基于全基因組重測序的不結球白菜KASP分子標記開發與應用

摘要：【目的】基于全基因組重測序數據開發不結球白菜KASP分子標記，以期豐富該物種的遺傳信息，為不結球白菜種質資源鑒定、基因定位及分子標記輔助育種提供技術支持。【方法】對2份不結球白菜高代自交系C40和JY70進行全基因組及DNA重測序及比對分析，挑選出差異SNP位點用于KASP分子標記開發，并對55份不結球白菜種質資源進行遺傳多樣性分析和DNA指紋圖譜構建。【結果】C40和JY70之間基因型不一致、測序深度大于10X且等位基因純合的SNP位點有460849個。每條染色體上選擇分布相對均勻的15個SNP位點設計成KASP引物，利用150對KASP引物對C40和JY70進行基因型分型檢測，發現有86對引物成功分型，基于其對55份不結球白菜種質資源的基因型分型結果，篩選獲得41個在不結球白菜中擴增質量高的KASP分子標記。41個KASP分子標記對55份不結球白菜種質資源的遺傳多樣性分析結果顯示，其主要等位基因頻率為0.5000～0.9273，平均為0.6643；基因多樣性指數為0.1349～0.5000，平均為0.4257；多態性信息含量（PIC）為0.1258～0.3750，平均為0.3322，PICgt;0.2500的位點占所有位點的94.5%，多態性較高。55份不結球白菜種質資源分為三大類群，相同類型的種質資源聚類在一起，其中地理來源相同的資源又聚類在一起，有效地反映了種質間的親緣關系。利用PIC最高的15個KASP分子標記構建了55份不結球白菜種質資源的DNA指紋圖譜。【結論】開發獲得41個不結球白菜KASP分子標記，可用于不結球白菜種質資源鑒定、基因定位及分子標記輔助育種。

關鍵詞：不結球白菜；KASP分子標記；遺傳多樣性分析；DNA指紋圖譜

中圖分類號：S634.303.6文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2025）02-0613-09

Development and application of KASP molecular markers for"Brassica campestris ssp.chinensis based on whole-genome"resequencing

ZHANG Yan，SHEN Zhuo，YANG Yi，ZHOU Xuan，WU Zeng-xiang，LI Ting-yao*

（Vegetable Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Key Laboratory for New Technology Research of Vegetables/Lingnan Modern Agricultural Science and Technology Laboratory of"Guangdong，Guangzhou，Guangdong 510640，China）

Abstract：【Objective】The purpose of the study was to develop KASP molecular markers for Brassica campestris ssp.chinensis based on whole genome resequencing data，in order to accumulate and enrich the genetic information of this spe-cies，and provide technical support for the identification of Brassica campestris ssp.chinensis germplasm resource，gene mapping and marker-assisted breeding.【Method】Whole genome resequencing and comparison analysis on 2 Brassica campestris ssp.chinensis high-generation inbred lines C40 and JY70 were conducted.KASP molecular markers were developed by selecting differential SNP loci，and genetic diversity analysis and DNA fingerprint construction were carried out for 55 Brassica campestris ssp.chinensis germplasm resources.【Result】There were 460849 SNP loci with genotype incompatibility，sequencing depth greater than 10X and homozygous alleles between C40 and JY70.Atotal of 15 SNP loci with relatively uniform distribution on each chromosome were selected to be designed as KASP primers，and 150 pairs of KASP primers were used to detect C40 and JY70 genotype，and 86 pairs of primers were successfully genotyped.Based on the genotyping results of 55 Brassica campestris ssp.chinensis germplasm resources，41 KASP molecular markers with high amplification quality in Brassica campestris ssp.chinensis were selected.The genetic diversity analysis of 55 Brassica campestris ssp.chinensis germplasm resources with 41 KASP markers showed that，the minor allele frequency ranged from 0.5000 to 0.9273，with an average of 0.6643；the gene diversity index was 0.1349-0.5000，with an average of 0.4257；the polymorphism information content（PIC）was 0.1258-0.3750，with an average value of 0.3322；and 94.5%of the loci had PICgt;0.2500，with fine polymorphism.The clustering analysis results showed that 55 Brassica campestris ssp.chinensis germplasm resources were divided into 3 major groups，germplasm resources of the same type were clustered to-gether，and resources of the same geographical origin were clustered together，which effectively reflected the genetic rela-tionship between germplasms.The DNA fingerprints of 55 Brassica campestris ssp.chinensis germplasm resources were constructed by using 15 KASP moecular markers with the highest PIC.【Conlusion】The 41 KASP molecular markers of Brassica campestris ssp.chinensis were developed，which can be used for germplasm resource identification，gene map-ping and marker-assisted breeding of Brassica"campestris ssp.chinensis.

Key words：Brassica campestris ssp.chinensis；KASP molecular markers；genetic diversity analysis；DNA finger-print

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（41701369）；Seed Industry Revitalization Project of Guangdong Rural Revitalization Strategy Special Project（2022-NPY-00-010）；Guangzhou Science and Technology Plan Project（202103000006）；Guangzhou Basic Research Plan Project（SL2022A04J00783）

0引言

【研究意義】不結球白菜（Brassica campestris ssp.chinensis）為十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種，原產于我國，具有生長周期短、營養豐富、適應性強等特點，在全世界范圍內栽培廣泛，是一種具有重要經濟價值的葉菜類蔬菜（侯喜林等，2022）。傳統上對不結球白菜種質的鑒定評價主要依靠表型性狀，但耗時耗力、周期長且準確性不高，成為種質資源高效利用的瓶頸。因此，開發不結球白菜的KASP分子標記對種質資源分析、品種鑒定及分子標記輔助育種等具有重要意義。【前人研究進展】RAPD、SSR、InDel、SNP等分子標記被廣泛地應用于種質資源遺傳多樣性評價、遺傳圖譜構建、基因定位、分子標記輔助育種等方面（González et al.，2015；Fatokun et al.，2018；李曉娟等，2023）。其中，RAPD分子標記技術易受到各種因素的影響，結果不穩定和難重復（Shakee et al.，2013）。SSR分子標記因具有多態性高、操作簡單等優點，但密度相對較低，較難實現規模化自動化檢測（Jewell et al.，2006）。SNP作為第3代分子標記，具有數量多、二態性、穩定遺傳等優點，且易實現高通量和自動化的檢測（Lou et al.，2017），已被應用到水稻、玉米等作物的遺傳多樣性分析及品種鑒定等方面（Semagn et al.，2014；趙久然等，2018；李梓榕等，2020）。其中，KASP是發展最快的SNP分子標記分型方法，具有通量高、省時省力等優點，并逐漸成為遺傳圖譜構建、基因定位、分子輔助育種和種質資源鑒評的主要技術手段（Semagn etal.，2014；Kuang et al.，2016；王富強等，2021；Tang et al.，2022）。李志遠等（2018）對50份甘藍自交系進行重測序，并開發KASP分子標記，500個SNP分子標記中有442個成功轉化為KASP分子標記，轉化成功率為88.4%。Su等（2018）對10個白菜自交系進行基因重測序，篩選獲得3183個SNP位點，成功開發到568個KASP分子標記，轉化成功率為17.8%。Li等（2019）從不結球白菜中開發出722個KASP分子標記，通過對70個不結球材料進行基因分型，篩選獲得50個核心KASP分子標記。任海龍等（2023）利用200個蕓薹種KASP-SNP分子標記對89份菜薹品種進行基因分型，獲得131個分型成功的標記。【本研究切入點】目前，有關不結球白菜分子標記的開發主要集中在RAPD、SSR、InDel等分子標記，鮮見開發KASP分子標記的研究報道。【擬解決的關鍵問題】基于全基因組重測序數據，開發不結球白菜的KASP分子標記，并運用于不結球白菜種質的親緣關系分析及指紋圖譜構建中，為不結球白菜種質資源評價、基因定位及分子輔助育種等提供技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

以本課題組選育的2個不結球白菜高代自交系C40和JY70為試驗材料，用于全基因組重測序。C40的特征為早熟，圓葉，苔高約22.0 cm，橫徑約1.8 cm，播種至初收28～32 d。JY70的特征為中熟，尖葉，苔高約28.0 cm，橫徑約1.6 cm，播種至初收36～40 d。另取55份不結球白菜種質資源用于遺傳多樣性分析（表1），均來自廣東省農作物種質資源保護庫。

1.2基因組重測序和SNP位點挖掘

利用Illumina HiSeqTM平臺對C40和JY70的基因組DNA進行重測序，每個樣品的測序量不低于15 Gb，測序深度約30X。重測序數據經過質控和過濾低質量的堿基，得到高質量的測序數據。使用BWA將測序數據與已公布的白菜基因組B.rapa Chiifu_V3.0（http：//brassicadb.cn/）進行比對分析，得到sam文件（https：//github.com/lh3/bwa）。然后利用samtools和GATK去除重復，并挖掘差異位點（Li et al.，2009）。

1.3 SNP位點篩選和引物設計

根據重測序數據發現C40和JY70間存在差異SNP位點，篩選位點前后各50 bp不存在其他變異，測序深度大于10X的純合SNP位點，然后隨機挑選均勻分布在白菜參考基因組10條染色體上的150個SNP位點，通過引物設計將該150個SNP位點轉化成KASP的標記。

提取SNP位點和側翼序列，利用Primer Premier 5.0對差異位點設計2條KASP上游分型引物和1條下游共同引物，上游分型引物長度推薦24bp，下游共同引物3'端避開A堿基，長度推薦29bp。在設計好的上游分型引物5'端添加能與FAM、VIC熒光結合的特異性序列，FAM熒光結合的特異性序列為5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'，HEX熒光結合的特異性序列為5'-GAAGGTCGGAGTCAACGG ATT-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 KASP分子標記有效性驗證

利用C40和JY70為材料對開發設計的150對KASP引物進行有效性驗證。以C40和JY70的DNA為模板，加入KASP引物和通用的KASP Mas-ter Mix（廣州固德生物技術有限公司）進行PCR擴增。反應體系10.00μL：20～30 ng/μL DNA 2.00μL，2條上游分型引物各0.07μL，下游共同引物0.14μL，2×KASP Master Mixture 5.00μL，ddH2O補足至10.00μL。擴增程序：94℃預變性15 min；94℃20 s，63～55℃1 min，每個循環降0.8℃，進行10個循環；94℃20 s，55℃1 min，進行28個循環。待反應完成后，將PCR擴增產物置于Bio-Rad CFX Connect實時熒光定量PCR儀上，從而獲取對應的產物熒光信號值，完成基因分型。熒光信號值的讀取條件為16℃，20 s。根據基因型分型效果和在白菜基因組染色體上的分布信息，挑選有效的KASP分子標記。

1.5不結球白菜種質資源遺傳多樣性分析

利用挑選的有效KASP分子標記對55份不結球白菜種質資源進行基因型檢測，方法同1.4。使用PowerMarker v3.25計算多態性信息含量（PIC）和基因多樣性指數（Nagyet al.，2012），計算各種質材料間Nei’s遺傳距離。根據Nei’s的遺傳距離，通過MEGA 7.0構建遺傳聚類樹狀圖

2結果與分析

2.1基于重測序的不結球白菜SNP位點分析結果

重測序數據經過質控后，從2個測序材料C40和JY70分別得到15.663和15.178 Gb測序數據，序列質量Q20≥97.18%，Q30≥92.46%，GC含量為42.41%～42.71%，測序數據與白菜基因組的比對率為96.17%～97.11%。經過比對發現，C40和JY70在全基因組范圍內分別檢測到1373433和1303118個SNP位點，在基因組上的分布如表2。SNP變異位點位于基因間區的最多，占40.7%～41.3%，其次是位于外顯子區域，占21.4%～21.8%，位于剪接位點的SNP變異最少。SNP變異以轉換為主，轉換與顛換的比率為1.3555。

2.2 KASP分子標記開發及篩選

通過比對分析發現，C40和JY70之間基因型不一致、測序深度大于10X且等位基因純合的SNP位點有460849個，從每條染色體上選擇分布相對均勻的15個SNP位點，設計成KASP引物。利用C40和JY70對150對KASP引物進行基因型分型檢測，有86對KASP引物成功分型。為了進一步篩選出通用性好的KASP分子標記，將86對KASP引物對55份不結球白菜種質資源進行基因型分型，獲得41個高質量的KASP分子標記（表3）。這些分子標記分布在不結球白菜10條染色體上，第3染色體上的KASP標記分布最多，為6個；第10染色體上的KASP分子標記分布最少，為3個；其余染色體上分別分布4個KASP分子標記。這些分子標記可準確地將相同基因型的材料進行聚類分析（圖1），同時陰性對照（NTC）始終聚集在一起，且不產生信號。其他引物被淘汰的原因主要有2個：（1）可分型但在一些基因型中的擴增效率不高；（2）可將相同基因型的樣本聚類，但聚集略分散等。

2.3 KASP分子標記遺傳多樣性參數分析

利用41個KASP分子標記對55份不結球白菜資源材料進行遺傳多樣性分析，結果（表4）顯示主要等位基因頻率為0.5000～0.9273，平均為0.6643，處于較高水平；基因多樣性指數為0.1349～0.5000，平均為0.4257；雜合度為0.1091～0.5455，平均為0.3054；PIC為0.1258～0.3750，平均為0.3322，PICgt;0.2500的位點占所有位點的94.5%，多態性較高。

2.4 KASP分子標記在種質鑒定中的應用

利用KASP分子標記數據計算55份不結球白菜種質間的遺傳距離，結果發現這些種質資源間遺傳距離為0.0723～0.6970。遲熟韶關菜心和韶關高腳菜心間的遺傳距離最小，為0.0723，說明二者親緣關系近，均在韶關市南雄縣相鄰的2個鎮收集獲得。利用MEGA 7.0中UPGMA方法基于遺傳距離進行聚類分析，結果（圖2）顯示，55份不結球白菜種質資源可分為三大類群：第Ⅰ大類群由19份種質組成，包括12份小白菜種質、4份中熟小菜心種質（編號1、5、6和7）和3份遲菜心種質（編號19、21和52），其中4份中熟小菜心種質聚在一起。第Ⅱ大類群僅包括9份種質資源（編號9、10、17、25、32、33、43、45和49），主要是晚熟遲菜心類型。第Ⅲ大類群由剩余27份種質資源組成，包括16份遲菜心種質、7份小菜心種質（編號2、3、4、8、11、42和48）和3份小白菜種質（編號41、53和55），可再細分成2個亞群，其中，亞類Ⅲ-i包括12份遲菜心種質，這些資源主要來源于廣州增城和惠州龍門，地理位置相鄰；亞類Ⅲ-ii包括7份小菜心種質、3份小白菜種質和5份遲菜心種質，其中7份小菜心種質聚在一起，3份小白菜種質和5份遲菜心種質中地理來源相同的資源大多聚在一起。總體來看，相同類型的種質資源聚類在一起，其中地理來源相同的資源又聚類在一起。

2.5 KASP分子標記在構建不結球白菜種質DNA指紋圖譜中的應用

從41個KASP分子標記中選取PIC最高的15個標記（SNP3、SNP5、SNP6、SNP13、SNP16、SNP20、SNP25、SNP27、SNP28、SNP30、SNP31、SNP32、SNP34、SNP36和SNP38），用于不結球白菜DNA指紋圖譜構建。經驗證發現，這15個KASP分子標記可將55份不結球白菜資源材料全部區分開來，將分型結果轉化為二元編碼數據，得到55份不結球白菜資源的DNA指紋圖譜（圖3）。

3討論

本研究對2份不結球白菜高代自交系C40和JY70進行基因組重測序，以白菜基因組序列為參考序列，分別檢測到1373433和1303118個SNP位點。C40和JY70之間基因型不一致，測序深度大于10X且等位基因純合的SNP位點有460849個，平均每1 Mb出現950個SNP位點。Su等（2018）在10個白菜種資源材料基因組中檢測到709037個SNP位點，平均每1 Mb出現1461個SNP位點。而在不結球白菜中，SSR的平均密度為62.93個/Mb（Song et al.，2015）。甘藍型油菜基因組每1 Mb有550個InDels，其中A基因組平均1 Mb有873個InDels。由此可見，不結球白菜中SNP變異位點比SSR和InDel變異位點更豐富，為全基因組范圍內分子標記開發提供更優選擇。

當前基于PCR和熒光檢測的KASP分子標記技術可支持低、中和高通量的SNP檢測，操作簡單快捷，滿足了海量SNP分子標記轉化利用的要求。李志遠等（2018）對50份甘藍自交系進行重測序并開發KASP分子標記，結果發現500個SNP位點中有442個成功轉化為KASP分子標記，轉化成功率為88.4%。Su等（2018）對10個白菜自交系進行基因重測序，篩選獲得3183個SNP位點，成功開發得到568個KASP分子標記，轉化成功率為17.8%。本研究對2個不白菜自交系進行全基因重測序，從460849個SNP數據中篩選獲得150個SNP位點，通過引物設計將其轉化成KASP分子標記，從而獲得86個分型成功的KASP分子標記，開發成功率為57.3%。不同研究中KASP分子標記開發成功率不同，可能的原因是SNP變異位點兩側的基因組序列不準確，導致擴增失敗。因此，應提高SNP變異位點兩側基因序列的準確性。種質資源是育種工作的基礎，明確種質資源之間的親緣關系是雜交組配和目標群體構建的有效途徑。本研究開發的KASP分子標記可有效區分55份不結球白菜種質資源，根據各種質間遺傳距離分析其親緣關系，為拓展材料的遺傳背景及雜交組合的配制提供參考依據。

4結論

基于全基因組重測序數據開發不結球白菜的KASP分子標記，篩選獲得41個高質量的不結球白菜KASP分子標記，可用于不結球白菜種質資源鑒定、基因定位及分子標記輔助育種。

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（責任編輯：陳燕）