一個受3-磷酸甘油酸和Pi比率來控制其活性、從而調控淀粉合成的變構酶（Fu etal.，1998），但光合器官與非光合籽粒貯藏器官的AGPase對此表現出差異性（Denyer etal.，1996），可能是由于基因多態性、表達特異性或所在的發揮功能部位存在差異造成。【本研究切入點】龍牙百合鱗莖從形成發育到商品鱗莖形成是淀粉合成與逐漸積累的過程，淀粉合酶對促進淀粉合成代謝具有重要作用，但目前有關龍牙百合的研究主要集中在組織培養、誘導鱗莖膨大生長方面（張進忠等，2019），而關于鱗莖淀粉合酶編碼基因的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】通過同源克隆獲取龍牙百合AGPase編碼基因LbAGPS1，并進行結構與功能分析；通過熒光定量PCR檢測該基因在龍牙百合植株不同部位的表達差異，驗證其發揮功能部位，為通過調節該基因表達進而促進百合鱗莖淀粉合成積累及膨大發育提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

植物材料：龍牙百合組培苗（圖1），由本課題組采用組織培養方式獲得。

主要試劑：總RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒、PCR產物回收試劑盒DNA Gel Extraction Kit、pMD19-T載體、大腸桿菌DH5α感受態細胞、農桿菌GV3101感受態細胞購于生工生物工程（上海）股份有限公司，SYBR Master Mixture（TaKaRa）、本氏煙草、表達載體Pcambia2300-GFP購自陜西艾優稷生物科技有限公司；其余常規試劑為進口或國產分析純。

主要儀器：Roche Light Cycler?480 II實時熒光定量PCR儀、OLYMPUS FV10-ASW激光共聚焦顯微鏡、Eppendorf 5810R離心機等。

1.2試驗方法

1.2.1 LbAGPS1基因克隆取組培苗幼嫩葉片為材料，參照植物總RNA提取試劑盒說明提取RNA，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，Nano Photometer檢測RNA純度與濃度；用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA逆轉錄合成cDNA。在NCBI數據庫搜索同源關系相近的該基因序列，并分析其保守序列。采用Primer Premier 5.0設計克隆引物，ORF-F：5'-ATGGCGATGGCTGCGATCGGCG TT-3'；ORF-R：5'-CGTAGTCTTATATCACAGTCCC GC-3'。以反轉錄cDNA為模板進行PCR擴增，擴增程序：94℃預變性4 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，進行35個循環。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得目的條帶。利用回收試劑盒切膠回收目的片段，再克隆至pMD19-T載體并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，加入LB培養基振蕩培養，再涂布于含卡那霉素的LB固體培養基上培養，將PCR檢測陽性的菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.2 LbAGPS1生物信息學分析利用ExPASy ProtParam（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）分析蛋白理化性質；利用ExPASy ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）預測親/疏水性；利用SignalP-5.0 Services（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）分析信號肽；利用NPS@：SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_auto-mat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）預測二級結構，SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）預測三級結構；利用DeepTMHMM（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）預測跨膜結構域；利用NetPhos3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）預測磷酸化位點；利用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi）預測亞細胞定位；利用NCBI CDD程序（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd）分析保守結構域。使用DNAMAN 8.0進行多序列比對，以MEGA 11.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育進化樹（Bootstrap設為1000次）。

1.2.3綠色熒光蛋白表達載體構建引物設計如下：LbAGPS1-2300-F：5'-AGAACACGGGGGACGAGCT CATGGCGATGGCTGCGATCG-3'；LbAGPS1-2300-R：5'-ACCATGGTGTCGACTCTAGATATCACAGTCCCACTAGGGATCAA-3'。

反應體系50μL：5×SF Buffer 10μL，上、下游引物各2μL，cDNA模板1μL，dNTP 1μL，Phants HS Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，ddH2O 33μL；擴增程序：95℃預變性3 min；95℃10 s，58℃10 s，72℃40 s，進行35個循環；72℃延伸5 min；16℃保存備用。

目的基因LbAGPS1與目標載體連接：（1）用Sac I和Xba I雙酶切質粒Pcambia2300-GFP，回收大片段；反應體系40μL：10×Tango Buffer 8μL，Sac I 2μL，Xba I 1μL，Pcambia2300-GFP質粒5μL，ddH2O 24μL，37℃酶切2 h后65℃5 min失活。（2）將上述回收產物與擴增所得目的基因回收產物用同源重組連接酶進行重組連接，再轉化Trans1-T1感受態細胞；連接方法為將目的DNA片段和線性化載體以5∶1摩爾比加到EP管中進行重組反應，混勻后在37℃放置30min，立即進行轉化。（3）菌落PCR檢測與測序驗證。在含卡那霉素平板上過夜培養，進行藍、白斑篩選，PCR鑒定陽性后挑取陽性菌落測序驗證。

1.2.4亞細胞定位將陽性克隆在LB培養基上擴大培養，提取Pcambia2300-LbAGPS1-GFP表達載體，使用凍融法轉化農桿菌GV3101感受態細胞；將檢測陽性的農桿菌搖菌培養（28℃，200 r/min）；于滅菌的1.5 mL離心管中加入1.0 mL菌液；離心（1000×g，10 min）沉淀菌體，除去上清液，加1.0 mL滲透液，懸浮菌體；取少量懸浮菌液，用稀釋方法使OD600 mm為0.4，室溫靜置1～3 h后作為侵染液待侵染；用去針頭的注射器吸入1.0 mL侵染液，對選定生長期在5～8周的煙草葉背面輕推活塞進行葉面侵染；注射后培養2 d，切取侵染區域，取表皮制片，采用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.5 LbAGPS1基因表達分析熒光定量PCR引物設計，目的基因F：5'-GGATGCCGACAGGAGGTT-3'；R：5'-AATGCGGG CGTTCTTGTC-3'；擴增103bp。內參基因GAPDH-F：5'-CCATCCAGCAAGGACTGGA G-3'；GAPDH-R：5'-CCGCCTTCTCAAGCCTAACA-3'；擴增187 bp。

取葉片與植株下端形成的小鱗片（分內、中、外3部分）及鱗莖盤（鱗片著生點）為材料提取RNA。采用試劑盒將1.0μL Oligo dT和2.0μg RNA加入到PCR小管中，補充RNase-free H2O至10.0μL；混勻后離心，73.5℃溫浴7min；之后立即置于冰水混合物中冰浴退火；再加入5×RT buffer 4.0μL、10 mmol/L dNTPs 2.0μL、RNasin（40 U/μL）0.4μL、M-MLV-RTase（200 U/μL）1.0μL、RNase-free H2O 2.6μL進行冰上反應；上述體系在43.5℃水浴反應1h，然后在73.5℃水浴3 min使RT酶失活，得到RT產物cDNA，置于-20℃保存備用。反應體系12.0μL：SYBR premix Ex Taq 6.0μL，引物mix（5μmol/L）0.3μL，cDNA模板0.6μL，RNase-free H2O 5.1μL，采用兩步法進行實時熒光定量PCR，擴增程序：95℃預變性5 min；95℃5 s，60℃30 s，進行40個循環。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量（Livak and Schmitt‐gen，2001）。

2結果與分析

2.1 LbAGPS1基因克隆及序列分析結果

提取龍牙百合組培苗葉片RNA，經反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板擴增LbAGPS1基因編碼序列，PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠擴增電泳分析，檢測結果（圖2）顯示，擴增產物長度為1000～2000 bp，符合預期結果。測序結果表明，LbAGPS1基因全長1569 bp（GenBank No.MN580669.1），經序列比對分析該序列為編碼AGPase小亞基的CDS區；參考高度相似性序列注釋信息，命名為LbAGPS1；通過同源克隆獲得LbAGPS1編碼的開放閱讀框（ORF）全長序列，該序列長1569 bp，編碼522個氨基酸殘基（圖3）。

2.2 LbAGPS1蛋白的生物信息學分析結果

2.2.1 LbAGPS1蛋白理化性質分析蛋白理化性質分析結果表明，LbAGPS1蛋白包含522個氨基酸，其中含量最高的是丙氨酸（Ala），占比10.20%；帶負電荷的氨基酸殘基總數（Asp+Glu）為60，帶正電荷的氨基酸殘基總數（Arg+Lys）為57；蛋白分子式為C2529H4031N687O765S17，總原子數為8029，相對分子量為56845.99 Da，理論等電點為6.35；不穩定系數為37.05，為穩定蛋白。脂肪系數為91.65；第183位氨基酸出現明顯的親水峰值，親/疏水性指數為-2.489，第211位氨基酸呈現疏水峰值，親/疏水性指數為2.311，親水性平均值為-0.158，屬于親水蛋白（圖4）。蛋白信號肽分析結果顯示，該蛋白無信號肽，推測為非分泌蛋白。跨膜結構域預測發現LbAGPS1蛋白無跨膜結構域，為非跨膜蛋白。磷酸化位點預測結果顯示，LbAGPS1蛋白具有43個磷酸化位點，包括絲氨酸21個、蘇氨酸16個和酪氨酸6個。Plant-mPLoc預測顯示LbAGPS1蛋白定位于葉綠體。二級結構預測結果顯示，LbAGPS1蛋白由23.56%的α-螺旋、20.12%的β-折疊、5.94%的β-轉角和50.38%的無規則卷曲組成（圖5）。SWISS-MODEL預測LbAGPS1蛋白的三級結構（圖6），應用ProMod3（Studer etal.，2021）基于與目標模板的比對，其三維結構根據篩選的質量最高模板1yp4.1.A（模板庫SMTL，2024-05-02）建立。以模板的四元結構用于寡聚形式對目標序列進行建模，其四元結構質量評估（QSQE）分值為0.72，反映基于模板構建的模型鏈間接觸預期準確性較高，表明其與2個ADP亞基、1個ADQ亞基構成異源四聚體的形式存在；LbAGPS1蛋白三級結構空間構象與二級結構預測的結果相符合。

2.2.2 LbAGPS1蛋白保守結構預測分析應用NCBI提供的CDD程序檢索，結果顯示，LbAGPS1蛋白屬于cl33437家族蛋白（圖7），在307～1566 bp間具有PLN02241、GlgC保守結構域，此類結構域具有葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉移酶特征；在第150與第205個氨基酸之間有9個低聚物界面特征位點；在第4與第176個氨基酸之間有10個配體結合位點。2.2.3 LbAGPS1氨基酸序列同源性及系統發育分析通過NCBI Blastp程序比對發現LbAGPS1氨基酸序列與其他植物AGP蛋白小亞基相似性較高，前50條數據顯示相似性為85.00%至99.00%。系統發育進化樹結果顯示，龍牙百合LbAGPS1蛋白與亞洲百合AGPase小亞基聚在一個分支（圖8），其相似性為99.43%，且與其他植物AGP小亞基的相似性均高于86.00%，說明該序列在物種間及進化發育上相對保守。

2.3 LbAGPS1蛋白表達載體構建及亞細胞定位結果

成功構建綠色熒光蛋白表達載體是進行亞細胞定位的前提。通過同源克隆獲得編碼AGPase的同源目的基因LbAGPS1，圖9為目的基因LbAGPS1克隆片段；采用雙酶切方法將目的基因LbAGPS1與Pcambia2300-GFP目標載體連接，連接后菌落PCR條帶顯示在1500bp附近（圖10），與預期結果相符，測序結果驗證準確。圖11為成功構建的綠色熒光蛋白表達載體Pcambia2300-LbAGPS1-GFP。

表達載體Pcambia2300-LbAGPS1-GFP經農桿菌介導侵染煙草葉片，觀察葉片細胞中LbAGPS1-GFP融合蛋白的綠色熒光，結果顯示，LbAGPS1蛋白在煙草葉片中的表達主要定位于葉綠體（質體）（圖12），與Plant-mPLoc預測結果一致。

2.4 LbAGPS1基因的表達分析結果

組織特異性分析結果（圖13）顯示，龍牙百合LbAGPS1基因在組培苗葉片、鱗片、鱗莖盤中均有表達，且在不同組織的表達存在差異。LbAGPS1基因在葉片與鱗莖盤中的相對表達量差異不顯著（Pgt;0.05），但在鱗片中的相對表達量顯著上調（Plt;0.05，下同），且不同部位鱗片中的相對表達量均有顯著差異，以內部鱗片的相對表達量最高，其次為中部鱗片及外部鱗片。結果表明龍牙百合鱗莖形成發育過程中，LbAGPS1基因主要在鱗片上調表達，特別是形成初期的內部鱗片表達量較高，有利于淀粉合成所需葡萄糖供體ADPG的合成與積累，進而促進富含淀粉鱗片的形態建成。

3討論

龍牙百合鱗莖富含淀粉，鱗莖發生、形成及發育過程也是淀粉合成代謝與積累的過程；通過基因調控技術調節百合鱗莖形成、生長發育過程中淀粉的合成途徑，或篩選淀粉合成代謝途徑關鍵酶基因表達量高的優良品系對于百合產業的高質量發展具有積極意義。淀粉合酶AGPase及編碼基因在高淀粉含量的谷物類及鱗莖、薯類作物中研究較多；因以淀粉為收獲目的，提高作物淀粉產量顯得尤為重要，從酶活生理及基因表達水平進行調節已成為提高淀粉產量的重要途徑（王謝琴等，2022；田娜等，2023；張正珍等，2023；吳子牛等，2024）；通過對AGPase編碼基因研究發現，在多種作物中過表達該基因能顯著提高淀粉合成，而基因缺失表達則顯著降低淀粉含量（Crevillén et al.，2005），表明可通過基因改造或正調控AGP基因表達實現作物的優質高產；同時在不同作物中存在AGP基因多態型分布，利用分子技術選育高表達的基因型品系為作物品種改良提供了新的思考途徑。蘭州百合鱗莖發育過程中鱗片形態建成、鱗莖膨大與淀粉合成關鍵酶AGPase及編碼基因、淀粉的合成積累呈正相關（張進忠等，2019），且編碼基因在鱗莖組織部位具有特異性高表達，同樣的結論也出現在對芋、薯類、貝母等作物的研究中（臧玉文等，2016；甘曉燕等，2016；李梓銘等，2021）。對于龍牙百合，膨大的商品鱗莖更為市場所需，由此衍生出有利于提高AGPase活性及編碼基因上調表達的技術措施，如龍牙百合生產種植中通過在初花期摘除花苞達到營養物質向鱗莖庫積累的效果，這可能與花期雌雄蕊發育需要AGP相關基因特異性在花器官組織表達為其提供能量與物質有關（吳世文等，2010），花苞摘除后更有利于AGP在鱗莖組織表達，從而提高淀粉產量及促使鱗莖膨大；在百合組培鱗莖生產中通過增加碳源用量及利用植物生長調節劑上調AGP相關基因表達以提高AGPase活性，從而促進淀粉的合成與積累，有利于百合小鱗莖的離體誘導及后期的試管鱗莖膨大發育（張進忠等，2019）。

本研究所克隆的LbAGPS1基因經分析含有葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉移酶特征的保守結構域及特征位點，經比對分析發現與其他作物AGP相關基因具有高度相似性及同源性，為淀粉合成途徑關鍵酶AGPase編碼基因，后期研究可利用轉錄組測序分析不同品種百合AGP相關基因或龍牙百合中該基因的多態性，發現和篩選淀粉合成代謝途徑中表達效率較優的基因型，進而選育優良品種。本研究的亞細胞定位發現在植物光合器官中LbAGPS1定位于綠葉體，而前人研究表明在貯藏器官中則定位于質體（Lee et al.，2007），龍牙百合鱗莖組織培養過程中其受光照的外部鱗片表面會轉變為綠色，可能由于質體（前質體）向葉綠體、有色體等質體進行了轉化。另外，通過實時熒光定量PCR對Actin、GAPDH等常用內參基因進行比較，發現GAPDH為龍牙百合不同器官間穩定的內參基因，為百合不同發育期或不同組織部位基因表達分析研究提供了內參基因參考。

4結論

克隆到龍牙百合淀粉合成代謝途徑關鍵酶基因LbAGPS1，該基因具有葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉移酶特征的保守結構域及特征位點，編碼催化形成淀粉鏈延長所需底物ADPG的關鍵酶，與其他作物的AGPase小亞基基因序列高度相似，且主要在鱗莖發育中表達。

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（責任編輯：王暉）