青蒿同源四倍體誘導與戶外栽培研究

摘 要：青蒿是一類菊科蒿屬草本植物，從中提取的青蒿素是目前新型一級抗瘧特效藥所需的重要原材料。為改良現有的青蒿品種，研究倍性育種提高青蒿素含量的可能性，采用植物組織離體培養技術，以青蒿的組培幼苗為試驗材料，選用秋水仙素作為化學誘導劑，誘導出青蒿同源四倍體；并對誘導植株進行根尖細胞染色體檢測和流式細胞儀檢測，將成功誘導的四倍體組培苗進行煉苗、戶外栽培，觀察其性狀并檢測青蒿素含量。試驗誘導青蒿同源四倍體的條件：以青蒿葉片培養出愈傷組織，轉移至100 mg/L秋水仙素誘導基中，培養24 h。研究發現，青蒿同源四倍體植株的氣孔開度大、根系較粗、葉片顏色較深，有一定的植株抗性，其青蒿素含量高于二倍體植株。研究可為青蒿的倍性遺傳育種提供一定的技術參考。

關鍵詞：青蒿；秋水仙素；同源四倍體；青蒿素

中圖分類號：S567.219 文獻標志碼：B 文章編號：1674-7909（2025）5-88-5

DOI：10.19345/j.cnki.1674-7909.2025.05.018

0 引言

青蒿（Artemisia annual L.）是菊科蒿屬草本植物，從中提取的青蒿素及其衍生物是目前新型一級抗瘧藥的特效原材料［1］。隨著臨床對自身免疫性疾病（包括系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、銀屑病等）的深入研究，青蒿的應用范圍變得更加廣泛［2］。然而，青蒿素的化學合成涉及多步復雜過程，且成本高，目前還無法大量進行工業化人工合成，其主要來源仍然是植物提取。為選育出性狀優良、青蒿素含量高的青蒿多倍體品種，以及建立青蒿同源四倍體組織培養體系，研究團隊參考前人以秋水仙素為誘導劑進行青蒿倍性育種研究［3］，開展了相關試驗，為青蒿的新品種選育提供一定的技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料

試驗材料是由廣西仙草堂制藥有限責任公司組培室培育的無菌、生長狀態良好、葉片大的二倍體青蒿組培苗（染色體數目2n=18），株系號為QH-8。流式細胞儀內參材料是來自中國科學院昆明植物研究所的二倍體番茄種子（染色體數目2n=12）。

1.1.2 供試器材

供試器材有光學顯微鏡物鏡（型號LEICA DM1000）、流式細胞儀（型號BD FACScalibur）、高效液相色譜儀（型號島津LC2030plus）、滅菌鍋、電子天平、燒杯、棕色容量瓶、組培瓶、培養皿、試管、剪刀、鑷子、蒸發皿、漏斗。

1.1.3 供試試劑

供試試劑有秋水仙素、青蒿標準品、冰醋酸、鹽酸（HCl）、石油醚、甲醇、無水乙醇，均為分析純試劑；花寶一號、瓊脂、1/2 MS培養基、MS培養基、萘乙酸（NAA）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、碘化丙啶（PI）、核糖核酸酶（RNAase）、8-羥基喹啉溶液，均為生物級試劑；白砂糖；馬鈴薯；無菌水；蒸餾水；解離液；改進卡寶品紅染色液。

1.2 青蒿植株多倍體的誘導

1.2.1 誘導劑的配制

精確稱取1.00 g秋水仙素于燒杯中，加入一定量蒸餾水溶解后，轉移至50 mL棕色容量瓶中定容，母液質量濃度為20 g/L，將其置于冰箱中4 ℃保存，備用。

1.2.2 培養條件

愈傷組織培養基：MS（4.94 g/L）+NAA（0.3 mg/L）+6-BA（2.5 mg/L）+白砂糖（30 g/L）+馬鈴薯（100 g/L）+瓊脂（6.8 g/L）。生根培養基：1/2 MS（2.47 g/L）+NAA（0.5 mg/L）+白砂糖（30 g/L）+花寶一號（1.0 g/L）+馬鈴薯（100 g/L）+瓊脂（6.8 g/L）。組織培養環境條件：實驗室培育，培養溫度（25±2） ℃，培養濕度50%～70%，光照強度1 500～2 000 lx，每天光照時間12 h。

1.2.3 青蒿叢芽愈傷組織培養

選擇葉片大、形態良好的QH-8株系組培苗作為試驗材料，將青蒿幼苗的幼葉剪出傷口，分別接種在愈傷組織培養基中，培養叢芽，實驗室培育3周，對生長良好的叢芽進行下一步誘導。

1.2.4 叢芽誘導培養基、生根培養基培育

在愈傷組織培養基（1 L）中分別加入0 mL、2.5 mL、4 mL、10 mL秋水仙素母液，制成誘導培養基（秋水仙素質量濃度為0 mg/L、50 mg/L、80 mg/L、100 mg/L）。將生長良好的叢芽轉移接種到上述培養基中，將秋水仙素0 mg/L的誘導培養基作為對照組，將其他各組作為誘導組，每組分別培養3個時間段（24 h、48 h、72 h）。將誘導足夠時間的叢芽用無菌水沖洗3～5次，轉移至生根培養基中進行生根培養。在實驗室培育5周，統計叢芽死亡率和生根率。生長良好的青蒿對照組、誘導組苗作為待鑒定苗繼續培育。

1.3 青蒿多倍體植株的鑒定

1.3.1 氣孔觀察

在組培2個月的對照組和誘導組青蒿植株中，挑選出與對照組二倍體苗相比，在形態特征上存在明顯變異的誘導組苗。這些變異包括葉片褶皺明顯、葉片顏色深、莖部粗壯等［4］。取這些誘導組苗的全展葉片制成玻片，在顯微鏡下觀察，比較各青蒿植株氣孔的開度大小。

1.3.2 流式細胞儀鑒定

內參樣品為二倍體番茄種子（基因組DNA含量約為0.95 Gb，染色體數目2n=12）［5］，試驗樣品為青蒿對照組、誘導組嫩葉。將樣品組織切碎后，在解離液中靜置10 min，再進行過濾，得到細胞核懸浮液。在該懸浮液中加入適當體積的PI和RNAase溶液，放置在冰上處理，避光染色0.5～1.0 h。利用BD FACScalibur流式細胞儀對染色后的細胞核懸浮液樣品進行檢測，檢測PI的發射光熒光強度，計算基因組DNA含量（Gb），計算公式見式（1）［6］。

青蒿樣品基因組DNA含量=內參樣品基因組DNA含量×青蒿樣品的熒光強度/內參樣品的熒光強度" "（1）

1.3.3 根尖細胞染色體鑒定

收集對照組和誘導組植株根系，仔細且輕柔地洗去培養基，分別將根轉移到5 mL試管中并編號，置于冰水中靜置12 h。靜置結束后，再轉移到1.5 mL試管中，添加0.002 mol/L的8-羥基喹啉溶液，在黑暗條件下25 ℃預處理3 h；預處理完成后，用無菌水清洗5次，將根尖用卡諾式固定液（無水乙醇與冰醋酸體積比3∶1）在冰上固定2 h；固定完畢后，用無菌水清洗5次，再用45%冰醋酸和1 mol/L HCl按體積比1∶1在水浴鍋（溫度60 ℃）中酸解根尖5 min；酸解完成后，用無菌水清洗5次，加入蒸餾水浸泡后低滲2 h；用改進卡寶品紅染色液染色10～15 min；制片后在LEICA DM1000光學顯微鏡下尋找清晰的染色體圖像，記錄根尖細胞染色體數目。

1.4 戶外栽培與農藝性狀觀察

在組培室繼續培養并繁殖青蒿對照組二倍體植株、誘導成功的四倍體植株各50～100株，作為戶外栽培苗。1月底，挑選育苗地煉苗；苗應豎直種植，種植后澆水，蓋保溫膜和遮陽網，待幼苗萌發新根、新莖后再通風；3月將青蒿移栽至大田，種植間隔1.2 m左右［7］。種植1列對照組苗、1列四倍體苗，同時播種1列，每列20株；3—7月，做好田間管理，保證植株正常生長；8月中旬，對青蒿植株進行農藝性狀觀察并記錄。

1.5 青蒿素含量檢測

1.5.1 戶外栽培青蒿植株采樣

8月中旬，在青蒿生長后期進行取樣檢測。取樣時，選取主莖粗壯、葉片多且顏色深綠、生長茂盛的青蒿植株。二倍體、四倍體及播種青蒿植株各為一組，每組隨機取5株分別混合收集。采樣時，取植株上、中、下各部分多葉分枝3枝，在太陽下曬干，取干燥葉裝入樣品袋并標記，以備檢測。

1.5.2 青蒿素含量檢測

將各組樣品的干葉打成細粉，每組分別稱取2次，每次精確稱取4.00 g。采用石油醚提取法，通過層析柱洗脫得到樣品洗脫液，將洗脫液置于蒸發皿中濃縮。對提取到的濃縮物用甲醇稀釋，并定容至10 mL，作為樣品并編號。稱取青蒿標準品0.05 g，用甲醇定容至50 mL，作為對照品。用微孔濾膜二次過濾樣品和對照品，每組分別取上清液1.5 mL放入進樣瓶。利用高效液相色譜儀（型號島津LC2030plus），測定各組樣品的青蒿素含量。

2 結果與分析

2.1 青蒿多倍體植株的誘導

秋水仙素能抑制正在分裂的細胞中紡錘體的形成，導致染色體無法移向細胞的兩極，從而引起細胞內染色體數目加倍［8］。與物理誘變和生物誘變相比，化學誘變法具有經濟方便、誘變作用專一性強的優點。不同質量濃度的秋水仙素誘導培養基在不同培養時間條件下，對青蒿植株的誘導影響各不相同。如表1所示，在同一培養時間內，無秋水仙素、低質量濃度誘導培養基中培育的叢芽生長狀態較優，死亡率較低，且轉移至生根培養基后多數都能生根，生根率高于高質量濃度誘導培養基中的叢芽。在同一質量濃度秋水仙素培養基中，隨著培養時間的延長，叢芽的死亡率逐漸上升，轉移至生根培養基后的生根率逐漸下降。試驗結果表明，秋水仙素對組培苗有一定的危害，較高質量濃度秋水仙素和長時間培養會導致幼苗無法繼續生長。因此，選擇適宜的誘導劑質量濃度和培養時間，是試驗成功的關鍵。為了進一步優化誘導條件，需要進行更細分的誘導劑質量濃度與誘導時間試驗研究。

2.2 青蒿多倍體植株的鑒定結果分析

2.2.1 氣孔初步鑒定

對照組植株編號為0號樣，作為參照物。對已生根存活、生長良好的誘導組植株進行觀察，從中挑選出葉片顏色深、莖粗壯，與對照組植株在形態特征上存在差異的小苗。共挑選出3組：50 mg/L-48 h、80 mg/L-72 h、100 mg/L-24 h，分別編號為1號樣、2號樣、3號樣。分別取這些植株的葉片制成玻片，在LEICA DM1000光學顯微鏡同一倍數下觀察氣孔開度大小。如圖1所示，二倍體對照組的葉片氣孔較小且開度較小；其他3組葉片的氣孔較肥大，開度較大，其中2號樣和3號樣氣孔最明顯。以上觀察僅是間接篩選，仍需要通過直接鑒定基因組DNA含量和根尖細胞染色體數目來確認誘導結果。

2.2.2 基因組與根尖細胞染色體鑒定

流式細胞術是測定基因組DNA含量常用的測定方法，通過比較內參植物熒光強度，從而計算出待測樣品DNA含量［9］；鑒定根尖細胞染色體數目則能更清晰地闡明變異情況，二者共同確定誘導結果。試驗結果如圖2、表2所示，3號樣基因組DNA含量約為2.53 Gb，染色體數目為36條。3號樣確定為成功誘導變異的青蒿同源四倍體，誘導條件：以青蒿葉片培養出愈傷組織，轉移至100 mg/L秋水仙素誘導培養基，誘導培養24 h。

2.3 青蒿植株農藝性狀與青蒿素含量對比分析

青蒿植株在戶外生長至8月中旬時，其青蒿素含量處于峰值，可進行農藝性狀觀測與青蒿素含量檢測。試驗結果如表3、表4所示，青蒿同源四倍體植株根部較粗、葉片顏色較深，表現出一定的植株抗性，且其青蒿素含量均高于二倍體植株和播種植株，其青蒿素平均含量為33.12‰。因此，青蒿的倍性育種具有可行性。

3 討論與結論

隨著生物技術的發展，倍性育種在多個領域已經得到了廣泛應用。例如，在藥用植物領域，有關于廣藿香［10］、丹參［11］、鐵皮石斛［12］等多倍體育種的研究。研究探討了青蒿倍性育種的可能性，采用秋水仙素化學誘導青蒿植株，并進行戶外栽培，檢測多倍體植株青蒿素含量。基于青蒿離體快繁組培技術，在秋水仙素100 mg/L-24 h誘導條件下，成功誘導出同源四倍體3號樣植株，基因組DNA含量約為2.53 Gb，染色體數目為36條。對四倍體植株進行戶外栽培觀測，發現其根部較粗、葉片顏色較深，且有一定的植株抗性，青蒿素平均含量為33.12‰，均高于二倍體植株。試驗結果符合多倍體植物一般具有的根、莖、葉、花、果實增大，抗逆性增強和藥用活性成分含量增加等特性［13］。綜上可知，倍性育種技術可用于青蒿育種，提高青蒿素的含量。

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Induction of Homologous Tetraploid Artemisia Annua and Outdoor Cultivation Study

WANG Mengchu LIANG Yunmei XIE Gang XIE Pengming

Guangxi Xian Cao Tang Pharmaceutical Co.， Ltd.， Liuzhou 545400， China

Abstract： Artemisia annua is a herbaceous plant from the Asteraceae family， and artemisinin extracted from it is an important raw material for the new generation of first-line antimalarial drugs. To improve existing Artemisia annua varieties and explore the possibility of increasing artemisinin content through polyploid breeding， plant tissue culture techniques were employed， with in vitro cultured seedlings of Artemisia annua as experimental materials. Colchicine was used as a chemical inducer to induce homologous tetraploids. Root tip cell chromosomes and flow cytometry were used to analyze the induced plants. Successfully induced tetraploid seedlings were subjected to acclimatization， and outdoor cultivation， and observed for traits and artemisinin content. The conditions for inducing homologous tetraploids were as follows： the callus was induced from Artemisia annua leaves and then transferred to an induction medium containing 100 mg/L colchicine， where it was cultured for 24 hours. The study found that homologous tetraploid Artemisia annua plants had larger stomata， thicker roots， darker leaves， and enhanced resistance. The artemisinin content was higher than in diploid plants， which could provide a technical research reference for the polyploid genetic breeding of Artemisia annua.

Key words： Artemisia annua; Colchicine; homologous tetraploid; Artemisinin

（欄目編輯：董清芝）

基金項目：廣西科技重大專項“肉桂等廣西特色藥材高質量生產關鍵技術及系列產品開發研究”（桂科AA22096021）。

作者簡介：王夢楚（1997—），女，本科，助理工程師，研究方向：青蒿生物技術和遺傳育種研究；梁云妹（1995—），女，本科，中級工程師，研究方向：青蒿生物技術和遺傳育種研究；謝鵬鳴（1993—），男，本科，工程師，研究方向：中藥材種源遺傳育種與栽培。

通信作者：謝剛（1981—），男，本科，高級工程師，研究方向：中藥材種源選育、種植加工、新產品開發和副產品綜合。