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糧食中霉菌毒素檢測技術的研究進展

2025-04-11 00:00:00張亞男甘利容劉睿曾皓南國輝吳任之
糧食問題研究 2025年2期
關鍵詞:檢測

摘要:糧食在儲藏過程中可能會因儲存不當被真菌感染,從而被霉菌毒素污染。霉菌毒素對人和動物的生命健康產生了嚴重的負面影響,并在一定程度上對農業經濟造成損失。我國作為糧食生產大國,保證糧食安全關乎未來國家發展,如何確保糧食儲藏過程中的安全是科研人員一直在探究的問題。為了滿足高效、同時檢測多種霉菌毒素的迫切需求,目前已開發出了多種霉菌毒素的檢測方法。本文主要介紹了常見的霉菌毒素及其危害、霉菌毒素的傳統的檢測方法以及當下霉菌毒素檢測的新興技術,對它們的原理、優缺點進行了全面綜述,以期為糧食檢測提供參考。

關鍵詞:糧食 霉菌毒素 檢測技術 "我國是農業大國,糧油作物種植面積巨大。2024年,我國糧食播種面積約119319千公頃,全國糧食總產量70650萬噸。此外,根據相關數據顯示,我國糧食在儲藏、運輸和加工等過程中每年的損失量達700億斤以上[1]。從上述數據來看,我國穩住了糧食“量”的安全。那么,如何進一步穩住糧食的“質”的安全,是需要持續關注的問題。

糧食從田間到餐桌這一過程中的每一環節,都可能被污染,包括機械雜質污染、微生物污染、化學性污染以及鼠蟲害污染等。其中,微生物污染通常是真菌,如霉菌產生的霉菌毒素對糧食的污染。霉菌毒素極易殘留在糧食中,隨著食物鏈進入到人和動物體內,嚴重威脅著人類和動物的健康安全。因此,對糧食進行霉菌毒素檢測,對保障人們的飲食健康、確保糧食的儲藏安全和保障國家的糧食安全具有重要意義。

一、常見的霉菌毒素及其危害

(一)黃曲霉毒素

黃曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)是主要由黃曲霉和寄生曲霉產生的次級代謝產物,具有致癌性、致突變性和遺傳毒性[2]。目前,已經確定的黃曲霉毒素有20種,根據國際癌癥研究機構(IARC),黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)和黃曲霉毒素G2(AFG2)均對人體有致癌作用,AFB1在1993年被列為一類致癌物。賀亞如等[3]對榆林市2021-2022年監督抽檢的小米、高粱樣品進行污染程度和安全狀況進行分析,結果顯示共監測的60批次小米、16批次高粱中AFB1均有檢出,但檢出率較低。

(二)赭曲霉毒素

赭曲霉毒素(Ochratoxins)是由曲霉屬和青霉屬霉菌所產生的次級代謝產物,常見的包括赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)、赭曲霉毒素B(Ochratoxin B,OTB)、赭曲霉毒素C(Ochratoxin C,OTC)。其中,OTA具有最強的毒性,具有肝毒性、腎毒性以及三致作用,被IARC列入2B類致癌目錄[4],其危害性僅次于黃曲霉毒素,我國國家標準規定OTA在谷物及其制品中的限量為5 μg/kg(GB 2761-2017)。趙畢等[5]對浙江省5大類食品中OTA進行了檢驗檢測,結果表明OTA主要暴露在谷物及其制品中,燕麥制品中OTA檢出率最高可達16.1%,其余谷物中OTA檢出率在3.2%-16.1%不等;小米,稻谷等谷物中均有不同程度的檢出。

(三)伏馬菌素

伏馬菌素(Fumonisin,FB)是由串珠鐮刀菌產生的結構類似的次級代謝產物,其類似物在15種以上。最重要的是B系列伏馬菌素,包括伏馬菌素B1(FB1)、伏馬菌素B2(FB2)、伏馬菌素B3(FB3)和伏馬菌素B4(FB4)[6]。其中,FB1的毒性最強并具有致癌性,被IARC列為2B類致癌物。FB主要存在于谷物和谷物食品中,尤其是玉米及玉米制品,人體攝入含有FB的食物,易導致肝毒性和腎毒性,對人體健康造成嚴重損傷[7]。呂宗浩等[8]對寧夏固原市肉牛養殖場飼料的伏馬毒素的污染狀況進行了調查,結果表明在玉米、青貯、麩皮等飼料中均檢出伏馬菌素,其中在玉米中的檢出率最高可達66.67%,最高含量可達3.82 mg/kg。

(四)玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)最初在患有赤霉病的玉米中被發現,也存在于大麥、小麥和水稻等谷物中,主要的產毒菌為鐮刀菌屬真菌[9]。ZEA的熱穩定性強,在食品加工過程中不易被破壞,伴隨食物進入體內易對人體造成損傷。相關文獻顯示,ZEA具有免疫毒性、肝毒性、血液毒性、致畸性和致癌性[10],被IARC列為三類致癌物。

(五)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON),又名為嘔吐毒素,屬于B型單端孢霉烯族毒素,主要產自鐮刀菌屬,尤其是禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌[11]。DON主要存在于小麥、玉米、燕麥等谷物及其制品中,污染率較高。人和動物暴露于DON后,可能會出現一系列不良反應,如食欲不振、嘔吐、腹瀉,嚴重甚至死亡;DON還具有細胞毒性、免疫毒性、遺傳毒性和潛在的致癌作用,被IARC列為三類致癌物。目前,我國國家標準規定食品類DON含量不允許超過1000 μg/kg。張莉等[12]對2016-2022年河南省駐馬店市182份小麥粉及其制品中的DON及其衍生物污染水平進行了調查并評估其膳食風險,結果顯示小麥粉及制品樣本中DON總檢出率為87.4%,濕面條超標率最高10.9%,這表明小麥粉及其制品中的DON污染較為普遍。

二、霉菌毒素的檢測方法

糧食中存在的各類霉菌毒素對人類和動物的健康帶來了嚴重威脅,因而各國以及糧農組織制定的霉菌毒素限量標準、檢測標準越來越嚴格。但這嚴格的標準有利于提高人們對霉菌毒素危害性的認識,以保證人和動物的生命健康。同時還有利于推動霉菌毒素檢測方法和技術的創新發展,不斷提高檢測效率。霉菌毒素的常規檢測方法主要包括超高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法、膠體金免疫層析法、酶聯免疫吸附法等。

(一)常規檢測法

1. 超高效液相色譜法。超高效液相色譜法(Ultra-High Performance Liquid Chromatography,UHPLC)的工作原理同高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)一致。兩種方法均是以液體為流動相,在高壓輸液系統中將帶有分析物的流動相泵入色譜柱中,分析物中的各種成分在色譜柱中被分離,然后進入到檢測器中進行檢測,通過保留時間、峰面積實現分析物的定性、定量檢測。不同的是,UHPLC在運行時具有更高的系統壓力,色譜柱中的固定相的粒徑更小,且UHPLC具有更高的分離度和更快的分析速度,該方法節約了樣品分析的時間,提高了檢測效率。UHPLC雖具有顯著的優勢,但其設備更加精密,耗費的成本更高,對樣品前處理的要求也更高。李丹娜等[13]通過磁性離子液體復合材料固相萃取富集植物油中的DON,并采用超高效液相色譜法對其進行測定,結果顯示DON在0.05-2.0 mg/L范圍內線性良好,線性相關系數為0.9999,平均加標回收率在86.5%~89.4%,檢出限和定量限分別為3.3 μg/kg和10 μg/kg。

2. 液相色譜-串聯質譜法。液相色譜-串聯質譜法(Liquid chromatography/tandem mass spectro

metry,LC-MS/MS)是將液相色譜的分離系統與質譜的分析系統相結合的一種檢測技術。與液相色譜-質譜聯用法(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)的工作原理一致,目標分析物在液相系統中被分離后,進入質譜中進行質量分析。不同的是,LC-MS為單級質譜,分析物在液相系統中分離后,直接進入質譜中被分析。而LC-MS/MS具有兩個串聯的質譜,分析物在被分離后,首先通過第一級質譜被離子化和分析,然后選擇特定的離子進行碎裂,產生的離子碎片再進入到第二級質譜中被分析。LC-MS/MS具有較高的靈敏度和準確度,適用于痕量物質和未知物質的分析。張養冬等[14]采用優化的LC-MS/MS檢測了2015年度4省市10個奶牛場的14個全株青貯玉米樣品,結果顯示10個奶牛場全株青貯玉米樣品中全部檢出的霉菌毒素種類為DON、AFB2和ZEA和麥角醇,含量由高到低依次為DON、ZEA、AFB2、麥角醇,均未超過國家限量。

3. 膠體金免疫層析法。膠體金免疫層析法(Colloidal gold immunochromatographic assay,GICA)的原理是基于抗原-抗體的特異性相互作用,是一種將膠體金標記與免疫層析相結合的快速檢測技術。通過還原法合成的膠體金為紅色或紫紅色,帶有負電荷,可以與帶有正電荷的蛋白質分子結合,由于這種結合是靜電相互作用,因此不會破壞蛋白質的生物特性。GICA由于操作簡單、成本低、檢測速度快、能夠現場檢測以及結果肉眼可讀被廣泛應用于醫療、食品檢測等領域。但GICA具有免疫分析法的通病,極易導致假陽性或假陰性的結果。此外,GICA多用于定性分析的場合,用于定量檢測還需要結合其他技術。例如,賀麗麗[15]采用膠體金免疫層析技術結合德國拜發集團的RIDA SMART APP讀數儀對谷物中的AFs、ZEA、DON進行快速檢測。結果顯示,其回收率基本控制在80%-120%,變異系數小于15%。在實際樣品檢測中,產品檢測值和國標方法檢測值的偏離度控制在±20%范圍之內,說明該產品可以用于谷物及其他樣品中的霉菌毒素含量的現場篩查。

4. 酶聯免疫吸附法。酶聯免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)的工作原理與GICA相似,均是基于抗原-抗體的特異性相互作用。不同的是,ELISA中的標記物為酶,需要催化特定的底物進行顯色來實現對目標物的檢測。ELISA具有操作簡單、高通量、可視化以及靈敏度高等優點,在醫療、食品安全以及環境監測等領域受到青睞。徐加兵等[16]采用UPLC-MS/MS(超高相液相色譜-串聯質譜法)和ELISA兩種方法測定了胖大海中黃曲霉毒素的含量,結果表明UPLC-MS/MS和ELISA兩種方法得到測定結果的標準偏差在3.46%-7.43%范圍內,與UPLC-MS/MS相比,ELISA在測定AFB1和總量時,其差異更小,且未出現假陽性的情況。總的來講,ELISA方法是目前檢驗真菌毒素的一種非常常用的方法,其準確性較高,相較于色譜質譜等方法,具有快速簡便,高靈敏性等特點。然而,ELISA試劑盒制備復雜、操作程序耗時、易受環境干擾、酶易失活,這些缺陷限制了ELISA的進一步應用。

(二)新興檢測法

霉菌毒素的常規檢測法具有儀器設備精密昂貴、檢測有限和靈敏度欠缺、操作程序復雜等局限性。因此,開發出新的檢測方法,解決上述缺陷是亟待解決的問題。許多研究報道了一些新興霉菌毒素檢測技術,如表面增強拉曼光譜、電化學傳感器、比色傳感器以及表面等離子體共振等。這些新技術不僅能夠達到要求的靈敏度和檢測限,同時也提高了檢測速度,具有廣闊的發展前景。

1. 表面增強拉曼光譜。表面增強拉曼光譜(Surface Enhanced Raman Spectroscopy,SERS)是一種表面傳感技術,通過電磁增強和化學增強機制,增強吸附在貴金屬(如金、銀、銅等)納米結構表面的分子的拉曼散射光譜。據研究報道,電磁增強在SERS過程中起主導作用,而化學增強機制的貢獻較小[17]。近年來,SERS因其具有高靈敏度、光漂白少、檢測速度快、目標分子的獨特指紋和窄光譜帶的優點,成為一種非常有前景的檢測技術,在食品科學領域得到了廣泛的應用。Zhang Y等[18]提出了一種基于SERS的納米傳感器,該方法可快速提取并根據金納米顆粒獨特的光譜指紋圖譜可鑒定吸附的霉菌毒素。此外,樣品的預處理只需簡單地過濾,整個分析過程能在1 h內完成,節省了大量的分析時間。總體而言,該方法在食品中霉菌毒素的多重快速檢測中具有重要意義,應用前景廣闊。但SERS在選擇性上可能存在一定的問題,即食品基質中的各種交叉行為,疏水性等都可能影響SERS的選擇性[17]。如何在復雜的食品基質中實現對多種霉菌毒素的快速和準確檢測是亟待解決的問題。目前采用金或銀膠體納米材料可以較好改善SERS的選擇性,但納米材料在傳感器上的不均勻分布或受試樣本在納米材料上的不均勻分布都可能會削弱霉菌毒素檢測的靈敏度[19]。

2. 電化學傳感器。電化學傳感器(Electroche

mical sensor,ES)是一種將分析物與電化學換能器相耦合的工作裝置。ES的原理是利用電化學分析儀將分析物產生的化學信號轉換為電信號,其一般由電極、電解質、信號轉換器以及傳輸電路等組成。根據輸出的電信號與分析物濃度之間的關系能夠實現對分析物進行定性或定量分析。ES的靈敏度高、檢測速度快、操作簡單,并且能夠實現利用便攜式設備進行現場快速檢測,近年來在食品安全檢測、環境監測、醫療、能源等領域成為持續的研究熱點。ES在很大程度上依賴于修飾材料的性能,這些材料包括碳納米材料、金屬納米材料、聚合物、生物活性物質等,因此,可以根據待測物的性質來選擇電化學傳感器的修飾材料。ES檢測霉菌毒素的方式有兩種,一是通過修飾材料直接催化霉菌毒素在電解質溶液中發生的氧化還原反應來讀取電流響應;另一種方式是在電極表面修飾適配體、酶、抗原抗體等生物活性物質,通過記錄這些活性物質與檢測物結合前后的探針信號變化來實現定量檢測[20]。Veenuttranon K等[21]構建了一種能夠同時快速檢測飼料和食品中的ZEA和OTA的NiO-MWCNT(-COOH)/GCE傳感器,在優化條件下,ZEN和OTA在0.01-10.24 μg/mL和0.04-10.24 μg/mL范圍內具有良好的線性響應,檢測限分別為6和15 μg/mL。此外,研究人員同時還制備了基于NiO-MWCNT(-COOH)的絲網印刷電極,制備成本較低,具有較高的商業化潛力。盡管上述ES具有諸多優勢,但其研究仍然停留在實驗室階段,實現商業化還需做出努力,開發出高效的識別元件、能夠同時檢測多種物質、便攜式的傳感器是未來面臨的一大挑戰。

3. 比色傳感器。比色傳感器是基于比色法原理的一種傳感器,即通過比較待測物質溶液的顏色與已知濃度標準溶液間的顏色深淺差異,來確定待測物質的濃度。其制備簡單、成本低、儀器簡單,具有通量高和便攜性等特點[22]。此外,可以用肉眼直接讀取比色測定以獲得結果,這非常適合用于開發便攜式傳感器,對霉菌毒素等有害物質進行現場檢測[23]。目前,比色傳感器在檢測霉菌毒素、農藥殘留、有害氣體等都具有非常不錯的表現。Liu M L等[24]構建了一種鐵-氮-碳單原子酶比色生物傳感器實現了對AFB1的超靈敏檢測,結果表明在最佳情況下,傳感器的檢測限為1.5×10-7 ng/μL,線性范圍為1×10-6-1 ng/μL,超過大多數現有的AFB1檢測試劑盒,且檢驗在2 h內即可完成。Niu X J等[25]構建了一種基于磷酸銀納米顆粒漆酶模擬活性的快速比色傳感器,用于高靈敏、高選擇性地檢測玉米和小麥中的FB1,結果表明傳感器的檢測限(LOD)低至1.73 μg/L,遠低于歐盟委員會和美國食品藥品監督管理局(FDA)設定的FB1最大殘留限量(MRL)。在谷物中FB1檢測的平均回收率為87.8%-104.5%,同時將樣品的顏色變化與智能手機結合,實現對FB1快速檢測。比色傳感器得到了越來越多的發展和應用,但其也存在一些問題[26]:(1)背景顏色對測定結果具有一定的影響;(2)基質成分復雜的樣品影響測定結果,需建立合理的前處理方法;(3)功能材料的穩定性有待提高。

4. 表面等離子體共振。表面等離子體共振(Surface plasmon resonance,SPR)作為一種相對新穎和簡單的分析方法,已被證明具有快速、靈敏、實時性和樣本量小的特點。SPR的基本原理是利用光在金屬和介質界面發生全內反射時產生的衰減波在金屬表面誘導自由電子產生表面等離子體,當波的頻率和波數相等時,兩者產生共振,入射光被吸收,反射光能急劇下降,反射光譜上出現共振峰(即最低反射強度),當吸附在金屬表面的分子數量或該分子的構型發生變化時,可以根據峰的變化對待測物質進行檢測[27]。目前SPR技術已被用于食品、環境、醫學檢驗檢測等領域,在霉菌毒素檢測中,目前已有多項研究報道了SPR在霉菌毒素檢測中的應用。Wu W B等[28]開發了一種基于適配體的SPR生物傳感器,可以用于同時檢測AFB1和AFB2。SPR生物傳感器對兩種霉菌毒素表現出高度特異性,不受OTA、OTB等其他霉菌毒素的影響。盡管SPR技術在生物制藥、醫療診斷、食品安全檢測以及環境監測等領域都有著豐富的研究,但其仍然還存在一些問題需要突破:(1)受環境影響大。金屬-介質界面附近的任何微小變化都能夠導致折射率發生變化,從而影響測定結果。這些影響因子,如溶劑成分、pH、離子強度、溫度以及儀器漂移等都會對信號檢測產生影響。(2)成本高,操作復雜。SPR儀器價格昂貴且體積較大,不利于便攜式現場檢測。

結 語

由真菌代謝產生的霉菌毒素存在于各類食物原料及其制品中,被攝入體內后易對人和動物機體造成急性損傷,甚至可能會導致死亡;殘留在食物中的霉菌毒素隨食物鏈積累,最終到達人體,誘導人體產生慢性疾病。此外,產生的霉菌毒素易污染糧食,導致糧食的營養價值降低,并造成額外的經濟損失。因此,密切監測和控制糧食在儲藏、加工、運輸等過程中的污染狀況至關重要。實際上,對霉菌毒素百分之百的預防和控制是很難實現的,那么,建立靈敏、快速、簡單的霉菌毒素檢測方法就為糧食安全提供了保障。傳統的檢測方法,如基于液相色譜、免疫分析等方法雖具有較高的靈敏度、精確度,但存在設備精密昂貴、需要專業人員操作、繁瑣的前處理程序以及無法現場檢測等缺點。近年來,一些新興檢測技術不斷被開發,它們不僅兼具傳統方法的優點,還克服了傳統方法的缺點,并且能更好地實現現場快速檢測,這些方法在檢測糧食中的霉菌毒素具有巨大的應用潛力。但值得注意的是,這類檢測技術還不夠完善,許多傳感技術仍然停留在實驗室階段,沒有大規模開發和使用。未來,相關檢驗部門應當考慮將這些技術與智能手機、大數據、智能穿戴設備等先進技術相結合,通過機器學習、深度學習等算法以實現精確和穩定的即時化、商業化檢測。

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