克氏原螯蝦殼中蝦青素提取工藝優化

摘 要：蝦青素是一種類胡蘿卜素，有強大的天然抗氧化能力，主要存在于蝦、蟹、鮭魚、藻類等水產生物中。本文采用離子液體微乳液從克氏原螯蝦殼中提取蝦青素，比較了不同離子液體的提取情況，選取辛基三丁基溴化磷進行后續實驗。分別研究了固液比、離子液體微乳液成分比例、超聲功率和超聲時間對蝦青素提取率的影響，并在單因素基礎之上進行正交實驗，結果顯示最優工藝條件為固液比1∶30，離子液體微乳液成分比0.20∶0.12∶0.48∶0.20，超聲功率150 W，超聲時間25 min，此時蝦青素提取率為581.52 μg·g-1。

關鍵詞：蝦青素；離子液體；克氏原螯蝦

Abstract： Astaxanthin is a carotenoid with powerful natural antioxidant capacity， which is mainly found in aquatic organisms such as shrimp， crab， salmon and algae. In this paper， astaxanthin was extracted from Procambarus clarkii shells， by using ionic liquid microemulsion， and the extraction of different ionic liquids was compared， and octyltributylphosphonium bromide was selected for the subsequent experiments. The effects of solid-liquid ratio， ionic liquid microemulsion composition ratio， ultrasonic power and ultrasonic time on the extraction rate of astaxanthin were investigated separately， and orthogonal experiments were carried out on the basis of a single factor， and the results showed that the optimal process conditions were solid-liquid ratio of 1∶30， ionic liquid microemulsion composition ratio of 0.20∶0.12∶0.48∶0.20， ultrasonic power of 150 W， ultrasonic time of 25 min， the astaxanthin extraction rate was 581.52 μg·g-1 under this condition.

克氏原螯蝦俗稱小龍蝦，富含蝦青素、甲殼素、蛋白質、脂類、氨基酸等營養物質。據最新《中國小龍蝦產業發展報告（2024）》，我國小龍蝦年產量達到316.10萬t。伴隨其龐大的銷量，每年產生大量的蝦殼、蝦頭等加工副產物，約占小龍蝦質量的33%，不但造成生物資源浪費嚴重，而且會對環境造成污染。蝦青素是一種酮類脂溶性胡蘿卜素，其生物活性遠遠優于其他抗氧化劑。蝦青素相關產品市值不斷攀升，2025年預計達10億元，目前95%的蝦青素產品是人工合成來源。蝦青素合成路線較復雜，抗氧化活性低，且合成過程對環境有較大影響[1-2]。同時，消費者日益增長的食品安全意識以及越來越嚴格的政府監管，使得天然來源的蝦青素成為廣泛關注的焦點。從小龍蝦中提取蝦青素可有效應對天然蝦青素市場的需求。

蝦青素的提取方法目前主要包括堿液法、油溶法、有機溶劑提取法、超臨界流體萃取法。但堿液法pH值大，油溶法溫度高，都易引起蝦青素降解，提取率很低[3]。超臨界CO2流體萃取設備昂貴、技術要求高，用于工業化生產尚存在很大困難[2]。較多團隊研究使用傳統有機溶劑提取[4]，但有機溶劑通常具有揮發性和毒性，因此目前較多研究人員在探索更加安全高效的提取技術。

離子液體（Ionic Liquids，ILs）由陰、陽離子組成，與傳統有機溶劑相比，具有低蒸氣壓、不可燃性、高熱穩定性和可再生性，在食品工業中，可作為有機溶劑的潛在代替物。但離子液體分子黏度大，不利于傳質，在生物分子萃取領域受到限制，更多適合以助劑形式來使用[5]。微乳液是由兩種互不相溶的液體在表面活性劑的作用下形成的熱力學穩定體系，具有高穩定性、低黏度，以及對親水和親脂化學物的增溶能力。將離子液體引入微乳液，能兼顧各自優點，擴展離子液體和微乳液的應用范圍。

本項目在前期研究的基礎上，用基于磷的離子液體微乳液從克氏原螯蝦蝦殼中提取蝦青素，充分利用水產品副產物資源制備蝦青素，補充天然蝦青素產品市場的不足。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

克氏原螯蝦，購自浙江臺州椒江大潤發超市；蝦青素標準品，1，2-丁二醇、酒石酸、氯化膽堿、正丁醇、卵磷脂均為分析純，購自上海市阿拉丁生化科技有限公司；辛基三丁基溴化磷、四丁基磷三氟乙酸鹽、辛基三丁基磷四氟硼酸鹽、辛基三丁基磷三氟乙酸鹽均為分析純，購自青島奧立新科材料科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

UV Cary100紫外分光光度計，美國瓦里安公司；KQ-250DE數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DGG-9140B電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；GM300刀式研磨儀，德國RETSCH（萊馳）公司；BSA2202S電子分析天平，德國賽多利斯天平有限公司；Sorvall ST 16通用臺式高速離心機，美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

制備得到0.002、0.004、0.006、0.008 mg·mL-1 和0.010 mg·mL-1的標準溶液，在最大吸收波長（472 nm）下，分別測量各個溶液的吸光度，繪制標準曲線。1.2.2 克氏原螯蝦中蝦青素的提取

（1）克氏原螯蝦處理。去肉后，蝦殼清洗干凈，置于恒溫鼓風干燥箱中55 ℃干燥5 h，研磨過100目篩得蝦殼粉，于-18 ℃冷凍儲存備用。

（2）離子液體微乳液制備。離子液體∶卵磷脂∶正丁醇∶H2O按一定質量混合，超聲5 min以使離子液體混合均勻。

（3）提取克氏原螯蝦中蝦青素。稱取蝦殼粉2 g于離心管中，按一定固液比加入離子液體微乳液，超聲波輔助提取結束后室溫下12 000 r·min-1離心20 min，上層液體傾倒出，采用紫外可見分光光度法測蝦青素含量，并計算蝦青素提取率。

1.2.3 蝦青素提取率的計算方法

蝦青素提取率的計算公式如下。

式中：W為蝦青素提取率，μg·g-1；x為蝦青素的質量濃度，μg·mL-1；V為蝦青素粗提液體積，mL；N為稀釋倍數；M為蝦殼干重，g。

1.3 離子液體微乳液提取蝦青素的工藝優化

1.3.1 單因素實驗

（1）不同離子液體構成的微乳液對蝦青素提取率的影響。固定離子液體∶卵磷脂∶正丁醇∶水質量比=0.20∶0.12∶0.48∶0.20，離子液體微乳液與蝦殼粉的固液比為1∶20（g∶mL），超聲功率100 W，超聲時間30 min。離子液體分別為四丁基磷三氟乙酸鹽、辛基三丁基磷四氟硼酸鹽、辛基三丁基溴化磷、辛基三丁基磷三氟乙酸鹽，提取后檢測蝦青素提取率。

（2）固液比對蝦青素提取率的影響。固定離子液體為辛基三丁基溴化磷，離子液體∶卵磷脂∶正丁醇∶水質量比=0.20∶0.12∶0.48∶0.20，超聲功率100 W，超聲時間30 min。微乳液與蝦殼粉的固液比分別為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80和1∶90（g∶mL），提取后檢測蝦青素提取率。

（3）離子液體微乳液成分比例對蝦青素提取率的影響。固定離子液體為辛基三丁基溴化磷，固液比為1∶30（g∶mL），超聲功率100 W，超聲時間30 min。離子液體∶卵磷脂∶正丁醇∶水質量比分別為0.10∶0.12∶0.48∶0.30、0.15∶0.12∶0.48∶0.25、0.20∶0.12∶0.48∶0.20、0.25∶0.12∶0.48∶0.15、0.30∶0.12∶0.48∶0.10、0.35∶0.12∶0.48∶0.05，提取后檢測蝦青素提取率。

（4）超聲功率對蝦青素提取率的影響。固定離子液體為辛基三丁基溴化磷，固液比為1∶30（g∶mL），離子液體∶卵磷脂∶正丁醇∶水質量比為0.20∶0.12∶0.48∶0.20，超聲時間30 min。超聲功率分別為50、100、150、200、250 W，提取后檢測蝦青素提取率。

（5）超聲時間對蝦青素提取率的影響。固定離子液體為辛基三丁基溴化磷，固液比為1∶30（g∶mL），離子液體∶卵磷脂∶正丁醇∶水質量比為0.20∶0.12∶0.48∶0.20，超聲功率為150 W。超聲時間分別為5、10、15、20、25、30 min和40 min，提取后檢測蝦青素提取率。

1.3.2 正交優化實驗

在單因素實驗基礎上，選取固液比、離子液體微乳液成分比例、超聲功率、超聲時間作為正交實驗的因素，每個因素選取3個水平進行正交實驗，優化工藝條件。因素水平表見表1。

2 結果與分析

2.1 不同離子液體微乳液對蝦青素提取率的影響

本實驗選擇純水，同時添加天然表面活性劑卵磷脂和助表面活性劑正丁醇降低了離子液體、水和蝦青素之間的界面張力，大大提高蝦青素在整個離子液體中的溶解度。為了確定最佳的ILs微乳液，對不同陽離子和陰離子構成的ILs微乳液提取情況進行了比較。實驗發現，蝦青素提取率從大到小依次是辛基三丁基溴化磷（[P4448]Br）＞三氟乙酸三丁基辛基膦（[P4448]CF3COO）＞四丁基三氟乙酸膦（[P4444]CF3COO）＞辛基三丁基磷四氟硼酸鹽（[P4448]BF4），具體見圖1。除了[P4448]BF4/（卵磷脂+正丁醇）/水微乳液，其他離子液體微乳液均有較強的蝦青素提取能力，這主要是因為他們有更高的蝦青素溶解度，這樣也與實驗中觀察到的黏度一致，其中[P4448]Br/（卵磷脂+正丁醇）/水微乳液黏度最小，有最高的蝦青素提取率。

2.2 固液比對蝦青素提取率的影響

溶劑與目標分子之間的靜電和親水/疏水相互作用是影響溶劑能力的主要因素，增加離子液體微乳液用量可以加強這種相互作用。從圖2可以觀察到當固液比從1∶5到1∶30時，蝦青素的提取率從350.14 μg·g-1增加到541.64 μg·g-1，說明在一定范圍內增加離子液體微乳液用量，蝦青素的溶解度顯著增加。繼續改變固液比，蝦青素提取率變化不大，甚至有降低的趨勢。

2.3 離子液體微乳液成分比例對蝦青素提取率的影響

離子液體微乳液成分比不同，對蝦青素的溶解度不同。從圖3中能夠看出，離子液體[P4448]Br占比從10%增加到20%時，蝦青素的提取率從513.28 μg·g-1增加到541.64 μg·g-1，說明[P4448]Br的適當增加能夠加強與蝦青素之間的氫鍵、偶極-偶極、π-π和范德華相互作用。但是當繼續增加[P4448]Br在離子液體微乳液中的占比，蝦青素提取率下降，這可能主要是因為[P4448]Br的用量過多，導致整個提取溶液的黏度變大，影響了傳質效率。

2.4 超聲功率對蝦青素提取率的影響

從圖4可以看出，在50～150 W，蝦青素提取率與超聲功率保持正相關，從509.17 μg·g-1增至561.08 μg·g-1。但是當超聲功率大于150 W后，蝦青素提取率快速下降。這可能主要是蝦青素不穩定，超聲功率過大，對其有破壞作用，且超聲功率大，溶液的溫度也會升高很多，也不利于蝦青素的穩定。

2.5 超聲時間對蝦青素提取率的影響

由圖5可知，在25 min之前，蝦青素提取率與時間正相關，從5 min的420.74 μg·g-1逐漸增加至25 min的573.47 μg·g-1。超聲時間短，不足以讓蝦青素從蝦殼基質中充分分離出來，但是時間過長，蝦青素容易在氧氣和較高溫度下氧化降解，降低提取率，當時間延長至40 min，蝦青素的提取率降低到528.03 μg·g-1。結果顯示，蝦青素在25 min左右可以實現最大量的提取。

2.6 蝦青素提取工藝優化

在各單因素研究結果基礎上，選取固液比、離子液體微乳液成分、超聲功率和超聲時間4因素各3水平進行正交實驗。以蝦青素提取率為指標，正交實驗結果見表2。

根據表2，可以看出4個因素對蝦青素提取率影響的順序依次是超聲功率、超聲時間、固液比、離子液體微乳液成分比。極差分析結果顯示，以蝦青素提取率為指標，最佳制備工藝條件為A1B2C2D2，即固液比1∶30，離子液體微乳液成分比0.20∶0.12∶0.48∶0.20，超聲功率150 W，超聲時間25 min。該方案在正交方案中，蝦青素提取率最高為581.52 μg·g-1。

3 結論

本實驗采用離子液體微乳液提取克氏原螯蝦殼中的蝦青素，首先對比了4種不同的離子液體各自組成的微乳液，選定了最優的辛基三丁基溴化磷（[P4448]Br）。然后進行單因素實驗，并在此基礎上開展了正交優化實驗，確定了最優工藝條件：固液比1∶30，離子液體微乳液成分比0.20∶0.12∶0.48∶0.20，超聲功率150 W，超聲時間25 min，此時，蝦青素提取率為581.52 μg·g-1。本研究以克氏原螯蝦加工副產物為原料進行蝦青素提取，有助于克氏原螯蝦產業中蝦殼的大規?；厥蘸屠?，同時一定程度上滿足天然蝦青素產品的市場需求。

參考文獻

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[2]韓露，項丹丹，謝丹，等.甲殼類水產及其加工副產物中蝦青素提取方法研究進展[J].食品與機械，2024，40（8）：197-204.

[3]杜云建，陳卿.稀堿法提取蝦殼中蝦青素的工藝條件研究[J].食品與機械，2010，26（4）：112-114.

[4]RAJU N，BENJAKUL S.Process development of cholesterol removed Pacific white shrimp lipid enriched with astaxanthin using silica column[J].Process Biochemistry，2022，115：1-9.

[5]CHOI S A，OH Y K，Lee J，et al.High -effi-ciency cell disruption and astaxanthin recovery from Haematococcus pluvialis cyst cells using room -temperature imidazolium based ionic liquid/water mixtures[J].Bioresource Technology，2019，274：120-126.

基金項目：2023年浙江省大學生科技創新項目（2023R476002）；浙江省一般科研項目（Y202352565）；浙江省訪工研究項目（FG2023322）；臺州市第一批農業科技計劃項目（23nya08）。

作者簡介：徐文（2003—），男，山東棗莊人，大專在讀。研究方向：食品檢驗檢測技術。

通信作者：韓露（1987—），女，江蘇揚州人，碩士，講師。研究方向：天然產物。E-mail： 393591046@qq.com。