LINC00319通過(guò)miR1853p/FOXK1軸對(duì)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞的作用

［摘要］目的探討LINC00319對(duì)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其可能機(jī)制。方法應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR（qRTPCR）與Western blot方法，分別檢測(cè)乳頭狀甲狀腺癌組織和細(xì)胞LINC00319、miR1853p、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子1（FOXK1）的表達(dá)。將siNC、siLINC00319、miRNC、miR1853p mimics、siNC、siFOXK1、pcDNA＋siLINC00319、pcDNAFOXK1＋siLINC00319分別轉(zhuǎn)染至甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR1853p、LINC00319及FOXK1的靶向關(guān)系；應(yīng)用3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BCPAP細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲；采用Western blot方法檢測(cè)Cleavedcaspase3、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）蛋白表達(dá)。結(jié)果與癌旁組織和人正常甲狀腺細(xì)胞比較，乳頭狀甲狀腺癌組織及其細(xì)胞系中LINC00319、FOXK1表達(dá)升高（t=27.19～39.06，F(xiàn)=96.94～216.25，Plt;0.05），miR1853p表達(dá)降低（t=21.83，F(xiàn)=216.25，Plt;0.05）。LINC00319可靶向miR1853p，miR1853p可靶向FOXK1。與相應(yīng)陰性對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染siLINC00319、miR1853p mimics及 siFOXK1均可以抑制細(xì)胞活力、MMP2表達(dá)、MMP9表達(dá)、細(xì)胞克隆形成、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)（F=121.22～180.59，t=12.48～22.59，Plt;0.05），提高細(xì)胞凋亡率和Cleavedcaspase3蛋白表達(dá)（F=586.51、196.33，t=16.43～21.61，Plt;0.05）；共轉(zhuǎn)染siLINC00319與pcDNAFOXK1可以恢復(fù)siLINC00319對(duì)BCPAP細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。結(jié)論LINC00319可通過(guò)靶向miR1853p/FOXK1軸促進(jìn)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞的惡性行為。

［關(guān)鍵詞］甲狀腺癌，乳頭狀；LINC00319；細(xì)胞增殖；分子生物學(xué)" " ［中圖分類(lèi)號(hào)］R736.1

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號(hào)］20965532（2025）01001306" " " doi：10.11712/jms.20965532.2025.61.031[HT]

［開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20250331.1003.001;2025033112：59：58

[Abstract]; "Objective To investigate the effect of LINC00319 on the biological behavior of papillary thyroid carcinoma cells and its possible mechanism.

Methods The methods of qRTPCR and Western blot were used to measure the expression of LINC00319， miR1853p， and FOXK1 in papillary thyroid carcinoma tissue and cells. Thyroid carcinoma BCPAP cells were transfected with siNC， siLINC00319， miRNC， miR1853p mimics， siNC， siFOXK1， pcDNA+siLINC00319， and pcDNAFOXK1+siLINC00319， respectively， and dual luciferase reporter assay was used to validate the targeting relationship between miR1853p， LINC00319， and FOXK1. MTT assay， plate colony formation assay， flow cytometry， and Transwell assay were used to measure the proliferation， apoptosis， migration， and invasion of BCPAP cells， and Western blot was used to measure the protein expression levels of Cleaved caspase3， matrix metalloproteinase2 （MMP2）， and matrix metalloproteinase9 （MMP9）."ResultsCompared with adjacent tissue and normal human thyroid cells， papillary thyroid carcinoma tissue and cells showed significant increases in the expression of LINC00319 and FOXK1 （t=27.19-39.06，F(xiàn)=96.94-216.25，Plt;0.05） and a significant reduction in the expression of miR1853p （t=21.83，F(xiàn)=216.25，Plt;0.05）. LINC00319 could target miR1853p， and miR1853p could target FOXK1. Compared with the corresponding negative control group， transfection with siLINC00319， miR1853p mimics， or siFOXK1 reduced cell viability， the expression of MMP2 and MMP9， the number of clones formed， and the number of migration and invasion cells （F=121.22-180.59，t=12.48-22.59，Plt;0.05）， while it increased cell apoptosis rate and the expression of Cleaved caspase3 （F=586.51，196.33;t=16.43-21.61;Plt;0.05）. Cotransfection with siLINC00319 and pcDNAFOXK1 could restore the effect of siLINC00319 on the biological behavior of BCPAP cells."Conclusion LINC00319 can promote the malignant behavior of papillary thyroid carcinoma cells by targeting the miR1853p/FOXK1 axis.

乳頭狀甲狀腺癌是頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）可以通過(guò)直接競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合微小RNA（miRNA），參與調(diào)控癌癥進(jìn)展[2]。異常上調(diào)的LINC00319加劇卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[3]。LINC00319還可以促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[4]。然而，LINC00319與乳頭狀甲狀腺癌的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。相關(guān)研究顯示，miR1853p在乳癌組織中的表達(dá)降低，并可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[5]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子1（FOXK1）是FOX家族中的一員，有研究結(jié)果表明，F(xiàn)OXK1在乳頭狀甲狀腺癌中表達(dá)升高，并可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[6]。本研究觀察LINC00319靶向miR1853p/FOXK1對(duì)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞行為的影響，初步探討LINC00319在乳頭狀甲狀腺癌中的作用。

1材料與方法

1.1標(biāo)本及其來(lái)源

收集我院46例乳頭狀甲狀腺癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織（距癌組織邊緣5 cm處正常組織），-80 ℃保存。本研究獲得我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞與試劑

人正常甲狀腺細(xì)胞HTori3（上海弘順生物）；人甲狀腺癌細(xì)胞BCPAP、TPC1和SW1736（美國(guó)ATCC）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶以及MTT試劑（碧云天生物）；LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄與SYBR Green試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher）；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒及報(bào)告基因載體（美國(guó)Promega）；凋亡檢測(cè)試劑盒、Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠（北京索萊寶）；兔抗人FOXK1、Cleavedcaspase3、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、βactin抗體以及二抗HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（美國(guó)Abcam）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組細(xì)胞于含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。應(yīng)用LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑，分別將siNC（siNC組）、siLINC00319（siLINC00319組）、miRNC（miRNC組）、miR1853p mimics（miR1853p組）、siNC（siNC組）、siFOXK1 （siFOXK1組）、pcDNA+siLINC00319（pcDNA+siLINC00319組）以及pcDNAFOXK1+siLINC00319（pcDNAFOXK1+siLINC00319組）轉(zhuǎn)染入BCPAP細(xì)胞，同時(shí)以正常培養(yǎng)的BCPAP細(xì)胞作為NC組。

1.3.2反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR（qRTPCR）方法檢測(cè)LINC00319、miR1853p、FOXK1 mRNA的表達(dá)使用Trizol試劑提取組織和細(xì)胞總RNA。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，應(yīng)用羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。應(yīng)用2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)應(yīng)用LncBase Predicted v.2軟件預(yù)測(cè)LINC00319和miR1853p的結(jié)合位點(diǎn)，Targetscan預(yù)測(cè)miR1853p和FOXK1的結(jié)合位點(diǎn)。將結(jié)合位點(diǎn)和突變位點(diǎn)分別克隆至pGL3質(zhì)粒中，獲得野生型載體WTLINC00319、WTFOXK1以及突變型載體MUTLINC00319、MUTFOXK1。隨后，將構(gòu)建的載體分別與miRNC、miR1853p mimics共轉(zhuǎn)染至BCPAP細(xì)胞，48 h后檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3.43（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴鹽（MTT）實(shí)驗(yàn)將3×103個(gè)BCPAP細(xì)胞加入含有質(zhì)量濃度5 g/L MTT溶液的96孔板中，4 h后加入DMSO孵育5 min，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光度值，評(píng)估細(xì)胞活力。

1.3.5平板克隆形成實(shí)驗(yàn)6孔板中加入BCPAP細(xì)胞（500個(gè)/孔），培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d直至出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞克隆團(tuán)。甲醇固定，結(jié)晶紫染色，拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.3.6流式細(xì)胞術(shù)收集BCPAP細(xì)胞（5×108個(gè)/L），用結(jié)合緩沖液進(jìn)行重懸，然后加入Annexin VFITC和PI避光孵育15 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.7Transwell實(shí)驗(yàn)在預(yù)包被或不包被Matrigel基質(zhì)膠的24孔Transwell板中，將含1×105個(gè)BCPAP細(xì)胞的培養(yǎng)液加入到上室，將600 μL的完全培養(yǎng)液引入下室。48 h后用多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.3.8Western blot方法檢測(cè)FOXK1、Cleavedcaspase3、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)使用RIPA裂解液提取總蛋白，行SDSPAGE電泳，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至膜并室溫封閉2 h。分別加入一抗FOXK1（1∶1 000）、Cleavedcaspase3（1∶800）、MMP2（1∶1 000）、MMP9（1∶1 000）、βactin（1∶3 000）孵育過(guò)夜，加入二抗稀釋液（1∶5 000）溫育2 h。應(yīng)用Quantity One軟件對(duì)各蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料結(jié)果以[AKx-D]±s表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1乳頭狀甲狀腺癌組織LINC00319、miR1853p和FOXK1表達(dá)

與癌旁組織相比較，乳頭狀甲狀腺癌組織中LINC00319表達(dá)上調(diào)（t=39.06，Plt;0.05），miR1853p表達(dá)下調(diào)（t=21.83，Plt;0.05），[STBX]FOXK1 mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)（t=27.19、28.22，Plt;0.05）。見(jiàn)圖1、表1。

2.2甲狀腺癌細(xì)胞中LINC00319、miR1853p以及FOXK1的表達(dá)

與HTori3細(xì)胞相比較，BCPAP、TPC1以及SW1736細(xì)胞中LINC00319、FOXK1高表達(dá)（F=96.94～144.82，Plt;0.05），miR1853p低表達(dá)（F=216.25，Plt;0.05），BCPAP細(xì)胞各指標(biāo)變化較其他細(xì)胞更為明顯。后續(xù)實(shí)驗(yàn)以BCPAP細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)用甲狀腺癌細(xì)胞。見(jiàn)圖2、表2。

2.3LINC00319靶向miR1853p調(diào)控FOXK1的表達(dá)

miR1853p和LINC00319、FOXK1之間的結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖3A、B。雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，上調(diào)miR1853p的表達(dá)可以降低WTLINC00319和WTFOXK1的熒光素酶活性（t=15.23、18.34，Plt;0.05）。與siNC組相比較，下調(diào)LINC00319的表達(dá)可以顯著提高miR1853p的表達(dá)（F=215.42，Plt;0.05），抑制FOXK1蛋白的表達(dá)（F=180.59，Plt;0.05）；與siLINC00319+antimiRNC組相比較，siLINC00319+antimiR1853p組中miR1853p表達(dá)降低（Plt;0.05），而FOXK1表達(dá)升高（Plt;0.05）。見(jiàn)圖3C和表3、4。

2.4低表達(dá)LINC00319對(duì)BCPAP細(xì)胞功能影響

與siNC組比較，siLINC00319組細(xì)胞活力、MMP2和MMP9水平、克隆形成、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低（F=121.22～180.59，Plt;0.05），而凋亡率和Cleavedcaspase3水平顯著升高（F=586.51、196.33，Plt;0.05）。見(jiàn)圖4、表5。

2.5高表達(dá)miR1853p對(duì)BCPAP細(xì)胞功能影響

與miRNC組比較，miR1853p組細(xì)胞活力、MMP2和MMP9水平、克隆形成、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低（t=13.08～18.41，Plt;0.05），凋亡率和Cleavedcaspase3水平顯著升高（t=21.61、16.43，Plt;0.05）。見(jiàn)圖5、表6。

2.6低表達(dá)FOXK1對(duì)BCPAP細(xì)胞功能影響

與siNC組相比較，siFOXK1組細(xì)胞活力、MMP2和MMP9水平、克隆形成、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低（t=12.48～22.59，Plt;0.05），凋亡率和Cleavedcaspase3水平顯著提高（t=21.38、16.40，Plt;0.05）。見(jiàn)圖6、表7。

2.7高表達(dá)FOXK1逆轉(zhuǎn)LINC00319低表達(dá)對(duì)BCPAP細(xì)胞功能的影響

與pcDNA+siLINC00319組相比較，pcDNAFOXK1+siLINC00319組的細(xì)胞活力、MMP2和MMP9水平、克隆形成、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著上升（t=12.90～19.96，Plt;0.05），而凋亡率和Cleavedcaspase3水平顯著降低，差異有顯著意義（t=21.39、14.76，Plt;0.05）。見(jiàn)圖7、表8。

3討論

LINC00319在骨肉瘤組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，敲低其表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移[7]。此外，沉默LINC00319表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[8]。本研究結(jié)果顯示，乳頭狀甲狀腺癌組織和細(xì)胞系中LINC00319表達(dá)升高，干擾LINC00319表達(dá)可有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖。細(xì)胞凋亡與caspase3的活化有關(guān)[9]。本文研究結(jié)果顯示，干擾LINC00319表達(dá)后細(xì)胞凋亡率和Cleavedcaspase3水平顯著升高，提示LINC00319可以抑制乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞凋亡。MMP2和MMP9可以通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)沉積，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移[10]。本文研究結(jié)果還顯示，下調(diào)LINC00319表達(dá)可抑制甲狀腺癌細(xì)胞遷移及侵襲，并伴隨著MMP2、MMP9表達(dá)的減少。以上結(jié)果表明，LINC00319可能在乳頭狀甲狀腺癌中發(fā)揮致癌作用。

FOXK1在乳癌中表達(dá)水平升高，并可促進(jìn)細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[1112]。本研究結(jié)果顯示，LINC00319通過(guò)靶向miR1853p而正向調(diào)控FOXK1。XU等[13]研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR1853p表達(dá)可顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。GAO等[14]研究結(jié)果顯示，miR1853p可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及侵襲。本研究結(jié)果顯示，miR1853p在乳頭狀甲狀腺癌組織中表達(dá)降低，其過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；FOXK1在乳頭狀甲狀腺癌組織中表達(dá)顯著升高，敲低其表達(dá)可抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；上調(diào)FOXK1表達(dá)可部分緩解下調(diào)LINC00319對(duì)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞惡性行為的抑制作用。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)LINC00319通過(guò)miR1853p/FOXK1軸促進(jìn)乳頭狀甲狀腺癌發(fā)展進(jìn)程。

綜上所述，LINC00319通過(guò)調(diào)控miR1853p/FOXK1軸促進(jìn)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。LINC00319可能作為乳頭狀甲狀腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。

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（本文編輯黃建鄉(xiāng)）

［收稿日期］20231117;［修訂日期］20241206

［基金項(xiàng)目］河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（LHGJ20210985）

［第一作者］賀雅靜（1986），女，碩士，主管技師。

［通信作者］張玉文（1970），男，副主任醫(yī)師。 Email：15537059835@163.com。