微陣列技術探究限域面積對成牙本質細胞極化和分化的影響

[摘要] 目的 利用光刻技術制備圖案化的細胞差異黏附表面，探討黏附面積對成牙本質細胞極化與成牙向分化的影響。方法 利用光刻技術和聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA） 水凝膠制備了具有差異黏附特性的圖案化微陣列，通過對細胞產生限域作用，促使人牙髓干細胞（hDPSCs） 呈現天然成牙本質細胞樣形態。篩選孤立培養的單個hDPSCs，探究不同面積（1 800、2 700、3 600 μm2） 對成牙本質細胞極化和分化的影響。通過免疫熒光染色觀察細胞形態，明確高爾基體和細胞核在hDPSCs 中的定位及取向，分析不同面積對細胞極化的作用。通過堿性磷酸酶染色檢測hDPSCs 成牙向分化率和平均光密度值，探究不同面積對細胞分化的作用。結果 成功分離了hDPSCs 并對其鑒定，制備了仿成牙本質細胞形態的圖案化微陣列，通過鬼筆環肽染色證實了細胞形狀與微圖案形狀高度相符。免疫熒光染色結果顯示限域面積為3 600 μm2時，孤立hDPSCs 中各項極化和分化水平均明顯高于1 800 μm2和2 700 μm2限域面積的孤立hDPSCs （Plt;0.05）。結論 本實驗通過微陣列技術證實了限域面積參與調控成牙本質細胞極化和分化進程，隨著限域面積增大，孤立hDPSCs 極化和分化水平升高。

[關鍵詞] 細胞極化； 圖案化； 成牙本質細胞； 細胞分化

[中圖分類號] R781.1 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2025.2024392

目前齲病治療后存在材料降解、粘接強度降低等不良情況，因而失敗率仍較高[1]。同時，通過組織工程技術再生的牙本質存在牙本質小管數量減少、結構紊亂，甚至小管結構消失等問題，難以恢復天然牙本質的神經感受和機械傳導的功能。因此，功能性牙本質再生仍未實現[2]。在牙發育中，牙本質小管是由極化的成牙本質細胞沿著細胞突起側分泌基質，隨后基質發生礦化，從而形成容納成牙本質細胞突起的管狀結構。因此，成牙本質細胞極化是牙本質小管形成的前提條件[3-4]。細胞極化是以細胞骨架重排、細胞器重定位以及生物大分子非對稱分布為特征的細胞活動[5]。在成牙本質細胞發生極化時，細胞器的形態、定位與取向會發生相應變化以適應細胞的功能活動。極性的形成對成牙本質細胞的分化成熟和功能發揮至關重要，但影響成牙本質細胞極化的具體機制尚不明確。

微陣列技術目前已較為成熟，常用陣列制備方法包括光刻技術、軟光刻技術、熱模壓印技術等，由于其可以模擬人體內微環境的形貌結構及理化性質，將細胞限制在特定區域內，從而調控細胞形狀和面積，多用來探究微環境中各種物理或化學因素對細胞行為的調控作用，常用于細胞增殖、極化和分化等方面的研究[6]。

本研究通過微陣列技術促使體外孤立的人牙髓干細胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）呈現出了與天然成牙本質細胞高度相似的細胞形態，并基于此探究了限域面積與成牙本質細胞極化和分化的相關性，推斷細胞面積可能是影響成牙本質細胞極化和分化的重要因素。

1 材料和方法

1.1 圖案化微陣列的設計與制備

利用Adobe Illustrator 軟件設計，繪制出由正方形與三角形組合而成的模擬成牙本質細胞形態的非對稱圖案，正方形邊長與三角形高度比值為2∶1，面積分別為1 800、2 700、3 600 μm2，以探究不同面積的微圖案對細胞行為的調控影響。根據設計好的微陣列參數，制作玻璃光刻掩模板。將載玻片裁成預設尺寸，無水乙醇和去離子水依次浸泡沖洗吹干后，放入plasma 機器進行表面等離子體清洗10 min，使載玻片表面活化為硅羥基便于接枝。將處理好的載玻片浸入無水乙醇（Et-OH） 和硅烷偶聯劑（silane coupling agent，SCA）（Sigma 公司，美國） 的混合硅烷溶液中，30 min后無水乙醇充分清洗樣品吹干備用。使用凝膠單體聚乙二醇二丙烯酸酯（polyethylene glycol diacrylate，PEGDA）、2-羥基-4’ - （2-羥乙氧基） -2-甲基苯丙酮配置水凝膠溶液。將載玻片置于光刻機載物臺上，在其上方滴加50 μL凝膠預聚體，蓋上掩模板，紫外光（ultraviolet，UV） 曝光10 s 后獲得目標PEGDA凝膠圖案用于后續實驗（圖1）。

1.2 細胞分離培養與鑒定

將因正畸需要拔出的人離體牙置于含有1%青霉素?鏈霉素（Sigma 公司，美國） 的PBS 溶液中，利用酶消化法提取hDPSCs，隔3 d 換1 次液，待細胞生長至對數生長期時傳代，后續實驗使用P3-P5細胞。采用流式細胞技術檢測hDPSCs 表面標志物，陽性標志物為CD90、CD105，陰性標志物為CD34、CD45。實驗由吉林大學口腔醫院醫學倫理委員會批準，批準號：SJDKQ2024031。

1.3 細胞接種

將微圖案樣品置于6 孔板中，75%乙醇浸泡，同時紫外滅菌30 min。PBS 緩沖液洗滌樣品去除殘留乙醇。細胞懸液接種至樣品表面，接種密度為每孔4×104個，貼壁1 h 后用PBS 緩沖液沖洗未貼壁細胞，隨后細胞在孵箱（37 ℃，5%CO2） 內培養。

1.4 免疫熒光染色

細胞培養1 d與成骨誘導5 d后，分別進行高爾基體基質蛋白130 （golgi matrix protein 130，GM-130） 和Ⅰ型膠原α1 鏈（collagen type Ⅰalpha 1chain，Col1α1） 的染色。4%多聚甲醛固定15 min，在0.2%Triton X-100PBS 中透化5 min，5%牛血清白蛋白（北京蘭杰柯科技有限公司） 阻斷1 h。標記細胞骨架微絲用羅丹明標記鬼筆環肽（北京索萊寶科技有限公司） 在室溫孵育30 min。標記高爾基體與Col1α1 用稀釋比1∶200 的GM130 （BD公司，美國） 與Col1α1 （武漢三鷹生物技術有限公司） 一抗過夜孵育，后續以1∶200 的稀釋比孵育二抗Fitc 偶聯山羊抗小鼠IgG （武漢三鷹生物技術有限公司） 與Fitc 偶聯山羊抗兔IgG （武漢三鷹生物技術有限公司），細胞核使用4’ ，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’ ，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（北京索萊寶科技有限公司） 染色7 min。洗凈后使用抗淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 堿性磷酸酶染色

P3 的細胞培養1 d 后，加入成骨誘導液（含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/mL 維生素C 和10 nmol/L 地塞米松的完全培養基），每隔3 d 換1 次液，成骨誘導培養7 d 后用4%多聚甲醛固定15 min，堿性磷酸酶試劑盒進行染色后置于顯微鏡下觀察。

1.6 極化與分化指征及Image J 分析

篩選微陣列上符合微圖案形狀且孤立存在的hDPSCs，對其進行染色后，拍照取圖。通過查閱文獻定義了以下極化及分化指標，示意圖見圖2。極化指標：1） 細胞極化角：當高爾基體位于穿過細胞核質心和仿成牙本質細胞微圖案突起尖端長軸兩側120°范圍內時表示發生極化[7]；2） 細胞核?高爾基體距離：在成牙本質細胞極化中，高爾基體轉運至細胞核和成牙本質細胞突起之間的核上區域，當細胞核與高爾基體質心相距越遠表示極化程度越高[8]；3） 細胞核重定位距離：細胞核質心距離細胞質心后移程度越大，細胞極化程度越高；4） 細胞核重定向角：細胞核長軸與細胞長軸之間夾角越小表示極化程度越高；5） 細胞核面積：細胞核面積越大，細胞極化程度越高；6） 細胞核縱橫比（aspect ratio，AR）：細胞核AR越大，細胞極化程度越高。分化指標：1） 細胞成牙向分化率：堿性磷酸酶染色后，孤立hDPSCs 中發生成牙向分化的單細胞百分率；2） 細胞平均光密度值（average optical density，AOD）：Image J軟件進行堿性磷酸酶的AOD值的半定量分析；3）Col1α1 平均熒光強度值（mean fluorescent intensity，MFI）：Image J 軟件進行Col1α1 的MFI 值的半定量分析。

1.7 統計學分析

利用GraphPad Prism 9.0 軟件進行統計分析并繪圖，結果以平均值±標準差表示，采用單因素方差分析定量數據，Plt;0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hDPSCs 的培養及鑒定結果

酶消化法培養5 d 后，可見有部分hDPSCs 貼壁增殖。待細胞長至對數生長期進行傳代，1 d后，鏡下可見細胞增殖至80%～90%，呈長梭形，立體飽滿，形態似成纖維細胞。傳至第3 代可見細胞生長狀態良好。流式細胞鑒定顯示，細胞表面標志物CD90 和CD105 的陽性率為99.9%和97.1%，CD34 和CD45 的表達為陰性（圖3）。

2.2 微陣列技術通過限域作用調控hDPSCs 形態

光鏡觀察證實PEGDA微圖案與光刻板設計圖樣精準匹配。細胞接種后，篩選僅容納單個hDPSCs的微圖案，肌動蛋白染色提示細胞形狀與微圖案形狀高度相符，呈現成牙本質細胞樣形態。統計3 種面積圖案化微陣列上的細胞分布，發現細胞接種率均高于50%，證實所構建的材料體系生物安全性較好。同時，DAPI 熒光染色證實3 種面積微圖案的單細胞接種率均高于41.6%，可有效分析孤立hDPSCs 的細胞行為。因此，本研究利用微陣列技術成功構建了適用于探究成牙本質細胞極化的體外研究平臺（圖4）。

2.3 微陣列限域面積調控hDPSCs 極化

通過對孤立hDPSCs 進行免疫熒光染色，比較3 種不同面積圖案下孤立hDPSCs 的極化水平。首先，以細胞極化角作為評價指標時，發現培養在3 600 μm2 面積微圖案上的孤立hDPSCs 中，約58%的細胞高爾基體定位在穿過細胞核質心與圖案突起尖端長軸兩側120°范圍內，這一比例顯著高于1 800 μm2 （Plt;0.05）。其次，在成熟的成牙本質細胞中，高爾基體移動至極化頂端一側，而在3 600 μm2面積時，孤立hDPSCs 中細胞核?高爾基體距離最大（Plt;0.05）。3 種面積下細胞核重定向角差異無統計學意義；3 600 μm2 微圖案中孤立hDPSCs 細胞核的后移距離最遠（Plt;0.05），細胞核面積與AR的數值也較高（Plt;0.05）。綜上提示，孤立hDPSCs 極化水平與細胞鋪展面積呈正相關（圖5）。

2.4 微陣列限域面積調控hDPSCs 分化

堿性磷酸酶染色結果顯示，在1 800、2 700、3 600 μm2面積中孤立hDPSCs 的成牙向分化率分別為10.69%、13.48% 和17.08%，其中3 600 μm2 面積微圖案中細胞的成牙向分化率最高（Plt;0.05）。對發生成牙向分化的孤立細胞進行AOD分析，發現3 600 μm2面積時AOD值最高（Plt;0.05）。Col1α1熒光染色結果顯示，在1 800、2 700、3 600 μm2面積中孤立hDPSCs 的MFI 分別為13.34、14.01 和18.21，其中3 600 μm2面積微圖案中細胞的MFI 值最高（Plt;0.005）。以上結果提示孤立hDPSCs 分化水平與細胞鋪展面積也存在正相關關系（圖6）。

3 討論

齲或外傷等多種外部刺激可引起局部成牙本質細胞變性壞死，此時牙髓中未分化的間充質細胞可遷移至損傷部位，形成修復性牙本質，一定程度上阻斷外部刺激對牙髓的損傷[9]。然而在修復性牙本質形成過程中，部分間充質細胞難以發生極化，致使細胞胞體被包裹在其分泌的基質中，形成骨樣牙本質[10]。骨樣牙本質因缺乏天然牙本質的管狀結構，難以實現神經感受和機械傳導作用，因而其生理性功能不完善。

牙發育鐘狀期，牙乳頭未分化的間充質細胞在內釉上皮誘導下逐漸分化成熟，轉化為高柱狀、具有頂端突起且細胞器重定位的成牙本質細胞[11]。隨后，細胞沿突起周圍分泌基質，胞體后退，進而形成管狀牙本質[12]。因此，成牙本質細胞極化是牙本質管狀結構形成的基礎。然而除上述形態學特征外，目前關于成牙本質細胞極化的研究仍較少，調控極化的具體因素和機制尚不明確，闡明這一問題有望為功能性牙本質再生提供理論依據。

利用光刻等技術，研究人員可以設計并構建對細胞黏附/鋪展具有限制作用的微圖案。PEGDA水凝膠因其出色的生物相容性和持久的抗蛋白黏附特性，現已廣泛應用于微陣列制備[13]。細胞接種于PEGDA水凝膠微陣列后，其黏附/鋪展受邊界抗黏附材料的限制，致使細胞呈現與微圖案一致的細胞形態[14]。微陣列技術有助于探討微環境中各種物理參數對細胞行為的調控作用[15]。此外，通過篩選適宜的微圖案面積，研究人員得以分離并培養單個細胞，從而排除細胞間通訊對細胞行為的干擾，在單細胞層面展開研究，更為精密準確。本研究基于以PEGDA水凝膠為抗黏附材料的微陣列技術，構建了模擬天然成牙本質細胞極化形態的微圖案，促使孤立hDPSCs 呈現出了與天然成牙本質細胞高度相似的極化形態。

因本實驗構建的微圖案陣列具有一定厚度（約10 μm），因此所培養的hDPSCs 可同時兼具二維培養和部分三維培養的特征。本課題組前期測得，培養在納米纖維表面時hDPSCs 面積約1 900 μm2，因此本實驗中選取1 800 μm2作為小面積參數，保證細胞可完全鋪滿微圖案。同時，培養在平整表面時hDPSCs 面積約3 287 μm2，因此本實驗選取3 600 μm2作為大面積參數。最后，選取二者中間數2 700 μm2作為中間面積參數進行實驗。

目前有關成牙本質細胞極化的相關指標較少，本研究根據成牙本質細胞極化時的細胞形態及細胞器取向、排列的變化，參照前期極化相關文獻，補充定義了以下6 種極化指標。研究[16]認為細胞核重定位是細胞極化中最先發生的細胞器運動，Cdc42-MRCK通過調節肌動蛋白-肌球蛋白的逆向流動，使細胞核向后移動。Fructuoso 等[17]發現細胞極化時細胞核位移至近基底側，核長軸與細胞遷移軸平行，且細胞核重定向在細胞極化和定向遷移中發揮重要作用。有研究[18]發現，隨著肌動球蛋白的收縮能力增加，橫跨細胞核的肌動蛋白纖維對細胞產生垂直壓縮力，使細胞核變得伸長和扁平，由此認為在仿成牙本質細胞中，細胞核面積越大， 且細胞AR 越大， 細胞的極化程度越高。

在本實驗中，通過比較3 種面積的仿成牙本質細胞的極化程度，發現在3 600 μm2時細胞的多項極化指標表達最高，即極化率最高。此外發現細胞核重定向角在3 個面積間差異無統計學意義。Maninová 等[19]認為細胞核長軸與遷移方向趨于一致是在核旋轉運動被限制的情況下發生的，因此推斷可能是由于本實驗中微圖案的寬度較大，對細胞核產生的限制效應不足以限制核旋轉，從而導致核重定向未出現顯著差異。

McBeath 等[20]將人間充質干細胞接種至2 種面積的正方形微圖案中進行成骨誘導，發現較大面積中細胞的成骨分化率更高。因此，細胞的形狀面積可調控細胞分化。本研究探究了不同面積仿成牙本質細胞形態微圖案對孤立hDPSCs 成牙分化的影響，發現面積越大，越有利于細胞分化的發生，無論是堿性磷酸酶染色陽性率和AOD，還是Col1α1 的MFI，均在3 600 μm2時表達最高，即成牙本質細胞分化水平與限域面積密切相關。

牙發育中，隨著成牙本質細胞的分化成熟，極性相關蛋白的表達也隨之增加[21]，本課題組前期也證實了孤立hDPSCs 極化和分化呈現伴行關系[22]。本實驗中，孤立hDPSCs 極化結果與分化結果的趨勢一致，均隨著限域面積增大，細胞極化和分化水平升高，再次驗證了二者的伴行關系。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。

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（本文編輯 杜冰）