基于網(wǎng)絡(luò)藥理、分子對接和分子動(dòng)力學(xué)模擬探討蛇床子治療牙周炎伴骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制

[摘要] 目的 聯(lián)合使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接和分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)探討蛇床子治療牙周炎伴骨質(zhì)疏松的活性成分及潛在靶點(diǎn)，并探討其可能的作用機(jī)制。方法 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫、SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道篩選蛇床子的主要化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)；采用多種數(shù)據(jù)庫預(yù)測牙周炎和骨質(zhì)疏松的作用靶點(diǎn)；利用Venny 2.1 獲取蛇床子與牙周炎和骨質(zhì)疏松的交集靶點(diǎn)；采用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建交集靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI） 圖并使用Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建活性成分?交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，對其進(jìn)行拓?fù)浞治龊Y選關(guān)鍵靶點(diǎn)和核心活性成分；基于Metascape 平臺對交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（GO） 和京都基因與基因組百科全書（KEGG） 富集分析；選取節(jié)度點(diǎn)（degree） 值排名前5 位的核心靶點(diǎn)和核心活性成分，使用Discovery Studio 2019 軟件對配體和受體進(jìn)行分子對接，并將結(jié)果可視化；使用Gromacs2022.3 進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，以評估核心活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)之間相互作用的穩(wěn)定性。結(jié)果 篩選得到蛇床子的20 個(gè)潛在活性成分，蛇床子治療牙周炎伴骨質(zhì)疏松的作用靶點(diǎn)116 個(gè)；對116 個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，蛇床子可能通過磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶、晚期糖基化終產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體等信號通路發(fā)揮治療作用；分子對接結(jié)果發(fā)現(xiàn)核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)能夠較好地結(jié)合，分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)一步驗(yàn)證了香葉木素-AKT1 復(fù)合體穩(wěn)定性。結(jié)論 本研究揭示蛇床子通過多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)治療牙周炎伴骨質(zhì)疏松的潛在分子藥理機(jī)制，為后續(xù)藥物開發(fā)研究及臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 蛇床子； 牙周炎； 骨質(zhì)疏松； 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)； 分子對接； 分子動(dòng)力學(xué)模擬

[中圖分類號] R781.4 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2025.2024275

牙周炎是一種發(fā)生在牙周支持組織的慢性感染性疾病，其特征是牙周韌帶和牙槽骨的進(jìn)行性破壞，臨床表現(xiàn)主要為牙齦炎癥、牙槽骨吸收、牙周袋形成及牙松動(dòng)和移位[1]。骨質(zhì)疏松是最常見的代謝性骨病之一，其特征是骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)的破壞，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。二者在中老年人中發(fā)病率高，具有共同的危險(xiǎn)因素[2]，如年齡、糖尿病、維生素D 與鈣的缺乏、吸煙等。研究[3-5]顯示，牙周炎與骨質(zhì)疏松具有明顯的相關(guān)性，由骨質(zhì)疏松癥引起的全身骨代謝失衡會導(dǎo)致局部牙槽骨吸收加重，中藥復(fù)方等輔助治療慢性牙周炎合并骨質(zhì)疏松能改善療效，降低炎性因子水平，緩解骨代謝失衡，促進(jìn)新骨生成。

傳統(tǒng)的牙周治療方法包括基礎(chǔ)治療、手術(shù)治療和藥物治療。基礎(chǔ)治療可以減輕牙周炎癥反應(yīng)，但很難完全清除深牙周袋內(nèi)的致病菌，殘留在牙周袋深處的致病菌仍會導(dǎo)致局部致炎微環(huán)境[6]。牙周手術(shù)可以部分恢復(fù)缺失的牙槽骨，但其適應(yīng)證有限，對于患有全身性疾病、生理功能衰退的老年患者，往往只適合非手術(shù)治療[7]。全身或局部輔助使用抗菌藥物，如甲硝唑、四環(huán)素等，可有效控制牙周袋內(nèi)炎癥，增強(qiáng)基礎(chǔ)治療效果，在一定時(shí)間內(nèi)具有高效率。但抗菌藥物的應(yīng)用也可能帶來口腔局部菌群耐藥性的產(chǎn)生，擾亂正常的口腔微生物群落，局部抗生素制劑也不能長期用作牙周炎的常規(guī)治療，因此迫切需要尋找和開發(fā)更安全、經(jīng)濟(jì)、有效的藥物[8-9]。天然藥物具有成本低、不良反應(yīng)發(fā)生率低、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，篩選具有抗菌、抗炎、抑制骨吸收的天然產(chǎn)物已成為開發(fā)預(yù)防和治療牙周炎藥物的新途徑之一。

蛇床子為傘形科蛇床屬植物蛇床的干燥成熟果實(shí)，目前已鑒定出400 多種化學(xué)成分，主要含有香豆素、色原酮、揮發(fā)油、苯并呋喃及萜類等成分[10]。目前對蛇床子的研究主要集中于骨質(zhì)疏松的治療[11]，而蛇床子是否可以減少牙周炎引起的牙周支持組織喪失，目前研究報(bào)道較少。最近有研究表明，蛇床子素可以通過上調(diào)miR-26a 表達(dá)來促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞的增殖和遷移[12]，蛇床子素通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分泌核因子受體激活因子-κB配體（receptor activator for nuclear factor- κB ligand，RANKL） 影響大鼠正畸牙牙周組織的重建[13]，但由于蛇床子成分多樣且研究存在局限性，其在治療牙周炎伴骨質(zhì)疏松方面的靶點(diǎn)和作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和藥理學(xué)等多學(xué)科、多領(lǐng)域的綜合研究方法，可從多靶點(diǎn)、多途徑、多角度來闡述藥物治療疾病的作用機(jī)制[14]。基于此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測蛇床子治療牙周炎伴骨質(zhì)疏松的活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)及通路，同時(shí)采用分子對接和分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，旨在為進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)研究、新藥開發(fā)和臨床運(yùn)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 蛇床子活性成分及靶點(diǎn)篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以“蛇床子（Cnidii Fructus）”為檢索詞，設(shè)定口服生物利用度（oral bioavailability，OB） ≥30%， 類藥性（druglikeness，DL） ≥0.18[15]為條件篩選蛇床子潛在活性成分，并納入已有文獻(xiàn)報(bào)道具有相關(guān)藥理作用的其他重要活性成分。將納入的活性成分通過TCMSP和SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http：//swisstargetprediction.ch/） [16]進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，最后利用UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org） [17]對獲取的靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范化處理，得到蛇床子活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.2 牙周炎和骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)篩選

以“periodontitis”為檢索詞，檢索GeneCards（https：//www. genecards. org/）、DisGeNET （https：//www.disgenet.org/） 和DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca/） 獲取牙周炎潛在作用靶點(diǎn)，其中GeneCards 數(shù)據(jù)庫以Relevance score≥1 為篩選條件，同時(shí)在GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/） 里進(jìn)行檢索，選取牙周炎的數(shù)據(jù)集GSE-16134[18]用于后續(xù)分析。數(shù)據(jù)集使用GPL570 測序平臺，首先在Perl 中進(jìn)行數(shù)據(jù)校正，使用R 語言4.3.1 軟件中的Limma 包進(jìn)行差異基因分析，以Plt;0.05 和|logFC|gt;1 為條件，篩選出牙周炎的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），并用ggplot2 包繪制火山圖和熱圖。

以關(guān)鍵詞“osteoporosis”進(jìn)行檢索，檢索Dis‐GeNET、GeneCards 和CTD 數(shù)據(jù)庫（https：//ctdbase.org/） 獲取骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)，GeneCards 數(shù)據(jù)庫使用與上述相同的篩選條件，CTD數(shù)據(jù)庫以InferenceScore≥50 為篩選條件，同時(shí)在GEO數(shù)據(jù)庫里進(jìn)行檢索，選取骨質(zhì)疏松的數(shù)據(jù)集GSE35959[19]用于后續(xù)分析，相同條件篩選出骨質(zhì)疏松的DEGs，并繪制火山圖和熱圖。將得到的牙周炎和骨質(zhì)疏松作用靶點(diǎn)與1.1 節(jié)獲得的蛇床子作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny2.1 （https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），取交集并繪制韋恩圖。

1.3 構(gòu)建“活性成分?交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 3.9.1 軟件，導(dǎo)入活性成分?交集靶點(diǎn)相關(guān)數(shù)據(jù)信息，構(gòu)建“活性成分?交集靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)，使用Network Analyzer 計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，根據(jù)節(jié)點(diǎn)度（degree） 值，篩選出蛇床子的核心活性成分。

1.4 構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interactionnetwork，PPI）

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//stringdb.org/） [20]，限定物種為“Homo sapiens”“Settings”，最低要求交互得分設(shè)為0.4，隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點(diǎn)，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲得PPI圖。保存TSV格式文件，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件對PPI 圖進(jìn)行可視化，使用cytoHubba 插件中的MCC算法篩選出PPI 中排名前10 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 基因本體論（gene ontology，GO） 功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopediaof genes and genomes，KEGG） 通路富集分析及可視化

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 平臺（http：//metascape.org/gp/index.html） [21]，限定物種“Homo sapiens”，設(shè)置Plt;0.01，進(jìn)行GO 功能富集分析[22]及KEGG 通路富集分析[23]，利用微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn） 對排名前20 的條目進(jìn)行可視化，繪制GO富集分析柱狀圖和KEGG通路富集分析氣泡圖。

1.6 分子對接

使用Discovery Studio （DS） 2019[24]軟件進(jìn)行分子對接。從PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） [25]獲取蛇床子活性成分degree 值排名前5 的化合物結(jié)構(gòu)，并使用Chem3D軟件將其轉(zhuǎn)換為最小自由能的3D 空間構(gòu)象的mol2 格式[26]。從RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/） [27]中獲取degree 值排名前5 的核心靶點(diǎn)的3D晶體結(jié)構(gòu)。在進(jìn)行分子對接之前，首先評估對接流程的精度及可靠性[28]，抽離靶蛋白復(fù)合物的原配體，再對接到復(fù)合物的結(jié)合口袋，計(jì)算對接后配體的構(gòu)象與原始晶體結(jié)構(gòu)中配體構(gòu)象的均方根偏差（rootmean square deviation，RMSD），一般認(rèn)為當(dāng)RMSD≤2.0 ? 時(shí)，證明該對接方法是可靠的[29]。接著將關(guān)鍵化合物配體與核心靶點(diǎn)受體輸入DS 中進(jìn)行對接，并計(jì)算對接得分-CIE （-CDOCKER INTER‐AC-TION ENERGY），-CIE 值越大，蛋白質(zhì)與配體的結(jié)合親和力越大[30]，對結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.7 分子動(dòng)力學(xué)

使用Gromacs2022.3[31]進(jìn)行100 ns 的分子動(dòng)力學(xué)模擬，以評估蛋白質(zhì)-配體復(fù)合體的結(jié)合穩(wěn)定性。分子動(dòng)力學(xué)模擬采用Amber99sb-ild 力場，使用Gaussian16W 進(jìn)行加氫和計(jì)算RESP （restrainedelectrostatic potential） 電勢。體系在TIP3P 水分子的十二面體方框中溶劑化，并在0.154 mol/L的濃度下加入Na+以中和體系的電荷。在恒定溫度（300 K） 和壓力（1 bar） 下，逐步進(jìn)行時(shí)長為100 ps的等溫等容系綜（canonical ensemble，NVT）平衡和等溫等壓系綜（constant-pressure，constanttemperature，NPT） 平衡，化合物中的受限原子在其初始坐標(biāo)處使系統(tǒng)平衡。運(yùn)行時(shí)間為100 ns，時(shí)間步長為2 fs。使用Gromacs 內(nèi)置工具計(jì)算配體的RMSD、均方根波動(dòng)（root mean square fluctuation，RMSF） 和回旋半徑（radius of gyration，RG） 等，并通過MM/GBSA （molecular mechanics generalizedborn surface area） 計(jì)算蛋白質(zhì)與配體的結(jié)合能值和相互作用[32]。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子主要活性成分及作用靶點(diǎn)

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索到蛇床子化學(xué)成分共有114 個(gè)，經(jīng)篩選共得到19 個(gè)活性成分。研究[33]表明蛇床子素可以促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，盡管其DL 低于篩選標(biāo)準(zhǔn)，仍將其列入活性成分表，20 個(gè)活性成分?jǐn)?shù)據(jù)信息見表1。通過TCMSP 和Swiss-TargetPrediction 數(shù)據(jù)庫獲取活性成分作用靶點(diǎn)，與UniProt 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因匹配，刪除重復(fù)及無效靶點(diǎn)，得到526 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)基因靶點(diǎn)。

2.2 疾病作用靶點(diǎn)篩選及交集靶點(diǎn)的獲取

檢索GeneCards、DisGeNET、DrugBank 數(shù)據(jù)庫分別獲得1 139、682、24 個(gè)牙周炎靶點(diǎn)。對數(shù)據(jù)集GSE16134 進(jìn)行差異分析獲得134 個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因102 個(gè)，下調(diào)基因32 個(gè)，取并集去重后共獲得1 557 個(gè)牙周炎作用靶點(diǎn)。檢索Gene‐Cards、DisGeNET、CTD 數(shù)據(jù)庫分別獲得1 098、1 357、520 個(gè)骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)。對數(shù)據(jù)集GSE35959進(jìn)行差異分析共獲得1 112 個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因639 個(gè)，下調(diào)基因473 個(gè)，取并集去重后共獲得3 133 個(gè)骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)。牙周炎和骨質(zhì)疏松差異基因的熱圖和火山圖見圖1。將篩選出的蛇床子靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)輸入Venny 2.1 軟件，得到116 個(gè)交集靶點(diǎn)并繪制韋恩圖（圖2）。

2.3 “ 活性成分?交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建活性成分?交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。通過拓?fù)浞治鲇?jì)算出節(jié)點(diǎn)的degree 值，degree 值排名前5 的活性成分依次是美花椒內(nèi)酯（Xanthoxylin N）、蛇床子素（osthol）、香葉木素（Diosmetin）、（E）-2，3-bis （2-keto-7-methoxy-chromen-8-yl） acrolein、O-乙酰二氫歐山芹酯（O-Acetylcolumbianetin），表明以上成分可能是蛇床子治療牙周炎伴骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵活性成分。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將交集靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，保存為TSV格式后將其導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件（隱藏1 個(gè)游離節(jié)點(diǎn)） 進(jìn)行可視化，制作PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖4A），排名前10 的關(guān)鍵靶點(diǎn)分別為BCL-2、CASP3、JUN、AKT1、PPARG、EGFR、MTOR、TGFB1、CASP9、MMP9 （圖4B），以上靶點(diǎn)可能在治療牙周炎伴骨質(zhì)疏松中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

2.5 GO功能富集與KEGG通路富集分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 富集分析，共獲得1 853 條生物學(xué)過程，其中生物過程（biological processes，BP） 1 630 條、分子功能（molecular functions，MF） 136 條和細(xì)胞組分（cellular components，CC） 87 條。BP 主要涉及對激素的反應(yīng)、程序性細(xì)胞凋亡正調(diào)控、細(xì)胞遷移正調(diào)控等。MF 主要涉及磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、激酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合等。CC主要涉及膜側(cè)、受體復(fù)合體、質(zhì)膜外側(cè)等。Count 值越大，表示富集到的基因越多，選取BP、MF 和CC Count 值排名前20的條目繪制條形圖（圖5）。KEGG 通路富集分析得到182 條信號通路，主要富集于磷脂酰肌醇3 激酶?蛋白激酶（phosphoinositide 3-kinase-protein ki‐nase B，PI3K-Akt） 信號通路、晚期糖基化終產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體（advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products，AGE-RAGE） 信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosisfactor，TNF） 信號通路、癌癥通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路等，選取Enrichment 排名前20條目繪制氣泡圖（圖6）。

2.6 分子對接

以5 個(gè)核心活性成分美花椒內(nèi)酯、蛇床子素、香葉木素、（E）-2，3-bis （2-keto-7-methoxy-chromen-8-yl） acrolein、O-乙酰二氫歐山芹酯為配體，分別與排名前5 的關(guān)鍵靶點(diǎn)BCL2、CASP3、JUN、AKT1、PPARG為受體進(jìn)行分子對接。首先對蛋白質(zhì)大分子進(jìn)行對接流程的可靠性驗(yàn)證，BCL2、CASP3、JUN、AKT1 和PPARG的RMSD均≤2.0 ?，證明對接方法可靠。-CIE 值越大意味著對接活性越好，對接結(jié)果見表2。蛇床子中核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能力較好，其中與美花椒內(nèi)酯對接最強(qiáng)的靶點(diǎn)是PPARG；與蛇床子素、香葉木素、（E）-2， 3-bis （2-keto-7-methoxy-chromen-8-yl） acrolein和O-乙酰二氫歐山芹酯對接最強(qiáng)的靶點(diǎn)均是AKT-1，利用軟件將結(jié)合能力強(qiáng)的受配體進(jìn)行可視化（圖7）。

2.7 分子動(dòng)力學(xué)模擬

對-CIE 較高且有繼續(xù)研究意義的構(gòu)象香葉木素-AKT1 復(fù)合體進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬來進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)合的穩(wěn)定性。RMSD 值反映蛋白質(zhì)構(gòu)象的波動(dòng)程度，可用于評估配體與靶蛋白結(jié)合的穩(wěn)定性，數(shù)值越小表示結(jié)合越穩(wěn)定。圖8A 示該復(fù)合體的RMSD值波動(dòng)較小，波動(dòng)范圍在0.2～0.4 nm，證明復(fù)合體在模擬過程中處于較穩(wěn)定狀態(tài)。RMSF 反映蛋白質(zhì)氨基酸殘基的波動(dòng)，圖8B示復(fù)合體整體結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，但在部分區(qū)域有所波動(dòng)。氫鍵是最強(qiáng)的非共價(jià)鍵相互作用之一，模擬過程中形成的氫鍵的數(shù)量反映了結(jié)合強(qiáng)度。圖8C示模擬過程中氫鍵數(shù)量變化，在25 ns 后的時(shí)間段里至少形成了2 個(gè)氫鍵，復(fù)合體逐漸穩(wěn)定。RG通常用于評估蛋白質(zhì)整體緊湊性，同時(shí)可用來衡量分子的親和性。圖8D示在模擬過程中蛋白質(zhì)的RG保持相對穩(wěn)定。溶劑可及表面積（solvent accessible surface area，SASA） 描述蛋白質(zhì)分子與周圍水分子之間的相互作用，體現(xiàn)了蛋白質(zhì)親疏水性的變化，圖8E 示與香葉木素配體結(jié)合后，AKT1 的SASA 無明顯變化，表明配體的結(jié)合對AKT1 結(jié)構(gòu)影響較小。

MM/GBSA 方法被廣泛應(yīng)用于模擬后計(jì)算結(jié)合自由能，從而來預(yù)測復(fù)合體的穩(wěn)定性。GGAS表示氣相總自由能，是范德華力（VDWAALS）和靜電勢能（EEL） 之和，GSOLV表示溶劑化能，是非極性溶劑化能（ESURF） 和極性溶劑化能（EGB） 的總和。圖9A 示復(fù)合體的結(jié)合自由能為?29.08 kcal/mol，其中范德華力為?37.71 kcal/mol、靜電勢能為?15.35 kcal/mol、非極性溶劑化能為?5.07 kcal/mol，三者均有利于小分子化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合，且范德華力和靜電勢能的作用力較強(qiáng)，起主導(dǎo)作用，而非極性溶劑化能較弱，起次要作用，極性溶劑化能則不利于兩者的相互作用。圖9B展示了能量貢獻(xiàn)絕對值大于1.0 kcal/mol的氨基酸殘基的結(jié)合能值，小分子的結(jié)合能為?17.15 kcal/mol，總結(jié)合能為負(fù)值且較強(qiáng)，復(fù)合體體系較穩(wěn)定，每個(gè)氨基酸殘基在能量分布上對復(fù)合體的穩(wěn)定性都有重要貢獻(xiàn)。

3 討論

牙周炎是一種慢性炎癥性疾病，是全球范圍內(nèi)成人牙齒喪失的主要原因之一，菌斑微生物及其產(chǎn)物是牙周炎的始動(dòng)因子[34]。其中慢性牙周炎高發(fā)于中老年人，老年人也是骨質(zhì)疏松癥的高發(fā)人群，隨著人口老齡化加劇，牙周炎伴骨質(zhì)疏松癥患者逐漸增加，兩者之間的相互作用正逐漸引起重視。牙周炎和骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)，然而牙周炎和骨質(zhì)疏松癥作為合并癥同時(shí)治療的報(bào)道很少[35]。

蛇床子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性溫，歸腎經(jīng)，是中醫(yī)常用的補(bǔ)腎壯陽藥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[36]表明，蛇床子提取物和成分具有抗菌、抗真菌、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤、抗過敏、抗炎、止癢和抗皮炎作用。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測方法，并結(jié)合分子對接和分子動(dòng)力學(xué)模擬的驗(yàn)證手段，對蛇床子治療牙周炎伴骨質(zhì)疏松的潛在靶點(diǎn)和分子機(jī)制進(jìn)行探討。

通過活性成分?交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析顯示，美花椒內(nèi)酯、香葉木素、蛇床子素、（E）-2，3-bis （2-keto-7-methoxy-chromen-8-yl） acrolein、O-乙酰二氫歐山芹酯可能是蛇床子治療牙周炎伴骨質(zhì)疏松的核心活性成分。degree 值排名前10 的關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別為BCL2、CASP3、JUN、AKT1、PPARG、EGFR、MTOR、TGFB1、CASP9、MMP9，這些靶點(diǎn)可能在蛇床子治療牙周炎伴骨質(zhì)疏松中發(fā)揮重要作用。AKT1 是AKT 家族成員，可通過PI3K/AKT信號通路調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡等生物學(xué)效應(yīng)。研究[37]表明調(diào)控該通路可促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞的增殖與成骨分化。有研究[38]發(fā)現(xiàn)AKT1 作為成骨細(xì)胞的信號中介，可以控制成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的分化，AKT1 下調(diào)可促進(jìn)成骨細(xì)胞生成，并可降低破骨細(xì)胞特異性的mRNA，減少破骨細(xì)胞生成。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target ofrapamycin，MTOR） 是磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K） 家族中的一員[39]，是一種高度保守的激酶，也是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的控制中樞。MTOR 可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化功能，并控制炎癥相關(guān)的細(xì)胞增殖和遷移，抑制成骨細(xì)胞凋亡與自噬[40]，可能在牙周炎中起著關(guān)鍵作用。它能夠通過整合自噬過程中的上游信號分子，激活PI3K/AKT/MTOR信號通路，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的自噬來保護(hù)成骨細(xì)胞，抑制其凋亡[41]。

對交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG富集分析顯示，蛇床子活性成分治療牙周炎及骨質(zhì)疏松的機(jī)制與PI3K-Akt 信號通路、AGE-RAGE 信號通路、TNF 信號通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化通路等有關(guān)。研究[42]表明，PI3K-Akt 通路是調(diào)節(jié)炎癥的典型途徑，經(jīng)常在牙周炎進(jìn)展過程中被觸發(fā)，它能夠通過影響下游效應(yīng)分子核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB） 的活性和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生在牙周細(xì)胞增殖和凋亡中起重要作用。PI3K-Akt 信號通路失調(diào)常見于多種疾病，包括癌癥、糖尿病、心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥等[43]。據(jù)報(bào)道，激活PI3KAkt信號通路可以上調(diào)骨形成相關(guān)基因的表達(dá)，增加礦物質(zhì)的形成，保護(hù)成骨細(xì)胞免受凋亡并促進(jìn)成骨[44]。晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycationend products，AGEs） 是由蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)的非酶糖基化和氧化產(chǎn)生的不可逆產(chǎn)物[45]。研究[46-47]發(fā)現(xiàn)，AGEs 與糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor foradvanced glycation end products， RAGE） 相互作用，產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，促進(jìn)NF-κB 表達(dá)及促炎因子和黏附分子的合成和分泌，加速牙周炎的發(fā)病和發(fā)展。糖尿病本身會損害骨細(xì)胞的代謝和功能，導(dǎo)致脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加。最新的系統(tǒng)綜述顯示，AGERAGE信號抑制劑是骨質(zhì)疏松、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等年齡相關(guān)疾病的最新治療靶點(diǎn)[48]。AGEs 可能破壞成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞發(fā)育和分化的正常過程，產(chǎn)生ROS 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，抑制骨礦化和成骨，從而影響骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展[49-50]。TNF 信號通路與炎癥、細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，能激活與炎癥最直接相關(guān)的關(guān)鍵信號通路NF-κB 信號通路，誘導(dǎo)多種炎癥因子如TNF-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL） -1β、IL-6 的產(chǎn)生，且能實(shí)現(xiàn)炎癥級聯(lián)放大等效應(yīng)影響牙周骨穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而影響牙周炎的發(fā)展進(jìn)程[51]。TNF 信號通路可通過骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG） /核因子κB 受體活化因子（receptoractivator for nuclear factor-κ，RANK） /核因子受體激活因子-κB配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）、IL-1β、NF-κB 及其他與細(xì)胞凋亡、炎癥和成骨分化相關(guān)的基因調(diào)節(jié)骨代謝，從而影響骨質(zhì)疏松[52]。

通過分子對接對核心活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)作用關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示配體與受體間具有較好的結(jié)合穩(wěn)定性。對得分較高的復(fù)合體香葉木素-AKT1 進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，與對接結(jié)果一致，RMSD 和RMSF 分析揭示了復(fù)合體的結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)和穩(wěn)定性。氫鍵分析和結(jié)合自由能計(jì)算進(jìn)一步驗(yàn)證了分子間相互作用的可行性和強(qiáng)度，其中范德華力和氫鍵等相互作用對香葉木素-AKT1 復(fù)合體的穩(wěn)定性起著重要作用。

綜上所述，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接和分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)，初步探討了蛇床子通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療牙周炎伴骨質(zhì)疏松的潛在作用機(jī)制。結(jié)果表明蛇床子中的香葉木素、蛇床子素等核心活性成分可以通過BCL2、CASP-3、AKT1、MTOR 等關(guān)鍵靶點(diǎn)作用于PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF 信號通路等關(guān)鍵通路起到調(diào)控炎癥反應(yīng)、緩解氧化應(yīng)激、促進(jìn)成骨、抑制凋亡等作用，為后續(xù)蛇床子等中醫(yī)藥治療牙周炎伴骨質(zhì)疏松的深入研究提供了重要參考。但由于中藥成分及其作用的復(fù)雜性，具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步開展體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為后續(xù)的臨床治療應(yīng)用提供理論依據(jù)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。

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（本文編輯 杜冰）