芳香烴受體在EBV陽性鼻咽癌細胞系中生物學功能

［摘要］目的探討芳香烴受體（AHR）在EB病毒（EBV）陽性鼻咽癌（NPC）細胞系中的作用。方法應用小干擾siAHR敲低EBV陽性NPC細胞系C6661細胞中AHR的表達，采用Western blot技術檢測C6661細胞AHR、上皮間質轉化（EMT）以及自噬相關蛋白的表達，RTqPCR技術檢測細胞中AHR的mRNA表達，CCK8和Transwell分析檢測細胞增殖和遷移能力。結果與轉染陰性對照siRNA細胞（對照組）相比，C6661細胞轉染siAHR組AHR蛋白和mRNA表達均下調，差異有統計學意義（t=4.154、9.490，Plt;0.05）；敲低AHR表達能夠抑制細胞增殖能力（F=14.49、80.99，Plt;0.05），減少細胞遷移數量（t=2.855，Plt;0.05），降低EMT相關蛋白ZEB1、NCadherin表達水平并升高ECadherin的表達水平（t=3.504～4.073，Plt;0.05），上調自噬相關蛋白ATG3、ATG5、ATG7和ATG12的表達（t=2.822～6.743，Plt;0.05）。結論在EBV陽性NPC細胞中，AHR能通過影響EMT相關蛋白表達促進細胞遷移、增強細胞增殖能力，影響細胞自噬相關蛋白的表達，在NPC中發揮促癌作用。

［關鍵詞］受體，芳基烴；皰疹病毒4型，人；鼻咽癌；上皮間質轉化；細胞增殖；自噬［中圖分類號］R373.9

［文獻標志碼］A［文章編號］20965532（2025）01002405" " doi：10.11712/jms.20965532.2025.61.004[HT]

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.r.20250303.0930.001;2025030316：35：41

[Abstract] "Objective To investigate the role of aryl hydrocarbon receptor （AHR） in EpsteinBarr virus （EBV）positive nasopharyngeal carcinoma （NPC） cell lines."Methods Smallinterfering RNAs targeting AHR （siAHR） were used to knock down the expression of AHR in EBVpositive NPC C6661 cells. Western blot was used to measure the expression of AHR， epithelialmesenchymal transition （EMT）related proteins， and autophagyrelated proteins in C6661 cells. The mRNA expression level of AHR was determined by RTqPCR. The abilities of proliferation and migration of the cells were determined using Cell Counting Kit8 and Transwell assay."Results Compared with the control group， C6661 cells transfected with siAHR showed significantly downregulated expression of AHR protein and mRNA （t=4.154，9.490;Plt;0.05）， a significantly inhibited proliferation ability （F=14.49，80.99;Plt;0.05）， a significantly reduced number of migratory cells （t=2.855，Plt;0.05）， significantly decreased expression of EMTrelated zinc finger Ebox binding homeobox 1 and Ncadherin and increased Ecadherin expression （t=3.504-4.073，Plt;0.05）， and significantly upregulated expression of the autophagyrelated proteins ATG3， ATG5， ATG7， and ATG12 （t=2.822-6.743，Plt;0.05）."Conclusion "In EBVpositive NPC cells， AHR can affect the expression of EMTrelated proteins to promote cell migration and proliferation and regulate the expression of autophagyrelated proteins， thereby playing a cancerpromoting role.

鼻咽癌（NPC）起源于鼻咽上皮細胞，是一種具有高度轉移性和侵襲性的惡性腫瘤，其具有獨特的地理分布特點，在中國南方和東南亞高度流行[12]。NPC與EB病毒（EBV）感染有關，并具有局部和遠處轉移的特點[3]。芳香烴受體（AHR）是一種配體激活的轉錄因子，在結構域和功能上相對保守，在各種組織中都有表達，并在體內平衡中發揮多種不同作用[4]。AHR在絕大多數腫瘤中高水平表達并長期活躍，促進腫瘤發生發展[56]；也有研究表明，低劑量的AHR活化與低侵襲性和良好預后有關[7]。因此，AHR對腫瘤具有兩面性，被認為是新的疾病預防和治療靶點。迄今為止， AHR在NPC中的作用及機制尚不清楚。本研究探討AHR在EBV陽性NPC細胞系中的生物學作用，為尋找NPC潛在治療靶點提供實驗依據。

1材料和方法

1.1實驗材料

EBV陽性NPC細胞株C6661由中山大學附屬腫瘤醫院趙磊教授惠贈。所有細胞均在含有體積分數0.10胎牛血清和15 g/L青霉素鏈霉素的DMEM/F12（Gibco，美國）培養液中生長，于標準培養箱（37 ℃，含體積分數0.05的CO2）中培養。抗AHR購自Santa Cruz Biotechnology，抗βactin、抗ATG3、抗ATG5、抗ATG7、抗ATG12均購自CST公司，抗ECadherin、抗NCadherin購自Abcam，抗ZEB1購自proteintech公司，抗兔、抗小鼠二抗購自CST公司，小干擾RNA（siRNA）和對照siRNA購自中國Gene Pharma公司，Lipofectamine 2000試劑（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，德國），Trizol試劑（Ambion，美國），逆轉錄試劑盒（TaKaRa，日本），LightCycler96系統（Roche，瑞士），Cell Counting Kit8（CCK8，中國武漢博斯特生物技術有限公司）。

1.2實驗方法

1.2.1小干擾siAHR轉染將C6661細胞接種在6孔板中，用Lipofectamine 2000試劑行siRNA轉染，按照試劑說明書操作。把轉染陰性對照以及AHR siRNA的細胞分別設置為siNC組、siAHR組。siAHR序列如下：5′GGGAAAGAUGGAUCAAUAC3′，5′GUAUUGAUCCAUCUUCCC3′。

1.2.2實時熒光定量PCR（RTqPCR）檢測干擾效率應用Trizol試劑萃取法從C6661細胞中提取總RNA，用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄合成cDNA，根據說明書操作。在LightCycler96系統中，將cDNA作為模板進行RTqPCR。AHR的相對表達水平通過CT值計算，以βactin為內部參考。PCR引物及其序列見表1。

1.2.3蛋白免疫印跡（Western blot）方法檢測細胞中AHR和相關蛋白的表達用含有體積分數0.10蛋白酶抑制劑和體積分數0.10 PMSF的RIPA裂解緩沖液提取細胞總蛋白。蛋白質與十二烷基硫酸鈉（SDS）緩沖液混合后，在100 ℃下變性5 min，通過SDSPAGE分離，然后轉移到PVDF膜上。將50 g/L脫脂牛奶溶解在Tris緩沖鹽水中，室溫下將膜封閉2 h。根據說明書按比例稀釋相應一抗，將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜。次日，TBST洗滌并消除一抗后，根據說明書比例稀釋抗小鼠IgG或抗兔IgG二抗，在室溫下加入二抗孵育2 h并用TBST洗滌。避光條件下，按照說明書配制顯影液（現用現配），滴加至膜條表面顯影。應用Image J分析內參βactin和目的條帶的灰度值，以目的條帶灰度值/βactin灰度值表示目的蛋白表達。

1.2.4細胞增殖實驗（CCK8實驗）檢測細胞增殖能力應用CCK8試劑檢測細胞增殖能力，按說明書方法操作。將細胞以5×103個/孔的密度接種在96孔板中，分別培養24、48、72和96 h后，每孔加入體積分數0.10 CCK8試劑，1 h后檢測450 nm波長處吸光度，以其表示細胞增殖能力。

1.2.5細胞遷移實驗（Transwell）檢測細胞遷移能力使用8 μm孔Transwell板（Corning，美國）進行檢測。細胞經過48 h siAHR轉染后，用胰蛋白酶消化并重新懸浮在無血清培養基中。將含有4×104個細胞的200 μL無血清細胞懸液混合后加入Transwell板上室，在下室中加入700 μL含有體積分數0.20血清的培養基。在標準培養箱（37 ℃，含體積分數0.05 CO2）中培養24 h，將小室取出并行甲醇固定和結晶紫染色，晾干后顯微鏡下隨機拍照，觀察細胞穿過孔膜的數量。

以上實驗每組均重復3次。

1.3統計學處理

使用Graph Pad Prism 5.0和SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計量資料結果以[AKx-D]±s表示，數據間比較使用獨立樣本t檢驗或雙因素方差分析。以Plt;0.05為差異有顯著性。

2結果

2.1siAHR的干擾效率

Western blot和RTqPCR實驗結果均表明，siAHR組C6661細胞AHR的蛋白和mRNA表達水平均較siNC組降低，差異具有統計學意義（t=4.154、9.490，Plt;0.05）。見圖1、表2。

2.2AHR對EBV陽性NPC細胞增殖能力影響

雙因素方差分析顯示，時間、組別及二者交互作用對NPC細胞增殖能力均有影響（F時間=174.37，Plt;0.001；F組別=36.86，Plt;0.01；F時間*組別=14.23，Plt;0.001）。單因素方差分析顯示，隨培養時間增加，siNC組及siAHR組細胞增殖能力均增加，差異有顯著性（F=247.47、76.49，Plt;0.05）。兩組間比較，培養72、96 h時siAHR組細胞增殖能力低于siNC組（F=14.49、80.99，Plt;0.05）。見表3。

2.3AHR對EBV陽性NPC細胞遷移能力影響

Transwell實驗顯示，C6661細胞中敲低AHR的表達，能夠減少細胞遷移的數量（圖2），siNC組和siAHR組的遷移細胞數量分別為4 194.00±1 048.84、1 796.30±1 007.70，差異具有統計學意義（t=2.855，Plt;0.05）。

2.4AHR對EBV陽性NPC細胞中上皮間質轉化（EMT）相關蛋白表達影響

Western blot檢測顯示，敲低AHR能夠下調C6661細胞中EMT相關蛋白ZEB1和NCadherin蛋白表達，上調ECadherin表達，差異有統計學意義（t=3.504～4.073，Plt;0.05）。見圖3、表4。

2.5AHR對EBV陽性NPC細胞中自噬相關蛋白表達影響

Western blot檢測結果顯示，干擾AHR表達后C6661細胞（siAHR組）自噬相關蛋白ATG3、ATG5、ATG7和ATG12的表達均較siNC組下調，差異有統計學意義（t=2.822～6.743，Plt;0.05）。見圖4、表5。

3討論

NPC是一種起源于鼻咽黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，有著顯著地理分布特點。NPC的腫瘤微環境具有復雜且高度異質性特點，其病因與多種因素密切相關，包括EBV感染、宿主遺傳和環境暴露等[8]。EBV在NPC的發生和發展中起著關鍵作用，幾乎每個NPC細胞中都能檢測到EBV[9]。EBV主要以潛伏感染的形式存在，編碼多種潛伏膜蛋白，如潛伏膜蛋白2A、潛伏膜蛋白1、核抗原EBNA1等[10]，這些編碼蛋白可以不同程度調控多種宿主細胞蛋白表達，進而促進NPC的發生發展[1112]。

AHR是bHLH/PAS家族的成員，已被確定為多種環境污染物的受體，人類每天都暴露于AHR配體中[13]，配體激活的AHR信號通路在腫瘤的發生發展中起著重要作用。在絕大多數腫瘤中，AHR信號通路的激活可以通過不同途徑促進腫瘤的進展，如肺癌、肝癌、乳腺癌和皮膚癌等[1417]；但是某些AHR激活劑或者低劑量的AHR表現出抗腫瘤活性[1819]。AHR在NPC發生發展中的作用尚不明確。本研究旨在探討AHR對EBV陽性NPC細胞增殖能力、遷移和自噬相關蛋白表達的影響，初步確定AHR在EBV陽性NPC細胞中的生物學功能。

AHR是一種與細胞EMT過程相關的調節因子，與腫瘤轉移密切相關[20]。有研究表明，AHR缺陷細胞能夠抑制免疫缺陷小鼠皮下腫瘤的形成，在細胞培養過程中也表現出較低的遷移特性[21]；2，3，7，8四氯二苯并對二[XCzz5.tif;%90%98]英（TCDD）激活AHR信號通路后，胃癌細胞的侵襲力和乳腺癌細胞的增殖能力增強[2223]；而AHR激活劑3甲基膽蒽可刺激人臍血管內皮細胞抑制細胞遷移，表明AHR在不同的腫瘤中有不同的遷移作用。本文研究Transwell和Western blot檢測結果顯示，NPC細胞中AHR低表達降低C6661細胞的遷移數量，同時影響了EMT相關蛋白的表達，表現為ZEB1和NCadherin蛋白表達下調，ECadherin蛋白表達上調。本文結果表明，在EBV陽性NPC細胞中，AHR能夠通過影響EMT相關蛋白的表達影響細胞遷移，進而促進腫瘤轉移。

成纖維細胞生長因子9、血管內皮生長因子等作為絲裂原高表達可能促進腫瘤細胞的增殖[2426]，其表達均表現出一定程度的AHR依賴性，AHR在絕大多數腫瘤中有促進細胞增殖的作用[2729]。本文CCK8實驗顯示，敲低C6661細胞中AHR表達能夠明顯抑制細胞增殖能力，表明AHR在EBV陽性NPC細胞中的作用與在其他腫瘤中一致，能夠促進腫瘤細胞增殖。

本文研究結果還顯示，敲低EBV陽性NPC細胞中AHR表達，可顯著降低自噬相關蛋白ATG3、ATG5、ATG7和ATG12的表達水平，表明AHR可能影響NPC細胞的自噬能力。腫瘤微環境中自噬水平提高有助于腫瘤細胞吸收更多能量，在一定程度上促進腫瘤進展[30]。自噬的增強也可以增加腫瘤細胞活力和遷移能力[31]。本文研究結果表明，AHR影響EBV陽性NPC細胞中自噬相關蛋白表達，但是否增強細胞的自噬能力還需要進一步研究。

綜上所述，AHR可增強EBV陽性NPC細胞增殖、遷移能力，影響EMT和自噬相關蛋白表達。AHR可能是EBV陽性NPC的一個潛在治療靶點，但EBV如何通過調控AHR進而影響腫瘤發生發展的機制還需要進一步研究。

［參考文獻］

[1]PNG Y T， YANG A Z Y， LEE M Y， et al. The role of NK cells in EBV infection and EBVassociated NPC[J]. Viruses， 2021，13（2）：300.

[2]JIANG J Y， YING H M. Revealing the crosstalk between nasopharyngeal carcinoma and immune cells in the tumor microenvironment[J]. Journal of Experimental amp; Clinical Cancer Research： CR， 2022，41（1）：244.

[3]LO K W， TO K F， HUANG D P. Focus on nasopharyngeal carcinoma[J]. Cancer Cell， 2004，5（5）：423428.

[4]TIAN J J， FENG Y， FU H L， et al. The aryl hydrocarbon receptor： a key bridging molecule of external and internal chemical signals[J]. Environmental Science amp; Technology， 2015，49（16）：95189531.

[5]GRAMATZKI D， PANTAZIS G， SCHITTENHELM J， et al. Aryl hydrocarbon receptor inhibition downregulates the TGFbeta/Smad pathway in human glioblastoma cells[J]. Oncogene， 2009，28（28）：25932605.

[6]DINATALE B C， SCHROEDER J C， PERDEW G H. Ah receptor antagonism inhibits constitutive and cytokine inducible IL6 production in head and neck tumor cell lines[J]. Molecular Carcinogenesis， 2011，50（3）：173183.

[7]SAITO R， MIKI Y， HATA S， et al. Aryl hydrocarbon receptor in breast cancer—a newly defined prognostic marker[J]. Hormones amp; Cancer， 2014，5（1）：1121.

[8]CHEN Y P， CHAN A T C， LE Q T， et al. Nasopharyngeal carcinoma[J]. Lancet， 2019，394（10192）：6480.

[9]TSAO S W， TSANG C M， LO K W. EpsteinBarr virus infection and nasopharyngeal carcinoma[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B， Biological Sciences， 2017，372（1732）：20160270.

[10]No authors listed. Epsteinbarr virus and Kaposi’s sarcomaherpesvirus/human herpesvirus 8[J]. IARC Monographs onthe Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans， 1997，70：1492.

[11]DAWSON C W， PORT R J， YOUNG L S. The role of the EBVencoded latent membrane proteins LMP1 and LMP2 in the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma （NPC）[J]. Seminars in Cancer Biology， 2012，22（2）：144153.

[12]FRAPPIER L. Role of EBNA1 in NPC tumourigenesis[J]. Seminars in Cancer Biology， 2012，22（2）：154161.

[13]IKUTA T， TACHIBANA T， WATANABE J， et al. Nucleocytoplasmic shuttling of the aryl hydrocarbon receptor[J]. Journal of Biochemistry， 2000，127（3）：503509.

[14]VOGELEY C， ESSER C， TTING T， et al. Role of the aryl hydrocarbon receptor in environmentally induced skin aging and skin carcinogenesis[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2019，20（23）：6005.

[15]SHIVANNA B， CHU C， MOORTHY B. The aryl hydrocarbon receptor （AHR）： a novel therapeutic target for pulmonary diseases[J]？ International Journal of Molecular Sciences， 2022，23（3）：1516.

[16]CARAMBIA A， SCHURAN F A. The aryl hydrocarbon receptor in liver inflammation[J]. Seminars in Immunopathology， 2021，43（4）：563575.

[17]SWEENEY C， LAZENNEC G， VOGEL C F A. Environmental exposure and the role of AhR in the tumor microenvironment of breast cancer[J]. Frontiers in Pharmacology， 2022，13：1095289.

[18]ZHANG S， LEI P， LIU X Y， et al. The aryl hydrocarbon receptor as a target for estrogen receptornegative breast cancer chemotherapy[J]. EndocrineRelated Cancer， 2009，16（3）：835844.

[19]ZHANG S， KIM K， JIN U H， et al. Aryl hydrocarbon receptor agonists induce microRNA335 expression and inhibit lung metastasis of estrogen receptor negative breast cancer cells[J]. Molecular Cancer Therapeutics， 2012，11（1）：108118.

[20]BAROUKI R， COUMOUL X. Cell migration and metastasis markers as targets of environmental pollutants and the Aryl hydrocarbon receptor[J]. Cell Adhesion amp; Migration， 2010，4（1）：7276.

[21]MULERONAVARRO S， POZOGUISADO E， PREZMANCERA P A， et al. Immortalized mouse mammary fibroblasts lacking dioxin receptor have impaired tumorigenicity in a subcutaneous mouse xenograft model[J]. The Journal of Biological Chemistry， 2005，280（31）：2873128741.

[22]PENG T L， CHEN J， MAO W， et al. Aryl hydrocarbon receptor pathway activation enhances gastric cancer cell invasiveness likely through a cJundependent induction of matrix metalloproteinase9[J]. BMC Cell Biology， 2009，10：27.

[23]SEIFERT A， RAU S， KLLERTZ G， et al. TCDD induces cell migration via NFATc1/ATXsignaling in MCF7 cells[J]. Toxicology Letters， 2009，184（1）：2632.

[24]SHIGEISHI H， HIGASHIKAWA K， HIRAOKA M， et al. Expression of epiregulin， a novel epidermal growth factor ligand associated with prognosis in human oral squamous cell carcinomas[J]. Oncology Reports， 2008，19（6）：15571564.

[25]RIESE D J 2nd， CULLUM R L. Epiregulin： roles in normal physiology and cancer[J]. Seminars in Cell amp; Developmental Biology， 2014，28：4956.

[26]ZHU Z， KLEEFF J， FRIESS H， et al. Epiregulin is Upregulated in pancreatic cancer and stimulates pancreatic cancer cell growth[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2000，273（3）：10191024.

[27]CHUANG C Y， CHANG H， LIN P P， et al. Upregulation of osteopontin expression by aryl hydrocarbon receptor via both liganddependent and ligandindependent pathways in lung cancer[J]. Gene， 2012，492（1）：262269.

[28]PATEL R D， KIM D J， PETERS J M， et al. The aryl hydrocarbon receptor directly regulates expression of the potent mitogen epiregulin[J]. Toxicological Sciences： an Official Journal of the Society of Toxicology， 2006，89（1）：7582.

[29]WANG C K， CHANG H， CHEN P H， et al. Aryl hydrocarbon receptor activation and overexpression upregulated fibroblast growth factor9 in human lung adenocarcinomas[J]. International Journal of Cancer， 2009，125（4）：807815.

[30]KATHEDER N S， KHEZRI R， O'FARRELL F， et al. Microenvironmental autophagy promotes tumour growth[J]. Nature， 2017，541（7637）：417420.

[31]PENG J J， ZHENG H， LIU F， et al. The m6A methyltransferase METTL3 affects autophagy and progression of nasopharyngeal carcinoma by regulating the stability of lncRNA ZFAS1[J]. Infectious Agents and Cancer， 2022，17（1）：1.

（本文編輯黃建鄉）

［收稿日期］20221123;［修訂日期］20230217

［基金項目］青島大學附屬醫院臨床醫學+X項目（QDFY+X202101023）

［第一作者］呂夢文（2001），女，碩士研究生。

［通信作者］劉術臻（1977），男，博士，教授，碩士生導師。Email：qyfylsz@qdu.edu.cn。