高效液相串聯質譜法測定馬鈴薯中α-茄堿

摘 要：目的：建立高效液相色譜串聯質譜法測定馬鈴薯中α-茄堿的方法。方法：以5%乙酸溶液作為提取溶液，樣品經12 000 r·min-1低溫離心后，取上清液1 mL經0.22 μm微孔濾膜過濾，然后使用0.1%甲酸水溶液-乙腈（90∶10，體積比）溶液進行稀釋，經Waters BEH C18柱分離，以甲酸和0.1%甲酸水溶液為流動相，電離方式為噴霧正離子模式，檢測模式為多反應監測模式，最終通過高效液相色譜串聯質譜進行分析。結果：α-茄堿在2～200 ng·mL-1線性關系良好（r＞0.999），方法檢出限為0.1 ng·mL-1，定量限為0.3 ng·mL-1，平均加標回收率在93.2%～104.3%，相對標準偏差在3.2%～4.1%。結論：本研究所建立的方法方便快捷、準確度高、穩定性好，能夠對馬鈴薯中α-茄堿進行定量分析。

關鍵詞：高效液相色譜串聯質譜法；馬鈴薯；α-茄堿

Abstract： Objective： To establish a high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the determination of α - solanine in potatoes. Method： 5% acetic acid solution was used as the extraction solution. After the sample was centrifuged at a low temperature of 12 000 r·min-1， 1 mL of the supernatant was taken and filtered by a 0.22 μm microporous membrane. Then， 0.1% formic acid aqueous solution acetonitrile （90∶10， volume ratio） solution was used for dilution. After separation by Waters BEH C18 column， using formic acid and 0.1% formic acid aqueous solution as the mobile phase. The ionization mode was spray positive ion mode， and the detection mode was multi reaction monitoring mode. Finally， the analysis was performed by high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Result： The linear relationship of α - solanine was good between 2～200 ng·mL-1 （r＞0.999）， with a detection limit of 0.1 ng·mL-1 and a quantification limit of 0.3 ng·mL-1. The average recovery rate was 93.2%～104.3%， and the relative standard deviation was 3.2%～4.1%. Conclusion： The method established in this study is convenient， fast， accurate， and stable， and can quantitatively analyze alpha solanine in potatoes.

馬鈴薯作為一種重要的糧食作物，被廣泛視為全球多個國家的關鍵食品之一，并被列入7種主要糧食作物之中，其重要性僅次于水稻、玉米和小麥[1-3]。馬鈴薯具有益氣、健脾、和胃、解毒和消腫等功效，但值得注意的是，青紫皮或發芽的馬鈴薯中含有過量的龍葵素，含量可高達430 mg/100 g，而人體攝入0.2～0.4 g龍葵素就可能發生中毒[4-5]。

龍葵毒素，又稱茄堿、龍葵堿或馬鈴薯毒素，是一種由葡萄糖殘基和茄啶組成的弱堿性糖苷，存在于馬鈴薯、番茄及茄子這些茄科植物中[6]。當馬鈴薯發芽時，其內部的龍葵毒素含量會大幅增加。基于糖基種類的不同，龍葵堿可分為茄堿與卡茄堿兩大類。在馬鈴薯中，α-茄堿為龍葵堿的主要成分，占總量的95%以上，且其毒性極強[7]。α-茄堿由疏水性的甾體苷元和親水性的低聚糖側鏈部分組成。后者主要由葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等單糖單元構成[8]，而糖苷配基部分則是由環戊烷多氫菲與含氮雜環結構相連而成。α-茄堿不溶于水、乙醚、氯仿，但能溶于乙醇，在堿性環境下能夠保持穩定狀態；而在中性或酸性條件下，α-茄堿的糖苷鍵容易發生水解反應，導致苷元和單糖的釋放，從而減弱其毒性[9]。α-茄堿對胃腸道黏膜有較強的刺激性和腐蝕性，還會麻痹中樞神經系統，特別是對呼吸和運動中樞作用顯著，表現為惡心、嘔吐、腹瀉等，嚴重者甚至可能導致死亡[10]。

目前，α-茄堿的檢測方法多樣，其提取技術主要包括以下幾種。①水或酸水回流提取法。該方法基于堿性較強的生物堿在植物體內多以鹽的形式存在且可溶于水的特性，通過水或酸水回流有效提取α-茄堿。②有機溶劑提取法。通常采用乙醇等有機溶劑對粉碎后的植物材料進行浸提，然后經過過濾、濃縮得到提取物。隨著科技的進步，超聲提取、微波輔助提取、超臨界流體萃取、分子印跡技術和生物膜技術等新型提取方法逐漸應用于龍葵毒素的提取過程。這些新技術具有提取效率高、操作簡便的優勢，但具體應用時仍需考慮實驗條件和目標產物純度的要求。α-茄堿的檢測方法主要包括色譜法（如薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法）、酶聯免疫吸附測定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）和生物傳感器法[11-13]。色譜法是目前α-茄堿分析中最常用的方法，它能與多種檢測儀器結合，實現定性和定量分析。ELISA以其快速、高靈敏度和強特異性著稱，但其依賴特定抗體，且分析結果受溫度波動的影響。相比之下，生物傳感器法無須復雜的儀器設備，操作簡便且迅速，適用于快速檢測需求，但其易受環境中多種物質的干擾，穩定性較差。因此，建立一種操作簡便、準確、快速的檢測方法用于馬鈴薯中α-茄堿的測定顯得尤為必要。

本文建立了一種測定馬鈴薯中α-茄堿的高效液相色譜串聯質譜法，通過結合液相色譜和質譜檢測器，實現快速、準確地檢測馬鈴薯中α-茄堿。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯，市售。

乙腈、甲酸、乙酸（色譜純，德國默克公司）；甲醇中α-茄堿標準溶液（100 μg·mL-1，天津阿爾塔公司）。

1.2 儀器與設備

LCMS-8060高效液相色譜-三重四極桿質譜儀，日本島津公司；多點渦旋振蕩器，德國海道爾夫公司；Milli-Q IQ 7000超純水系統，美國密理博公司；超聲儀，上海科導超聲儀器有限公司；GM200粉碎機，德國萊馳公司；Centrifuge 5804 R冷凍離心機，德國艾本德公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

（1）標準儲備液。準確移取100 μL甲醇中α-茄堿標準溶液（100 mg·L-1），用0.1%甲酸水∶乙腈（90∶10，體積比）定容，配制成1 μg·mL-1的標準儲備液。

（2）標準曲線系列溶液。準確吸取20、50、100、200、500、1 000 μL和2 000 μL的標準儲備液，用0.1%甲酸水∶乙腈（90∶10，體積比）定容至10.0 mL，配制成濃度為2、5、10、20、50、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的系列標準溶液。

1.3.2 樣品前處理

將馬鈴薯帶皮打碎，準確稱取0.5 g（精確至0.001 g）均質樣品于15 mL離心管中，加入4 mL 5%乙酸溶液，渦旋混勻后振蕩提取2 h。在4 ℃下以12 000 r·min-1 離心10 min，吸取1 mL經0.22 μm水相濾膜過濾，濾液使用0.1%甲酸水溶液∶乙腈（90∶10，體積比）溶液稀釋50倍后上機測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流量：0.3 mL·min-1；進樣量：2 μL；柱溫：40 ℃；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為甲酸，梯度洗脫。梯度洗脫程序見表1。

1.3.4 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描模式：正離子模式；碰撞氣：氮氣；霧化氣流量：3 L·min-1；加熱氣流量：10 L·min-1；干燥氣流量：10 L·min-1；接口溫度：300 ℃；脫溶劑溫度：526 ℃；脫溶劑管溫度：250 ℃；加熱塊溫度：400 ℃。α-茄堿具體質譜參數見表2。

1.4 數據處理

采用島津Labsolution軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

考察0.1%甲酸水溶液和甲醇、0.1%甲酸水溶液和乙腈、0.1%乙酸水溶液和甲醇3種流動相體系對α-茄堿的影響。結果顯示，當流動相為0.1%甲酸水溶液和甲醇時，α-茄堿出峰時間較短且峰形良好，因此選擇流動相體系為0.1%甲酸水溶液和甲醇。

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性參數、檢出限和定量限

取通過1.3.1方法得到的系列標準溶液進行測定，以質譜響應強度作為縱坐標，以α-茄堿的濃度作為橫坐標，繪制標準工作曲線，求回歸方程和相關系數。α-茄堿在2～200 ng·mL-1線性關系良好，相關系數r＞0.999，線性方程為y=98 277.1x+43 557.4。以3倍信噪比（S/N）計算檢出限，以3倍檢出限計算定量限。得出α-茄堿的檢出限為0.1 ng·mL-1，定量限為0.3 ng·mL-1。

2.2.2 回收率與精密度

取空白馬鈴薯樣品，按照低、中、高（10、50、100 ng·mL-1）3個水平濃度進行加標回收實驗，每個水平平行測定6次，計算平均加標回收率和相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。由表3可知，在3個添加水平下，α-茄堿的平均回收率在93.2%～104.3%，RSD在3.2%～4.1%。

2.3 實際樣品檢測

采用本試驗方法對不同市場的50份馬鈴薯進行檢測，結果顯示，50份樣品中均檢測出α-茄堿，含量在10.192～76.605 μg·kg-1，但均未超出限量標準。

3 結論

本研究建立了一種高效液相色譜串聯質譜法測定馬鈴薯中α-茄堿的方法。結果顯示，α-茄堿在2～200 ng·mL-1線性關系良好，相關系數大于0.999；平均回收率在93.2%～104.3%，RSD在3.2%～4.1%。該方法靈敏度高，準確性好，能滿足馬鈴薯中α-茄堿的實際檢測需求。

參考文獻

[1]聶利珍，張志成，謝銳，等.彩色馬鈴薯StANS1a基因的克隆及表達分析[J].華北農學報，2023，38（4）：38-46.

[2]羅其友，劉洋，高明杰，等.中國馬鈴薯產業現狀與前景[J].農業展望，2015，11（3）：35-40.

[3]頡亞珍.我國馬鈴薯產量多年穩居世界第一[N].北京日報，2023-09-09（4）.

[4]劉玉霖，李世偉，裴雅婷，等.馬鈴薯捕光色素結合蛋白基因StCP24的克隆及及其功能研究[C]//2024年第二十五屆中國馬鈴薯大會論文集.北京：中國作物學會，2024：333-334.

[5]呂粉紅，喬益，杜辰生，等.甘肅地區馬鈴薯良種繁育與高效栽培技術[J].種子科技，2024，42（24）：49-51.

[6]張子妮，潘汝欣，武慧敏，等.龍葵堿檢測技術研究進展[J].防化研究，2024，3（1）：64-71.

[7]王可，陳龍星，田會方，等.高效液相色譜-串聯質譜法測定涼拌菜中4種植物毒素[J].食品工業科技，2019，40（24）：190-193.

[8]郭旭光.蔬菜毒素知多少[J].家庭醫學，2023（9）：38.

[9]楊柯.黃牛馬鈴薯中毒的治療[J].吉林畜牧獸醫，2020，41（9）：74.

[10]李紅紅，張亞娟.26頭豬馬鈴薯中毒的診治體會[J].畜牧獸醫雜志，2023，42（6）：137-138.

[11]李美.馬鈴薯α-茄堿檢測體系建立及其含量影響因素的研究[D].長沙：湖南農業大學，2013.

[12]孫玉婷，李寅.UPLC-MS/MS法檢測中毒血液中α-茄堿和α-卡茄堿[J].山西化工，2024，44（6）：61-62.

[13]盧嘉豪，張飛，林欽恒，等.固相萃取-液相色譜串聯質譜測定飼料中的α-茄堿和α-卡茄堿[J].山東化工，2021，50（20）：108-110.

基金項目：江蘇省第六期“333高層次人才培養工程”第三層次培養對象[（2022）3-4-163]；常州市“十四五”衛生健康高層次人才培養工程-拔尖人才（2022CZBJ099）。

作者簡介：徐夢媛（1994—），女，安徽碭山人，碩士，主管技師。研究方向：理化檢驗。

通信作者：黎俊宏（1982—），男，湖南郴州人，碩士，副主任技師。研究方向：理化檢驗。E-mail： 41788950@qq.com。