月季黑斑病菌ISSR遺傳多樣性分析

摘要：【目的】探討我國月季黑斑病病原菌的種類、遺傳多樣性及其親緣關系，為月季種質黑斑病抗性鑒定及病害防控提供理論依據。【方法】分離來自全國7個大區15個省（區）27個市（縣）的月季黑斑病病原菌，擴增菌株ITS序列確定病原菌種類，并經柯赫氏法則驗證其致病性。采用ISSR分子標記技術研究病原菌的遺傳多樣性；將擴增的條帶數據記為0-1矩陣，并使用PopGene 32.0計算遺傳多樣性指數和遺傳距離等指標；利用NTsys-pc 2.1進行非加權平均法（UPGMA）聚類分析。【結果】分離得到107株病原菌，按不同市（縣）可劃分為27個居群；經鑒定107株菌株均為薔薇盤二孢（Marssonina rosae）。經篩選確定了ISSR-PCR擴增的3條引物，分別為UBC884、UBC885和UBC886，3條引物共擴增出84條條帶，多態性條帶數為84條，多態性比率為100%，顯示出高多態性，可用于薔薇盤二孢菌株的擴增。107株菌株群體的遺傳多樣性分析結果顯示，菌株居群間的平均觀測等位基因數（Na）為1.3369、平均有效等位基因數（Ne）為1.2431，平均Nei’s多樣性指數（H）為0.1367，平均Shannon’s信息指數（I）為0.1993，平均總基因多樣性（Ht）為0.2827，平均居群內基因多樣性（Hs）為0.1368，平均遺傳分化系數（Gst）為0.5163，平均基因流（Nm）為0.4684。基于UPGMA聚類分析，107株薔薇盤二孢菌株在遺傳相似性系數為0.57時劃分為8個類群，類群Ⅰ～Ⅶ中來自各個地區的菌株相互混雜，Ⅷ中的部分菌株大致根據市（縣）的地理位置聚在一起。【結論】107株來自不同地理區域的薔薇盤二孢菌株表現出豐富的遺傳多樣性，居群間基因流動水平較低，遺傳分化程度較高，且菌株遺傳多樣性與地理來源之間關聯性不強。

關鍵詞：月季黑斑病；薔薇盤二孢；ISSR分子標記；遺傳多樣性

中圖分類號：S436.81文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2025）02-0496-12

ISSR genetic diversity analysis of rose black spot pathogen

GUO Jia-qi1，2，CHEN Feng1，2，LYU Bo2，YANG Yuan-yuan2，GUO Cong2，SONG Ju-rong2，YANG Jie2，XIANG Fa-yun2*，LIN Jian-guo1*

（1Hubei University of Technology/Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology，Wuhan，Hubei 430068，China；2Industrial Crops Institute，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Research Center of Flower，Wuhan，Hubei 430064，China）

Abstract：【Objective】This study aimed to investigate the species composition，genetic diversity and phylogenetic re-lationships of the rose black spot pathogen in China，which could provide theoretical basis for resistance identification of rose germplasm against black spot and disease control strategies.【Method】The pathogen of rose black spot were isolated from 27 cities（counties）of 15 provinces（autonomous regions）in 7 regions of China，and the pathogen species were de-termined by amplified strain ITS sequence，and the pathogenicity was verified by Koch’s rule.The genetic diversity of the pathogens was studied using the ISSR molecular marker technology.The band data obtained by amplification was re-corded as a 0-1 matrix，and the genetic diversity index and genetic distance were calculated using PopGene 32.0，and the unweighted pair group method with arithmetic mean（UPGMA）clustering analysis was performed using NTsys-pc 2.1.【Result】Atotal of 107 strains of pathogen were isolated，which could be divided into 27 populations according to different cities（counties）.All 107 strains were identified as Marssonina rosae.Three primers for ISSR-PCR amplification were identified：UBC884，UBC885 and UBC886.These primers produced a total of 84 bands，all of which were polymorphic，indicating a polymorphism rate of 100%，thus demonstrating high polymorphism，and it was suitable for the amplification of M.rosae.Genetic diversity analysis of 107 strains showed that the mean observed number of alleles（Na），mean effec‐tive number of alleles（Ne），mean Nei's diversity index（H）and mean Shannon’s information index（I）were 1.3369，1.2431，0.1367，0.1993，respectively.Average genetic diversity（Ht）was 0.2827，average genetic diversity within popula‐tion（Hs）was 0.1368，average coefficient of genetic differentiation（Gst）was 0.5163，and gene flow（Nm）was 0.4684.Based on UPGMA cluster analysis，the 107 M.rosae strains could be divided into 8 groups when the genetic coefficient was 0.57.In groupsⅠ-Ⅶ，strains from different regions were mixed with each other，while some strains in group VIII were grouped together based on their geographical location of cities（counties）.【Conclusion】The 107 M.rosae strains from different geographical regions exhibit rich genetic diversity，low gene flow among populations，and high genetic dif‐ferentiation.Moreover，there is no strong correlation between the genetic diversity of the strains and their geographical ori‐gin.

Key words：rose black spot；Marssonina rosae；ISSR molecular marker；genetic diversity

Foundation items：Hubei Technology Innovation Plan Project（2024BBB022）；Wuhan Knowledge Innovation Spe‐cial Project（202302020101010141）；Open Fund Project of Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology（202209 KF10）；Open Fund Project of Hubei Engineering Research Center for Biological Breeding of Specialty Flowers（2023 ZD001）

0引言

【研究意義】月季是世界大宗花卉，在我國種植廣泛，但露天栽培的月季常受到黑斑病的侵襲。月季黑斑病最早于19世紀在歐洲被發現，隨著觀賞月季的全球貿易逐漸傳播，現已成為一種世界性病害（Debener，2019）。由于黑斑病的傳播范圍廣、危害程度高，該病也被認為是露天栽培月季最具威脅的真菌性病害之一（Whitaker et al.，2010；Byrne et al.，2019）。黑斑病不僅降低月季的觀賞價值，還嚴重影響產業效益。化學藥劑防治是目前植物病害的常用防治方法，但其過度使用會使病原菌產生抗藥性，并對環境造成負面影響。相比之下，選擇抗病性優良的品種是更為有效的應對策略。因此，探究月季黑斑病病原菌的種類及其遺傳多樣性，對培育抗黑斑病月季新品種至關重要。【前人研究進展】已有研究報道了可能引起月季黑斑病的病原菌。Abbas等（2017）經柯赫氏法則回接月季葉片，并擴增ITS和β-微管蛋白基因序列，確定分離得到的月季黑斑病病原菌為鏈格孢（Alternaria alternata）。陳俊祥和程強（2019）擴增菌株核糖體ITS序列，經測序和系統發育分析后將分離得到的月季黑斑病菌菌株鑒定為薔薇盤二孢（Marssonina rosae）。李艷杰等（2024）使用真菌通用引物ITS（ITS1/ITS4）、EF1-α（EF1-938F/EF1-2218R）和TUB（BT-2A/BT-2B）分別對月季黑斑病菌菌株基因組DNA進行PCR擴增，經測序和分析，病原菌被鑒定為薔薇擬日規殼（Gnomoniop-sis rosae）。周鋒等（2024）通過rDNA-ITS序列及系統發育樹分析和柯赫氏法則回接月季葉片，確定分離得到的月季黑斑病菌為狹卵鏈格孢菌（Alternaria angustiovoidea）。物種的分類可通過分子標記技術實現，ISSR標記技術相較于其他分子標記，具有操作簡單、快速高效的優點，不需要繁瑣的基因文庫構建、雜交和同位素顯影等步驟（孫洪等，2005；夏會楠等，2024），現已被廣泛應用。魏颯等（2023）利用ISSR分子標記對56份粗山羊草種質進行了遺傳多樣性和群體結構分析，發現群體間的遺傳分化水平較低，大部分變異以群體內為主，群體結構分析將56份粗山羊草種質分為5個群體，其中種群Ⅳ的遺傳多樣性較豐富。許琳等（2023）通過ITS與ISSR分子標記相結合對吉林栽培的靈芝（Ganoderma lucidum）種質資源的遺傳多樣性進行鑒定和遺傳多樣性分析，結果發現，基于ISSR分子標記的分類結果與基于ITS序列分析+拮抗試驗結果的分類一致，18株靈芝菌株表現出明顯的遺傳多樣性。賈艷艷等（2024）利用12條ISSR引物在長瓣鐵線蓮8個雜交組合的30個子代中鑒定出29個真雜種。盛秀麗等（2024）利用ISSR分子標記構建了新疆石榴種質的分子身份證，24份石榴種質的分子身份證各不相同，具有唯一性和可辨性。Zheng等（2024）將ISSR標記遺傳多樣性結果與單株產量等性狀相關聯，篩選出優異高產且緊密連鎖的ISSR分子標記，通過對F2代優良高產標記的鑒定，確定了早期選擇方法，有效縮短了育種周期，提高了選擇精度和效率。在真菌中，ISSR分子標記技術主要用于探究植物病原菌的遺傳多樣性及食品微生物的鑒定等（Oliveira andAze‐vedo，2022）。Gramaje等（2014）采用多位點ISSR標記揭示了葡萄衰枯病菌（Cadophora luteoolivace）在西班牙和南非2個種群中的遺傳結構。Yang等（2017）使用ISSR和RAPD分子標記探究福建省41株紅曲霉屬真菌的遺傳多樣性，發現ISSR標記不僅可用于紅曲屬物種的分類和測定，還能將其根據地理來源大致分開。Longya等（2020）結合ISSR和SRAP標記分析泰國的稻瘟病菌種群的遺傳多樣性，發現菌株群體存在高水平的遺傳變異。【本研究切入點】目前，全國范圍內月季黑斑病菌的分離和鑒定結果尚未見報道，國內月季主產區黑斑病病原菌種類及遺傳多樣性信息不明。【擬解決的關鍵問題】以從全國不同地區收集分離的月季黑斑病病原菌菌株為研究對象，對病原菌菌株進行生物學特性和ISSR遺傳多樣性分析，并使用PopGene 32.0和NTsys-pc 2.1計算遺傳多樣性指數、遺傳距離及聚類分析，探究不同地區的月季黑斑病病原菌之間的遺傳差異及親緣關系，為月季種質黑斑病抗性鑒定及病害防控提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1樣品采集從全國7個大區（東北、華北、華中、華南、華東、西南、西北）15個省（區）27個市（縣）采集具有月季黑斑病癥狀的葉片，其中東北3份、華北1份、華中14份、華南4份、華東8份、西南5份、西北5份。供試月季品種為仿古浪漫，由湖北省農業科學院花卉研究中心提供。

1.1.2供試培養基完全培養基（CM）：酵母浸粉1 g、酶水解干酪素0.5 g、酸水解干酪素0.5 g、葡萄糖10 g、硝酸鈣1 g、磷酸二氫鉀0.2 g、七水硫酸鎂0.25 g、氯化鈉0.15 g、瓊脂15 g，加蒸餾水定容至1000 mL。1.1.3主要試劑酵母浸粉購自賽默飛世爾科技公司；酶水解干酪素購自生工生物工程（上海）股份有限公司；酸水解干酪素和核酸染料購自北京蘭杰柯科技有限公司；葡萄糖、硝酸鈣、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂和氯化鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂購自廣州賽國生物科技有限公司；2×F8 Fast-Long PCR MasterMix購自北京艾德萊生物科技有限公司。PCR引物均由武漢天一華煜基因科技有限公司合成。

1.2試驗方法

1.2.1病原菌分離純化采用組織分離法和單孢分離法分離病原菌菌株。將具有明顯黑斑病癥狀的月季葉片用清水洗凈后擦干，在葉片病健交界處剪取5 mm×5 mm的組織塊，先用75%酒精消毒30 s，再用4%次氯酸鈉溶液消毒30 s，無菌水洗滌3～4次。滅菌后的組織塊放在滅菌濾紙上晾干后轉移到CM固體培養基中，于黑暗條件下25℃恒溫培養。同時采用單孢分離法，取1～2塊消毒后的組織塊置于2 mL離心管中，加入200μL滅菌水和1顆鋼珠，打碎至勻漿，12000 r/min離心30 s，取上清液100μL涂布在CM固體培養基上，于25℃恒溫黑暗培養。當單菌落長出后，挑取菌落邊緣菌絲到新的CM培養基中，重復操作到菌株純化為止。純化后的菌株連帶培養基置于4℃保存；另在菌落邊緣1 cm左右的位置打取菌餅放置于無菌凍存管中，加入25%甘油后在-80℃保存。

1.2.2菌株形態學鑒定分離得到的菌株用打孔器取直徑為5 mm的菌餅，轉接于CM固體培養基中，培養30 d左右觀察菌落的顏色、菌絲疏密程度等菌落特征。產孢后，挑取菌絲制成臨時玻片，在光學顯微鏡下進行鏡檢，觀察菌絲顏色、分生孢子大小、形狀和有無隔膜等。依據形態學特征初步鑒定病原菌種類。采用十字交叉法測量菌落生長20、30和40d的直徑并計算菌絲生長速率。

菌絲生長速率（%）=（菌落直徑-原菌餅直徑）/生長天數×100

1.2.3分子生物學鑒定采用改良后的CTAB法提取分離菌株總DNA（余涵，2000）。使用Thermo NanoDrop one超微量分光光度計檢測DNA濃度，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，質量和濃度合格的DNA置于-20℃冰箱保存。應用rDNA-ITS序列通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTG CGG-3'）/ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對分離菌株基因組DNA進行PCR擴增。PCR擴增體系25.0μL：2×Taq PCR Mix 12.5μL，上、下游引物（10μmol/L）各1.0μL，DNA模板1.0μL，ddH2O 9.5μL。擴增程序：95℃預變性2 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，進行34個循環；72℃延伸5 min。擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測出單一的合格條帶后，送至北京擎科生物科技股份有限公司進行測序。測序結果在NCBI網站上用BLAST工具進行序列比對，選取序列同源性較高的已知菌株對分離菌株進行鑒定。

1.2.4致病性檢測采用柯赫氏法則驗證分離菌株的致病性。取純化后的分離菌株在菌絲邊緣打取直徑為5mm的菌餅3塊，接種至CM固體培養基中，于恒溫搖床內25℃、180 r/min振蕩培養20～30 d后，經已滅菌的3層擦鏡紙過濾獲得分生孢子液。分生孢子液在室溫下4500 r/min離心10 min，棄上清液，加少量無菌水重懸，調整濃度為2×105 CFU/mL，加入0.1%Tween-20混勻備用。以含0.1%Tween-20的無菌水為空白對照。

采用離體接種法，取月季品種仿古浪漫自上而下第4～5片葉，保留葉片頂部3片小葉，用70倍84消毒液（有效氯含量為4%～6%）稀釋液浸泡約2min，流水清洗2～3次，晾干或用吸水紙吸干表面水分后待用。在接種盤內鋪1張濾紙、2層吸水紙，并加無菌水浸濕。將混勻的孢子液均勻噴施到葉片近軸面處，直至整張葉面噴濕。將葉柄放置在接種盤內的2層吸水紙上，葉片放滿后，葉柄處覆蓋4層吸水紙，再加無菌水對葉片進行保濕。將接種盤蓋子封閉后，置于光周期為16h光照（溫度為25℃）、8 h黑暗（溫度為22℃），濕度為80%的培養箱內，期間保持吸水紙濕潤。約15 d后，觀察葉片發病癥狀。每次接種以噴施無菌水（含0.1%Tween-20）的葉片為對照。每處理3個重復，每重復由1個單株的2～5片葉組成。

1.2.5 ISSR多態引物篩選選擇加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的100條ISSR通用引物進行篩選，隨機選擇5株菌株的基因組DNA為模板進行PCR擴增，選擇穩定性高、重復性好、條帶清晰的ISSR引物用于后續試驗，試驗重復3次。ISSR-PCR反應體系20μL：2×F8 FastLong PCR MasterMix 10μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 7μL。PCR擴增程序：95℃預變性4 min；95℃30 s，篩選獲得的ISSR引物退火溫度30 s，72℃30 s，進行34個循環；72℃延伸5min。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用凝膠成像系統拍照。

篩選出的引物采用單因素試驗方法對ISSR-PCR反應體系的退火溫度進行優化，根據儀器設置梯度退火溫度，試驗重復3次。

1.3統計分析

ISSR為顯性標記，同一引物擴增產物中電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性。電泳圖譜中的每一條帶均視為1個分子標記，代表1條引物的結合位點。若擴增帶存在則記為“1”，不存在則記為“0”，統計后建立0-1數據矩陣表。使用PopGene 32.0對不同居群的菌株進行遺傳多樣性分析，如，計算觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Nei’s多樣性指數（H）、Shannon’s信息指數（I）、總基因多樣性（Ht）、居群內基因多樣性（Hs）、遺傳分化系數（Gst）、基因流（Nm）、遺傳相似度和遺傳距離等，并根據遺傳相似性矩陣繪制熱圖。用NTsys-pc 2.1基于非加權平均法（UPGMA）進行聚類分析。

2結果與分析

2.1月季黑斑病病原菌分離鑒定及致病性檢測結果

經組織分離法和單孢分離法從收集的月季黑斑病病葉中共分離獲得107株菌株，編號如表1所示。觀察發現，分離得到的菌株在CM固體培養基上初期會形成白色至淡黃色的小菌落，隨著菌絲向周圍生長，菌落中心顏色逐漸加深，邊緣顏色則呈白色半透明狀，菌絲在形態上表現出中心致密、邊緣疏松的特征。部分菌落會形成同心圓形輪紋，或產生豐富的氣生菌絲，或出現中心突起的現象，最終呈現多種顏色和形態（圖1-B）。菌落生長非常緩慢，生長速率在0.33～0.96 mm/d，大多數菌株生長速率在0.50～0.75 mm/d（圖2）。顯微鏡下觀察發現，分離菌株的菌絲有分枝和隔膜，呈黃褐色，孢子為長卵形，無色雙孢且2個細胞大小不等，在分隔處略有縊縮（圖1-A-A1、圖1-A-A2）。以ITS1/ITS4引物對所有菌株DNA序列進行擴增，擴增條帶長度在530～580 bp。將分離菌株ITS序列送至北京擎科生物科技股份有限公司測序，測序結果進行BLAST比對，107份菌株均被鑒定為薔薇盤二孢。

選擇菌株JS-SZ-YYQ-4-1離體接種月季葉片。接種孢子懸浮液的葉片在接種8 d時開始發病，表面出現直徑約為1mm的黑色小斑點，葉片葉脈區域略微變黃。接種15 d時，斑點相互連結，直徑擴大到3～5 mm，葉片發黃面積進一步擴大（圖1-A-A5右），與田間觀察到的黑斑病癥狀一致（圖1-A-A3、圖1-A-A4），而噴淋了無菌水的對照組未發病（圖1-A-A5左）。表明薔薇盤二孢是月季黑斑病的致病菌。

2.2 ISSR-PCR引物篩選及擴增結果

從100條通用引物中經過2輪擴增篩選，獲得擴增多態性較好、重復性較好的ISSR引物3條，分別為UBC884、UBC885和UBC886（圖3）。3條引物共擴增出84條帶，多態性條帶數為84條，多態性比率達100%，顯示出高多態性，說明3條引物均可用于薔薇盤二孢菌株的擴增。平均每條引物擴增出28個位點，其中引物UBC886擴增條帶最多，為32條（表2）。3條引物的擴增條帶大多在200～2000 bp。由圖4可知，引物UBC884、UBC885和UBC886的最適退火溫度分別為45.9、43.9、52.0℃。

2.3 ISSR標記的薔薇盤二孢遺傳多樣性分析結果

利用引物UBC884、UBC885和UBC886對107株菌株DNA序列進行擴增，得到的條帶數據記為0-1矩陣。107株菌株按不同市（縣）劃分為27個居群。從表3可知，27個居群的平均Na為1.3369、Ne為1.2431、H為0.1367、I為0.1993。由表4可知，107株薔薇盤二孢菌株在種水平的平均Na為2.0000、Ne為1.4814、H為0.2856、I為0.4357。居群內的H和I遠高于居群間，說明供試的107株薔薇盤二孢菌株在居群內的遺傳多樣性豐富。

2.4 ISSR標記的薔薇盤二孢居群遺傳分化

從表4可知，107株薔薇盤二孢菌株的平均Ht為0.2827、Hs為0.1368、Gst為0.5163，即總變異有48.37%來自居群內、51.63%來自居群間，遺傳變異主要來源于居群間；Nm為0.4684lt;1，居群間的基因流動水平較低，基因交流較弱，居群間遺傳分化水平高。

根據27個居群建立遺傳相似性和遺傳距離表，以遺傳相似性系數構建熱圖，并按UPGMA對菌株居群進行聚類分析（圖5）。根據圖5可知，居群間的遺傳相似性系數在0.60～0.95，其中昆明與臨沂居群的菌種遺傳相似性系數最高，為0.95，說明昆明和臨沂居群的菌株遺傳分化程度低，親緣關系較近，但昆明屬于西南區，臨沂屬于華東區，兩地地理位置相隔遙遠；恩施與滁州居群的菌株遺傳相似性系數在27個居群中最低，說明恩施和滁州居群間的遺傳分化程度高，差異較大。聚類分析將27個居群根據遺傳相似性劃分為2個類群，所有居群并未以7個大區分開，也未以南方居群、北方居群等明顯的地理位置聚在一起，而是出現了來自各個大區的居群相互混雜現象。表明居群的聚類受地理位置影響較小，即居群間菌株的遺傳多樣性與地理來源關聯性不強。

2.5 ISSR標記的107株薔薇盤二孢菌株的聚類分析結果

根據得到的0-1矩陣將供試107株薔薇盤二孢菌株使用UPGMA法構建聚類圖。由圖6可知，所有薔薇盤二孢菌株遺傳相似性系數在0.44～0.97。當遺傳相似性系數為0.57時，107株薔薇盤二孢菌株可分為8類，第Ⅰ類為1株來自河北唐山的菌株，該菌株與其他菌株差異顯著（Plt;0.05），親緣關系較遠；第Ⅱ類包括來自遼寧沈陽和江蘇南京的2株菌；第Ⅲ類包括來自河南洛陽、云南昆明、甘肅蘭州的3株菌；第Ⅳ類為陜西咸陽的1株菌；第Ⅴ類包括湖北宜昌和江蘇蘇州的2株菌；第Ⅵ類有來自遼寧沈陽、江蘇南京、湖北荊門、江蘇蘇州、山東臨沂、廣東廣州、云南昆明、廣東深圳的14株菌；第Ⅶ類有來自湖北恩施、河南洛陽、湖南湘潭、遼寧沈陽的4株菌；其余80株菌株被劃分到第Ⅷ類，約占總樣本的74.77%。在遺傳相似性系數為0.59時，類群Ⅷ進一步劃分為2個亞群，在亞群Ⅷ-1和Ⅷ-2中部分同一市（縣）來源地的菌株有趨于聚在一起的傾向。如貴陽的2株菌GZ-ZY-2和GZ-GY-7聚在一類，且遺傳距離最近；廣西南寧的3株菌GX-NN-4-1、GX-NN-4-2-1、GX-NN-4-2-2也聚在一起。但在其他類群中菌株并未按市（縣）劃分，如HB-TS-9與其余6株來自河北唐山的菌株遺傳距離較遠，SX-XY-Ⅲ3未與其他來自陜西咸陽的菌株聚在一起等。菌株劃分與大區的地理位置也無關聯，僅在類群Ⅷ中大致根據市（縣）范圍的地理位置聚在一起，說明菌株的遺傳多樣性僅在較小范圍內受到一定地理來源的影響。

3討論

本研究從全國7個大區15個省（自治區）的27個市（縣）采集的月季黑斑病病葉中分離得到107株菌株，分離菌株經形態學和分子生物學鑒定及柯赫氏法則回接后確定了導致我國月季黑斑病的病原菌是薔薇盤二孢。分析發現不同地理來源的薔薇盤二孢形態存在多樣性，分子標記檢測結果顯示菌株遺傳多樣性也較豐富。居群聚類分析發現來自各個大區的居群相互混雜，居群間菌株的遺傳多樣性與地理來源關聯性不強。UPGMA聚類分析發現所有菌株在遺傳相似性系數為0.57時被劃分為8類，部分菌株聚類受到一定地理來源的影響。

本研究在離體培養薔薇盤二孢時發現菌落生長非常緩慢，生長速率在0.33～0.96 mm/d，大多數菌株生長速率在0.50～0.75 mm/d。有研究發現薔薇盤二孢雖然可以生長在多種培養基上，如馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Yasin et al.，2016）、水瓊脂和麥芽汁瓊脂（Gachomo and Kotchoni，2010）等培養基，但菌株的生長速率始終較慢，被認為最優的培養基是PDA培養基（Gachomo et al.，2010）。但本課題組在研究中發現，相較于PDA培養基，薔薇盤二孢在CM固體培養基上的生長速率更快，因此后續試驗均使用CM固體培養基進行培養；同時發現菌株在CM固體培養基上生長時菌落顏色差別較大，有黑色、灰褐色、灰色、褐色、淡黃色、灰綠色、白色等；菌株形態也具有多樣性，有的菌株存在同心圓形輪紋、有的含有豐富的氣生菌絲、有的具有中心突起等。Whitaker等（2007）研究也發現，薔薇盤二孢顏色具有多樣性，菌株在PDA上生長28 d后，顏色有深黑色、米色、桃色和深橄欖色。以上研究均證明不同來源地的薔薇盤二孢菌株形態具有豐富的多樣性。

研究表明，菌株的遺傳多樣性可能受到地理來源的影響。Werlemark等（2006）對采集自瑞典、加拿大、德國和美國的15株薔薇盤二孢菌株進行了RAPD分析，聚類分析將其大致按地理來源分開。而Münnekhoff等（2017）開發了6個薔薇盤二孢的多態性SSR標記，發現遺傳多樣性與外界環境壓力及寄主的生長年限有關，且樣品并未基于來源地區分。本研究結果與Whitaker（2007）的部分研究結論類似，在107株菌株個體聚類結果中發現，部分來源于同一市（縣）的菌株有趨于聚在一起的傾向，貴州貴陽、湖南湘潭、湖北孝感和荊門、廣西南寧等居群的菌株各自聚在一起。但其他菌株缺乏基于與地理來源良好支持的聚類，如分離自陜西西安與陜西咸陽的菌株，兩地的距離僅34 km，但未聚在一類；廣東廣州的菌株GD-GZ-12-2與GD-GZ-14-2緊密聚在一起，但未與同一地點采集的分離株GD-GZ-3-6聚集。而且在更大范圍上，如將地理來源劃分為地理大區，所有菌株的分類與地理來源不存在顯著相關性，與居群的遺傳相似性聚類分析的結果吻合。居群聚類分析中，所有居群被分為2類，每個類群中來自各個大區的居群相互混雜，出現地理距離遙遠的昆明與臨沂居群親緣關系近，而位置接近的西安與咸陽居群親緣關系遙遠的現象，說明居群間菌株遺傳多樣性與地理來源關聯性不強。對于居群間聚類結果與地理來源關聯性較差的現象，可能的原因是各地種植的月季主要由我國幾個月季產區供應，黑斑病病原菌隨著苗木的貿易進行遠距離傳播，在新傳播地，病菌尚未在短時間內形成特定的地理小種，經采樣后所分離得到的菌株的聚類結果相互混雜。而出現部分菌株在居群范圍聚集，則可能歸因于薔薇盤二孢主要通過無性分生孢子傳播繁衍，分生孢子借助落葉、流水、昆蟲等媒介在短距離內傳播，因此在同一個采集地點內，不同寄主上分離得到的菌株相似性較高。

本研究發現，病原菌的遺傳多樣性可能與寄主品種有關。Blechert和Debener（2005）在顯微鏡下觀察到不同月季品種在接種同種薔薇盤二孢菌株后出現親和與不親和現象，表明月季黑斑病菌致病系統具有高度的寄主專化性；Marolleau等（2020）根據2個薔薇盤二孢菌株基因組設計了27個微衛星標記，探究了77株單孢分離物的遺傳多樣性，發現栽培月季分離株與野生月季分離株存在著強分化；Song等（2024）從轉錄組和代謝組水平揭示了抗、感病月季對薔薇盤二孢響應的差異。以上研究均說明寄主與病原菌可能存在互作關系，但對于薔薇盤二孢的遺傳多樣性與寄主抗感特性之間的具體關聯仍需進一步探究。

4結論

經形態學、分子生物學鑒定及柯赫氏法則驗證，從全國不同區域采集的月季黑斑病病葉中分離得到的107株病原菌菌株均為薔薇盤二孢。通過ISSR分子標記技術，發現107株不同地理來源的薔薇盤二孢遺傳多樣性豐富，群體間基因流動水平較低，遺傳分化程度較高，且菌株遺傳多樣性與地理來源間關聯性不強。

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（責任編輯：麻小燕）