苦杏仁粕抑制產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌的作用機(jī)制

摘 要：產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌（ETEC）是導(dǎo)致人畜腹瀉的主要病原菌.本文以苦杏仁粕為原料，將其1%的提取液與ETEC H10407共同培養(yǎng)，研究苦杏仁粕對(duì)ETEC生長(zhǎng)、形態(tài)等的影響，并利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，探究苦杏仁粕提取液對(duì)ETEC中基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用.結(jié)果表明：1%的苦杏仁粕提取液可以顯著抑制ETEC的生長(zhǎng)，破壞菌體細(xì)胞形態(tài)，減少了脂肪酸合成、蛋白質(zhì)翻譯通路相關(guān)基因的表達(dá)，增加了細(xì)菌趨化性信號(hào)通路相關(guān)基因cheB、cheR，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑中鐵元素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因fecB、fecC、fecD等的表達(dá).苦杏仁粕可能引發(fā)了ETEC的代謝紊亂，從而抑制了其生長(zhǎng).研究結(jié)果將為開(kāi)發(fā)利用苦杏仁，用于ETEC的防治提供參考.

關(guān)鍵詞：苦杏仁粕； 產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌； 抑菌； 差異基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q93； TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

Mechanism of the inhibitory effect of bitter almond meal on

Enterohaemorrhagic Escherichia coli

ZHU Ya-nan， WU Wen-ting， Wang Xin-yi， ZHANG Lu， QIU Xue-hui，

WANG Hu-xuan，

YI Jian-hua*

（School of Food Science and Engineering， Shaanxi University of Science amp; Technology， Xi′an 710021， China）

Abstract：In human and farm animals，Enterohaemorrhagic Escherichia coli（ETEC） is the main pathogen causing diarrhea.In this study，bitter almond meal at 1% was co-cultivated with ETEC，to study the effect of bitter almond meal on ETEC in term of bacterial growth and morphology.Transcriptome sequencing technology was also used to explore the effect of bitter almond meal on the transcriptional expressions of genes in ETEC.This research found that 1% bitter almond meal could significantly inhibit the growth of ETEC，destroy bacterial cell morphology，inhibit the expressions of genes related to fatty acid synthesis and protein translation pathways，and promote expressions of genes related to bacterial chemotaxis signaling pathway such as cheB and cheR，and iron ion transport system in the ABC transport protein pathway such as fecB、fecC and fecD.Bitter almond meal probably caused metabolic disorders in ETEC，thereby inhibiting its growth.Results of this study will provide reference for the development and utilization of bitter almond meal to prevent and treat ETEC.

Key words：bitter almond meal；Enterohaemorrhagic Escherichia coli； antibacterial effect； differential gene expression

0 引言

苦杏仁是薔薇科山杏（Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.）、東北杏（Prunus mandshurica（Maxim.） Koehne）等的成熟種子，廣泛分布于我國(guó)的北方地區(qū)^[1，2].苦杏仁富含功能性成分，含有大量的脂肪酸酸類，且以油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸為主；苦杏仁苷、野黑櫻桃苷等苷類成分，水仙苷、異鼠李素等黃酮類物質(zhì)，黃烷醇、黃酮醇等酚類化合物，還含有豐富的氨基酸、維生素和礦物質(zhì)^[2].

苦杏仁是常見(jiàn)的傳統(tǒng)藥食同源中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》最早記載描述了苦杏仁的功效和用途^[2，3].中醫(yī)認(rèn)為苦杏仁具有平喘、止咳等功效，可用來(lái)治療咳嗽、痰多等^[1-3].此外，已有研究表明苦杏仁或其有效成分具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤以及預(yù)防心血管疾病等作用^[4-7].

研究表明苦杏仁中的有效成分還具有良好的抑菌作用.在Yigit等^[8]的研究中，苦杏仁的酒精提取物和水提取物均能抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等病原菌的生長(zhǎng).張濤等^[9]最新的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：苦杏仁經(jīng)過(guò)中性蛋白酶處理后，酶解多肽具有抑制大腸桿菌的作用.杏仁皮類黃酮提取物也可以顯著抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌^[10].柴玉霞^[11]提取了苦杏仁中的苦杏仁苷，抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示苦杏仁苷對(duì)于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有抑菌作用.

上述研究說(shuō)明苦杏仁中含有多種抗菌成分，它們的抑菌機(jī)制有待闡明.苦杏仁提油后，副產(chǎn)物苦杏仁粕富含蛋白質(zhì)、苦杏仁苷等物質(zhì)，大量的苦杏仁粕尚未被開(kāi)發(fā)利用^[12，13].本文以苦杏仁粕為研究對(duì)象，研究苦杏仁粕對(duì)ETEC的生長(zhǎng)、形態(tài)等的影響，并利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq），探究苦杏仁粕對(duì)于ETEC中基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用，以期為綜合開(kāi)發(fā)利用苦杏仁用于大腸桿菌的防治提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 菌株及原材料

ETEC H10407菌株，購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心.實(shí)驗(yàn)所用苦杏仁，購(gòu)自承德市承德縣.

1.1.2 培養(yǎng)基和PBS溶液

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L，調(diào)整pH 至7.0.

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂粉15 g/L.

PBS溶液：磷酸氫二鉀0.24 g/L、磷酸氫二鈉1.44 g/L、氯化鈉8 g/L、氯化鉀0.2 g/L.

1.1.3 主要試劑及材料

磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉，德國(guó)Merck；氯化鈉、氯化鉀，德國(guó)SIGMA；胰蛋白胨、酵母提取物，英國(guó)OXOID；瓊脂粉、噻唑藍(lán)溴化四唑（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT），北京博奧拓達(dá)科技有限公司；無(wú)水乙醇，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；乙酸異戊酯，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；MillexD○R-GP過(guò)濾器（無(wú)菌），德國(guó)Merck；2.5%戊二醛溶液，陜西普羅安蒂生物科技發(fā)展有限公司.

1.1.4 主要儀器

KNIRPS升級(jí)精研磨機(jī)（SD-YM1503），中山市昌昊智能科技有限公司；奧斯達(dá)C57榨油機(jī)，中山市超巨浪科技有限公司；旋渦混勻儀（Vortex-2），上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；超低溫冷凍儲(chǔ)存箱（DW-HL340），中科美菱低溫科技股份有限公司；真空冷凍干燥機(jī)（LGJ-12A），北京四環(huán)起航科技有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（HR/T16M），湖南赫西儀器裝備有限公司；電熱式壓力蒸汽滅菌鍋（XFH-50CA），浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；智能恒溫震蕩器（HNY-100B），天津歐諾儀器股份有限公司；臺(tái)式低速離心機(jī)（TDZ5-WS），湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；INFINITE 200 PRO酶標(biāo)儀，瑞士TECAN.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苦杏仁粕的制備

利用榨油機(jī)對(duì)苦杏仁進(jìn)行壓榨提油，獲得苦杏仁粕，并將苦杏仁粕研磨粉碎， -20℃密封保存.

1.2.2 苦杏仁粕粉提取液的制備

將1 g苦杏仁粕粉溶于10 mL PBS中，循環(huán)三次震蕩、超聲（100 Hz，2 min）， 1 500 r/min離心5 min，將上清液過(guò)濾除菌，得到苦杏仁粕的PBS提取液，并將其稀釋到1%，以Alm表示.

1.2.3 ETEC H10407的培養(yǎng)

挑取ETEC H10407菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，即37 ℃、 100 rpm 搖床恒溫培養(yǎng)16 h.

1.2.4 Alm對(duì)于ETEC H10407生長(zhǎng)曲線的影響

將ETEC菌液2 500 r/min離心5 min，移去上清液，添加PBS懸浮細(xì)菌沉淀，并在650 nm波長(zhǎng)處， 將懸浮液的吸光度值（Optical Density， OD值）調(diào)至為1，梯度稀釋1 000倍，與Alm樣品按照1∶1混合均勻，添加到96孔板中，每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)，PBS作為對(duì)照組，在37 ℃、650 nm條件下，每間隔10分鐘， 連續(xù)測(cè)量OD值12 h.實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次.以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制ETEC H10407的生長(zhǎng)曲線.

1.2.5 Alm與ETEC H10407共孵育8 h后的菌落數(shù)

依照上述方法，將稀釋菌液與Alm樣品37 ℃恒溫孵育8 h，先稀釋1倍，再進(jìn)行梯度稀釋，并進(jìn)行涂布實(shí)驗(yàn)，每個(gè)涂布梯度三個(gè)重復(fù)，對(duì)照組為PBS， 37 ℃培養(yǎng)8 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù).實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次.最后繪制Alm與PBS每毫升所含有的菌落數(shù)（log（CFU/mL））的柱狀圖.

1.2.6 MTT檢測(cè)

依照上述方法，將稀釋菌液與Alm樣品混合均勻，37 ℃恒溫孵育，每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)，PBS為陰性對(duì)照組.4 h、8 h后，將孵育液移入96孔板中，添加10 μL MTT染液，37 ℃孵育15 min，在490 nm測(cè)量OD值.實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次.

1.2.7 Alm對(duì)ETEC表觀形態(tài)的影響

參考Ambrosio等^[14]方法，并做適當(dāng)修改，利用掃描電鏡（SEM）觀察ETEC H10407表觀形態(tài)的變化.將Alm與稀釋菌液1∶1混合混勻，PBS為對(duì)照組，37 ℃、100 rpm 搖床恒溫培養(yǎng) 4 h、8 h后， 4 000 r/min離心10 min， PBS懸浮沉淀兩次， 2.5%戊二醛溶液4 ℃固定過(guò)夜，分別以30%、50%、70%、90%、100%的乙醇以及乙酸異戊酯對(duì)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)脫水，冷凍干燥后，將細(xì)菌鋪在粘有導(dǎo)電膠的掃描電鏡載物臺(tái)上，并在真空環(huán)境濺射鍍金，最后用SEM在10.00 kv條件下進(jìn)行表觀形態(tài)觀察.

1.2.8 基因轉(zhuǎn)錄的表達(dá)變化檢測(cè)

將Alm樣品與稀釋菌液依照1∶1混合混勻，以PBS為對(duì)照組，37 ℃、100 rpm 搖床恒溫培養(yǎng)8 h后，將培養(yǎng)菌液4 ℃、10 000 g離心20 min，移除上清后，PBS懸浮沉淀， 4 ℃、 10 000 g離心10 min，獲得菌體沉淀.實(shí)驗(yàn)設(shè)置四個(gè)獨(dú)立樣本.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，并完成測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控、表達(dá)量分析、表達(dá)量差異分析、基因集分析.

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 27對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用“*”表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間有顯著差異，*：P lt; 0.05；**：P lt; 0.01；***：P lt; 0.001.使用Origin 2024軟件繪圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 Alm對(duì)ETEC H10407生長(zhǎng)曲線的影響結(jié)果分析

ETEC H10407與Alm、PBS共同孵育的生長(zhǎng)曲線如圖1所示.從圖中可以看出，PBS組的ETEC H10407的生長(zhǎng)呈現(xiàn)“S”型，而Alm組的ETEC H10407的生長(zhǎng)較為緩慢，在共同孵育的中后期，兩組的OD值差值逐漸增大，表明Alm對(duì)ETEC H10407的生長(zhǎng)具有顯著的抑制性.

2.2 Alm與ETEC H10407共孵育8 h后的菌落量

從圖2所示的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果可知：在共同孵育8 h后，PBS組log（CFU/mL）值為9.21，Alm組log（CFU/mL）值為8.22，Alm顯著抑制了ETEC的生長(zhǎng)（P lt; 0.001）.

2.3 MTT測(cè)試

如圖3（a）所示，共同孵育4 h、8 h后，PBS組的顏色分別呈現(xiàn)棕色、紫黑色，Alm組的顏色分別呈現(xiàn)黃色、淺綠色.

OD值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在孵育4 h后，PBS組的OD值是0.48，Alm組的OD值是0.17（如圖3（b）所示）；孵育8 h后，PBS組的OD值是1.28，Alm組的OD值是0.41（如圖3（c）所示）；Alm組的OD值均顯著低于PBS組的OD值（Plt;0.01），實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明Alm具有顯著的抑菌效果.

2.4 Alm對(duì)ETEC H10407表觀形態(tài)的影響

ETEC與PBS共孵育4 h、8 h后，細(xì)菌形態(tài)完整，無(wú)破損、菌體呈棒桿狀 （圖4）.ETEC與Alm共孵育4 h后（如圖4（a）所示），菌體形態(tài)近乎完整，仍呈棒桿狀，但是外表出現(xiàn)了破損；與Alm共孵育8 h后（如圖4（b）所示），菌體出現(xiàn)了不規(guī)則破裂.

2.5 總體樣本主成分分析

樣本RNA結(jié)果質(zhì)量顯示（表1）：實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組的Clean Q20的百分比均在98%以上，Clean Q30的百分比均在96%以上，所得RNA質(zhì)量符合要求，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

主成分分析結(jié)果顯示（圖5），第一主成分（PC1）的貢獻(xiàn)率是61.14%，第二主成分（PC2）的貢獻(xiàn)率是10.13%，Alm組和Neg組（即PBS組）樣本分別集中在PC1軸方向的不同區(qū)域，兩組的基因表達(dá)主成分存在明顯的差異.

2.6 差異基因表達(dá)分析

在基因表達(dá)量差異分析中，將基因在兩組樣本間表達(dá)量差異的倍數(shù)變化值，即FC值，設(shè)置為＞2，P-Value＜0.05，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并繪制了基因表達(dá)量差異火山圖（圖6）.相對(duì)于PBS組（Neg），Alm組顯著上調(diào)的基因有446個(gè)，顯著下調(diào)的基因533個(gè).

2.7 差異表達(dá)基因的GO功能富集

對(duì)Alm、PBS兩組樣本的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集.差異表達(dá)基因主要集中生物過(guò)程（biological process）、分子功能（molecular function）以及細(xì)胞組分（cellular component）.與PBS組比較，在前20條GO途徑中，Alm組上調(diào)基因有19條顯著富集在生物過(guò)程，1條顯著富集在分子功能（如表2所示）.Alm組下調(diào)基因有12條顯著富集在生物過(guò)程，5條顯著富集在細(xì)胞組成，3條顯著富集在分子功能（如表3所示）.

2.8 差異基因的KEGG功能富集

Alm VS PBS上調(diào)基因有408個(gè)，KEGG途徑17條，主要包括ATP結(jié)合盒式（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鐵載體非核糖體肽的生物合成、半乳糖代謝、雙組分系統(tǒng)、氮素代謝作用等途徑（如圖7所示）. Alm VS PBS下調(diào)基因組中的差異基因有515個(gè)，KEGG途徑22條，主要包括核糖體，脂肪酸合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸代謝，嘌呤代謝（如圖8所示）.主要差異基因如表4所示.

在大腸桿菌的趨化性信號(hào)通路中，CheA、CheB、CheR、CheW、CheY、CheZ等六種細(xì)胞質(zhì)蛋白處理感覺(jué)信號(hào)，并將信號(hào)傳遞給鞭毛馬達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)菌的趨化運(yùn)動(dòng)^[15]. 其中，CheY控制鞭毛馬達(dá)方向的切換，CheB、 CheR控制化學(xué)受體的適應(yīng).在本研究中，Alm處理組的cheB、cheR基因表達(dá)的上調(diào)（如表4所示），是否引發(fā)了ETEC趨化性的調(diào)節(jié)或反應(yīng)，有待后續(xù)深入研究.

在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑中，fecB、fecC、fecD、fepD、fepG、fepC、fhuB、fhuC、fhuD等基因顯著上調(diào)（如表4所示），而Fec、Fep、Fhu等蛋白均參與了大腸桿菌的鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)^[16].檸檬酸介導(dǎo)的鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)， FecA為外膜蛋白，F(xiàn)ecB是周質(zhì)蛋白，F(xiàn)ecC和FecD是細(xì)胞質(zhì)膜蛋白，以及FecE是一種ATP結(jié)合蛋白，F(xiàn)ecA通過(guò)外膜運(yùn)輸檸檬酸鐵，F(xiàn)ecBCDE通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜運(yùn)輸鐵離子^[17]. 此外，F(xiàn)ecB還可以結(jié)合Al³⁺、Ga³⁺等三價(jià)金屬離子，以及低濃度的Mg^2+[18]. 在本研究中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，可能是Alm的抑制作用引起了細(xì)菌金屬元素代謝的紊亂.前人的研究發(fā)現(xiàn)柿子單寧抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)時(shí)，也同樣增加了鐵元素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)^[19].

Alm 處理組下調(diào)的主要基因fabA、fabB、fabD、fabF、rpsB、rpsG、rpsJ、rpsQ、rpmF、rpmJ等（如表4所示）.大腸桿菌中的II型脂肪酸合成酶（FAS），由FAB簇組成，含有FabA、FabB、FabD、FabF等蛋白，負(fù)責(zé)從頭合成脂肪酸，丙二酰ACP隨后對(duì)脂肪酸進(jìn)行延伸^[20].脂肪酸可為大腸桿菌提供碳源、能源^[21].FabA、FabB等還參與大腸桿菌不飽和脂肪酸的生物合成，細(xì)菌膜雙層磷脂中飽和、不和脂肪酸的相對(duì)水平調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性^[22，23].在本研究中，fabA、fabB、fabD等脂肪酸合成基因顯著下調(diào)，提示脂肪酸的合成可能受到了抑制. 在蛋白質(zhì)的合成中，核糖體是其翻譯的主要場(chǎng)所^[24].rpsB、rpsG、rpsJ、rpsQ等30S核糖體蛋白基因和rpmF、rpmJ等50S核糖體蛋白基因表達(dá)的下調(diào)，表明與Alm共孵育后，ETEC核糖體的翻譯能力削弱，蛋白質(zhì)的合成受到阻礙，從而影響了細(xì)菌的生長(zhǎng)與繁殖.

3 結(jié)論

本文探究了苦杏仁粕抑制ETEC生長(zhǎng)的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)1%的苦杏仁粕提取液能顯著抑制ETEC的生長(zhǎng)，破壞菌體細(xì)胞形態(tài)， 減少了脂肪酸合成、蛋白質(zhì)翻譯通路相關(guān)基因的表達(dá)，增加了細(xì)菌趨化性信號(hào)通路相關(guān)基因、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑中鐵元素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá).苦杏仁粕可能引發(fā)了ETEC的代謝紊亂，從而抑制了其生長(zhǎng).研究結(jié)果可以為綜合開(kāi)發(fā)利用苦杏仁，用于大腸桿菌的防治提供理論參考和依據(jù).

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【責(zé)任編輯：陳 佳】