響應面法優化稠李果色素提取工藝

摘 要：本文以稠李果為原料，采用超聲輔助醇提取法來提取稠李果中色素。通過單因素試驗，研究提取溫度、乙醇體積分數、超聲時間、提取溶液pH值以及料液比對色素提取率的影響。采用響應面法對色素提取條件進行優化，并結合實際情況調整，結果顯示提取工藝條件調整為提取溫度50 ℃、乙醇體積分數60%、料液比1∶10（g∶mL），提取時間30 min。在此條件下，稠李果提取液中色素吸光度為0.615，折合稠李果色素含量為5.54 mg·g-1。

關鍵詞：稠李果；響應面法；色素；提取；超聲輔助醇提取法

Abstract： In this paper， Prunus padus fruit was used as the raw material， and the pigment in Prunus padus fruit was extracted by ultrasonic-assisted alcohol extraction method. Through single-factor experiments， the effects of extraction temperature， ethanol volume fraction， ultrasonic time， pH value of the extraction solution， and solid-liquid ratio on the pigment extraction rate were studied. The response surface methodology was adopted to optimize the pigment extraction conditions， and adjustments were made considering the actual situation. As a result， the extraction process conditions were adjusted to an extraction temperature of 50 ℃， an ethanol volume fraction of 60%， a solid-liquid ratio of 1∶10 （g∶mL）， and an extraction time of 30 minutes. Under these conditions， the absorbance of the pigment in the Prunus padus fruit extract was 0.615， and the equivalent Prunus padus fruit pigment content was"5.54 mg·g-1.

色素是廣泛存在于植物、動物和微生物細胞中的化學物質，也是生命科學領域的一個重要研究對象。色素由天然色素和人工合成色素共同組成。多數人工合成色素經過人體代謝后會產生有毒物質，對人體有很大的毒副作用。因此，合成色素在我國允許使用的程度被大大限制[1]。與人工合成色素相比，絕大多數的天然色素無毒副作用，且具有特定的營養價值和醫療保健功效[1-3]。中國目前可以利用的天然色素有限，還有大量的天然色素尚未被廣泛研究，所以對色素提煉與純化技術進行深入研究具有重要意義[2]。

稠李（Prunus padus L.），薔薇目薔薇科稠李屬植物[4]。稠李果近球狀，直徑為1.0～1.2 cm，成熟時為紫黑色。稠李果內含有大量的天然紅色素，具有較好的穩定性、抗氧化性、抗疲勞等功效，其目前主要用于觀賞，沒有很好地發揮其在食品中的應用價值[3]。本試驗旨在探究稠李果中色素的提取，在保證提取純度的前提下，優化其工藝條件，提高提取率。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 實驗材料與試劑

稠李果，吉林農業科技學院藥植園，經過吉林農業科技學院中藥學院教師鑒定；無水乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉，均為分析純，沈陽市新化試劑廠；香草醛（分析純），天津市光復精細化工研究所；兒茶素標準品（≥98%），成都芬瑞斯生物技術有限公司；標準pH緩沖劑（分析純），天津市致遠化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

XS-10多功能粉碎機，上海兆申科技有限公司；DHG-9420 A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；星火牌C型玻璃儀器氣流烘干器，鄭州長城科工貿有限公司；KQ-700V數控超聲波清洗機，濟寧天華超聲電子儀有限公司；TGL-20000CR高速離心機，上海安亭科學研究廠；AUY120分析天平，島津企業管理（中國）有限公司；UV-2450紫外分光光度計，島津企業管理（中國）有限公司；METTLERTOLEDO酸度計，梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 稠李果預處理

采摘新鮮稠李果，清洗干凈，經鑒定樣品可用于色素提取試驗。將清洗好的稠李果放入電熱鼓風恒溫干燥箱中，恒溫50 ℃烘干24 h，去核后打磨成粉，過80目篩密封保存備用。

1.2.2 提取工藝

稱取稠李果粉→加入100 mL圓底燒瓶→加入乙醇水溶液→超聲提取→制冷高速離心→稀釋→測量吸光度。

1.2.3 最大吸收波長測定

準確稱取0.50 g稠李果粉末樣品，置于圓底燒瓶中，加入pH值為1.5、體積分數為50%的乙醇水溶液25 mL，在40 ℃下超聲提取30 min。取上清液離心后取上清液稀釋，用紫外分光光度計在波長為350～750 nm下掃描，得到紫外可見吸收光譜圖。稠李果提取液在530 nm處有最大響應值。因此，本試驗在530 nm的波長下測定提取液，以分析不同提取條件對稠李果色素吸光度的影響。

1.2.4 標準曲線繪制

使用兒茶素標準品配制濃度為0.01、0.04、0.08、0.12 mg·mL-1和0.16 mg·mL-1的標準溶液。各取1 mL分別加入棕色試劑瓶中，加入2 mL質量分數為1%香草醛甲醇溶液，混合振蕩搖勻后，再加入2 mL濃鹽酸。避光放入30 ℃水浴中，5 min后使用紫外可見分光光度計測量530 nm波長處的吸光度，制作兒茶素標準品標準曲線y=0.027 76+9.478 59x；R2=0.999 7。

1.2.5 單因素試驗

稱取稠李果粉末0.50 g樣品24份（分成5組），分別置于150 mL圓底燒瓶中，調整超聲頻率為800 W。在基礎實驗條件下[溫度為50 ℃，乙醇體積分數為60%，提取時間為30 min，料液比為1∶10（g∶mL），pH值為1]，分別在不同溫度（30、40、50、60 ℃和70 ℃），不同乙醇體積分數（50%、60%、70%、80%和90%）、不同提取時間（10、20、30、40 min和50 min）、不同料液比（1∶5、1∶10、1∶30、1∶70和1∶90，g∶mL）和不同pH值（1、3、5和7）下對稠李果中色素進行提取[5]。提取結束后，取上清液在10 000 r·min-1下，制冷高速離心10 min，取上清液5 mL，稀釋10倍，分別測量在530 nm波長下的吸光度[6]。

1.2.6 響應面分析法優化試驗條件

根據單因素試驗結果和Box-Behnken設計原理，以提取時間、料液比、提取溫度和提取劑濃度為自變量，吸光度為因變量，設計4因素3水平的響應面法分析試驗，預測稠李果色素提取條件的最佳工藝。響應面因素水平見表1。

1.2.7 稠李果色素定量分析

準確稱取2.000 0 g稠李果粉末置于100 mL圓底燒瓶中，加入pH值為1的50%乙醇水溶液18 mL，超聲提取30 min，取上清液在10 000 r·min-1下，制冷高速離心10 min得提取液原液。取上清液5 mL稀釋10倍，使用紫外分光光度計測量530 nm波長下的吸光度A[7]。色素含量計算公式為

式中：P為稠李果色素提取液原液中色素含量，mg·mL-1；A為稠李果色素提取液稀釋液吸光度值；N為提取液原液稀釋倍數；W為稠李果色素粉末中色素含量，mg·g-1；V為提取液原液體積，mL；M為稠李果粉末質量，g。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 提取溫度對稠李果色素提取的影響

由圖1可知，吸光度隨著提取溫度的升高呈現先增后降的趨勢。當提取溫度為50 ℃時吸光度最高。由于色素分子運動在低溫時緩慢，提取率不高；而當溫度過高時，稠李果色素結構穩定性受到破壞，同時過高的溫度也會使乙醇揮發，導致吸光度下降[5]。

2.1.2 乙醇體積分數對稠李果色素提取的影響

由圖2可知，在乙醇體積分數低于60%時，隨著乙醇體積分數的增加，溶液的吸光度也會增加。當乙醇體積分數為60%時，溶液的吸光度達到最大值，之后呈現下降趨勢，最終趨于平穩，所以最佳提取劑濃度為60%。稠李果色素提取液的吸光度受乙醇體積分數影響。乙醇體積分數較低時，乙醇的溶解力較小，吸光度下降；而當乙醇體積分數較高時，脂溶性物質的溶解度增大，使色素提取液的沸點降低，難以保持液體的穩定性，影響提取量和吸光度的結果[8]。

2.1.3 提取時間對稠李果色素提取的影響

由圖3可知，吸光度隨著提取時間的延長呈現先增加后降低的趨勢，當提取時間為30 min，吸光度最高。超聲波空氣化效應和機械粉碎作用，可以增強物質分子的運動頻率和速度。在稠李果色素提取過程中，超聲波能提高溶劑的穿透力，從而促進色素的快速釋放。但是超聲時間過長會導致色素降解和提取量的降低，最終吸光度也會下降[9]。

2.1.4 料液比對稠李果色素提取的影響

由圖4可知，當料液比為1∶10時，吸光度最大。料液比對色素提取有很大影響，如果提取物占比太高，部分提取物不能被提取劑浸潤使得提取效果下降；如果提取物質占比太低，提取劑會吸收超聲波的熱量和能量，從而降低提取率，導致吸光度改變[10]。

2.1.5 提取液pH值對稠李果色素提取的影響

由圖5可知，不同的酸堿對色素的穩定性有較大影響，酸度越高色素越穩定或者堿度越高色素越穩定，又或者在固定的酸堿下色素最穩定[11-12]。提取液的酸堿度不同，導致色素提取量有所變化，進而影響吸光度[13]。本實驗中pH值越低，色素越穩定，在pH值為1時，色素已經達到理想的穩定程度，為了便于pH值調試，本研究將pH值的最佳水平設定為1。

2.2 響應面法設計與結果分析

2.2.1 回歸方程的建立與分析

由表2可知，利用Design Expert 8.0.6軟件，采用Box-Behnken模型建立二次響應面法回歸方程，以提取溫度（A）、乙醇體積分數（B）、提取時間（C）和料液比（D）為響應因素，以吸光度（Y1）為響應值，得到回歸模型Y1=0.615 0+0.010 8A+0.016 0B+0.004 9C+0.011 4D-0.008 2AB-0.000 15AC-0.007 3AD-0.020 8BC-0.010 5BD+0.008 5CD-0.046 6A2-0.049 9B2-0.053 5C2-0.030 3D2。

由表3可知，模型的F值為58.32，因噪聲而影響改變的概率P小于0.000 1。P＜0.05，說明該模型顯著。失擬項F值為0.081，說明失擬情況相對于純誤差不顯著，噪聲能改變失擬項F值的概率為99.93%，也可以看出模型是合理的。模型的預測極差平方值R2=0.983 1，調整極差平方值R2adj=0.966 3，二者差小于0.2，屬于合理范圍。信噪比27.040，大于4，表明模型非常顯著。

回歸模型一次項A、B、D對色素提取率影響極顯著，C對色素提取率影響顯著；交互項BC、CD影響極顯著，交互項AB、BD影響顯著，其他項不顯著；二次項均達到極顯著水平，說明各因素對響應值的影響較為復雜，并非簡單的線性關系。響應曲面圖可以描述各因素間的相互作用，見圖6、圖7。

在回歸模型中，一次項系數的絕對值B＞D＞A＞C，說明試驗中影響提取率的各因素排序是乙醇體積分數＞料液比＞提取溫度＞超聲時間。

2.2.2 響應面分析并優化色素提取條件

通過Box-Behnken響應面分析，優化出稠李果色素提取的最佳條件，并結合實際情況調整提取溫度50 ℃、乙醇體積分數60%、提取時間30 min、料液比1∶10。按照上述提取條件進行驗證實驗，平行測定3次，測得平均吸光度為0.615，與模擬值0.613近似，說明響應面優化稠李果色素提取條件效果很好。在此條件下，計算稠李果粉末中色素含量為5.54 mg·g-1。

3 結論

本文采用超聲輔助醇提取法對稠李果果實中色素進行提取，根據單因素優化結果設計響應面試驗。響應面法優化后稠李果中色素提取的最佳條件為提取溫度50 ℃、乙醇體積分數60%、料液比1∶10（g∶mL），提取時間30 min。在此條件下，稠李果提取液中色素吸光度為0.615，折合稠李果色素含量為5.54 mg·g-1。

參考文獻

[1]張琦忻，呂丹，于佳慧.天然植物色素的提取、分離及純化方法研究進展[J].廣州化工，2022，50（24）：15-17.

[2]劉偉，劉軍海，何敏.超聲波輔助提取紫甘藍色素及穩定性研究[J].中國調味品，2022，47（8）：182-186.

[3]王婷婷，王鑫蒙，李金平，等.基于響應面法對衛紅花中紅花黃色素提取條件的優化[J].廣州化工，2022，50（12）：81-84.

[4]李曉嬌，劉超，何春燕，等.粗梗稠李中花色苷的提取及抗氧化和抑菌活性研究[J].北方園藝，2021（23）：89-97.

[5]徐銘，李立國，李秀花.響應面法對山竹殼中色素提取條件的優化[J].糧食與油脂，2021，34（7）：139-142.

[6]黃浩，翁霞.超聲波輔助酶法提取玉米黃色素的工藝研究[J].鞍山師范學院學報，2021，23（4）：49-52.

[7]肖遠淑，賈麗霞，單國華，等.薰衣草色素的提取及穩定性研究[J].印染助劑，2021，38（7）：41-43.

[8]邢澤農，蘇娟，東莎莎，等.辣椒紅色素的提取與應用[J].中國果菜，2021，41（3）：26-29.

[9]倪開嶺，李紅，馮一彤，等.山桃稠李果實花色苷的提取及抗氧化研究[J].中國林副特產，2020（2）：5-7.

[10]段曉嫣，田艷，鄧放明.火龍果色素生物活性及其提取純化研究進展[J].食品與機械，2017，33（10）：214-219.

[11]周業豐，陳小李，喬世玉，等.大孔樹脂法純化紅棗色素工藝研究[J].湖北農業科學，2017，56（10）：1924-1927.

[12]婁濤濤，金玲，陀揚凌，等.BBD-響應面法優化黑果枸杞色素的滲漉法提取工藝及其純化工藝研究[J].食品科技，2017，42（3）：244-250.

[13]劉世軍，張媚，唐志書，等.大棗紅色素的提取與純化研究[J].中國食品添加劑，2016（9）：146-150.

基金項目：吉林省大學生創新創業訓練計劃項目（SJ2022056）。

作者簡介：劉宏宙（2000—），男，內蒙古豐鎮人，本科在讀。研究方向：化學。

通信作者：李秀花（1980—），女，朝鮮族，吉林延吉人，博士，講師。研究方向：天然產物提取。E-mail： 386914716@qq.com。