基于生物信息學分析和構建乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡

摘要：目的" 構建乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡。方法" 從GEO數(shù)據(jù)庫下載乳腺癌腦轉(zhuǎn)移相關的miRNA和mRNA表達數(shù)據(jù)集，通過GEO2R對數(shù)據(jù)集進行差異分析。使用miRWalk、TargetScan和miRDB工具預測差異表達miRNAs的下游靶mRNAs，并與差異表達mRNAs進行交叉匹配，同時進行GO和KEGG功能富集分析。利用String數(shù)據(jù)庫構建交叉mRNAs的PPI網(wǎng)絡圖并篩選關鍵靶mRNAs。通過FunRich軟件預測靶mRNAs的轉(zhuǎn)錄因子（TFs），并利用Cytoscape 軟件構建乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中相關的miRNA-TF-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡。結果" 共篩選出差異表達的miRNAs 54個，全為上調(diào)miRNAs。預測的下游靶mRNAs與差異表達mRNAs取交集共篩選出41個候選靶mRNAs。GO分析顯示其生物過程主要參與基因表達的正調(diào)控等，分子功能主要參與涉及調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子的活性；KEGG通路分析顯示主要集中在癌癥相關的Ras信號通路。String數(shù)據(jù)庫構建候選靶mRNAs的PPI網(wǎng)絡圖，篩選出包括SUMO1、DAXX、UBA2、RBX1等在內(nèi)的23個關鍵mRNAs。FunRich軟件預測獲得10個調(diào)控關鍵mRNAs的TFs，包括SMAD1、HOXA3、FOXO1等。利用Cytoscape軟件構建miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡，得到3個miRNAs節(jié)點、10個TFs節(jié)點、23個候選靶mRNAs節(jié)點。結論" miR-532-3p、miR-1224-5p、miR-877-5p和SMAD1、HOXA3、FOXO1等TFs、以及SUMO1、DAXX、UBA2等關鍵靶mRNAs可能在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展過程中構成重要的miRNA-TF-mRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡。

關鍵詞：乳腺癌腦轉(zhuǎn)移；微小RNAs；生物信息學；miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡

中圖分類號：R730.1" " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " nbsp; " " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2025.06.002

文章編號：1006-1959（2025）06-0009-06

Based on Bioinformatics Analysis and Construction of miRNA-TF-mRNA Regulatory

Network in Breast Cancer Brain Metastasis

PAN Xin1， LIU Zhihan2， LIU Xilin3

（1.Department of Medicine， Medical College of Jinzhou Medical University， Jinzhou 121000， Liaoning， China;

2.Department of Medical Technology， Medical college of Jinzhou Medical University， Jinzhou 121000， Liaoning， China;

3.Department of Nursing， Hebei Oriental University， Langfang 065000， Hebei， China）

Abstract： Objective" To construct a miRNA-TF-mRNA regulatory network in brain metastasis of breast cancer. Methods" The miRNA and mRNA expression data sets related to brain metastasis of breast cancer were downloaded from GEO database， and the data sets were analyzed by GEO2R. The downstream target mRNAs of differentially expressed miRNAs were predicted by miRWalk， TargetScan and miRDB tools， and cross-matched with differentially expressed mRNAs， and GO and KEGG functional enrichment analysis were performed. The PPI network diagram of cross mRNAs was constructed by String database， and the key target mRNAs were screened. The transcription factors （TFs） of target mRNAs were predicted by FunRich software， and the miRNA-TF-mRNA regulatory network related to brain metastasis of breast cancer was constructed by Cytoscape software. Results" A total of 54 differentially expressed miRNAs were screened， all of which were up-regulated miRNAs. A total of 41 candidate target mRNAs were screened from the intersection of predicted downstream target mRNAs and differentially expressed mRNAs. GO analysis showed that its biological process was mainly involved in the positive regulation of gene expression， and its molecular function was mainly involved in the regulation of RNA polymerase Ⅱ transcription factor activity. KEGG pathway analysis showed that it mainly focused on cancer-related Ras signaling pathways. The PPI network of candidate target mRNAs was constructed by String database， and 23 key mRNAs including SUMO1， DAXX， UBA2 and RBX1 were screened out. FunRich software predicted 10 TFs that regulate key mRNAs， including SMAD1， HOXA3， FOXO1， etc. The miRNA-TF-mRNA regulatory network was constructed by Cytoscape software， and 3 miRNAs nodes， 10 TFs nodes and 23 candidate target mRNAs nodes were obtained. Conclusion" miR-532-3p， miR-1224-5p， miR-877-5p， SMAD1， HOXA3， FOXO1 and other TFs， as well as SUMO1， DAXX， UBA2 and other key target mRNAs may constitute an important miRNA-TF-mRNA regulatory network in the development of brain metastasis of breast cancer.

Key words： Brain metastasis of breast cancer; microRNAs; Bioinformatics; miRNA-TF-mRNA regulatory network

乳腺癌（breast cancer， BC）是全球女性中最常見的惡性腫瘤之一，也是導致高死亡率的癌癥之一[1]。2021年全球乳腺癌新發(fā)病例高達217萬例，超過肺癌的203萬例，成為全球第一大惡性腫瘤[2]。在過去十幾年中，由于影像學技術的早期診斷以及原發(fā)性乳腺癌治療的發(fā)展，不同器官的遠端轉(zhuǎn)移如肺、腦、骨和肝等是乳腺癌治療面臨的最大挑戰(zhàn)之一[3]。其中，由于血腦屏障的存在，乳腺癌腦轉(zhuǎn)移（breast cancer brain metastasis， BCBM）的發(fā)病率顯著提高[4]，一旦發(fā)作，病情進展迅速，且伴有嚴重的認知障礙，患者的生活質(zhì)量和生存時間受到嚴重影響，病死率極高[5，6]。一般認為乳腺癌腦轉(zhuǎn)移發(fā)作則意味著腫瘤終末期，但近年來，更多無癥狀的乳腺癌腦轉(zhuǎn)移被檢出，且大多乳腺癌患者確診時即發(fā)現(xiàn)已有腦轉(zhuǎn)移，這對臨床診治提出了新的要求。目前手術切除和化療等系統(tǒng)治療手段由于血腦屏障的存在作用效果甚微[7]。因此，研究乳腺癌腦轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展的分子機制，以此為基礎制定有針對性的治療策略將造福眾多乳腺癌腦轉(zhuǎn)移患者。miRNAs是一類由21～25個核苷酸組成的高度保守的非編碼RNA，通過堿基互補配對原則與mRNA的3' 端非編碼區(qū)（3' untranslated region， 3' UTR）特異性結合[8]，抑制其翻譯或促進其降解從而調(diào)控基因表達，參與細胞的增殖、遷移、凋亡、免疫反應等生物學過程[9]。轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors， TFs）作為重要的生物學角色之一，在肺腺癌[10]、口腔癌[11]、乳腺癌[12]等多種疾病的病理生理過程中起著至關重要的作用。但是目前對于miRNAs和TFs在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移發(fā)生中的分子機制缺乏了解。因此，探索乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中miRNAs、TFs和mRNA的調(diào)控機制非常重要，有助于發(fā)掘診斷和治療乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的潛在生物標志物。

1資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源" 從GEO數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載乳腺癌腦轉(zhuǎn)移相關數(shù)據(jù)集。其中，GSE134108包含46個腦轉(zhuǎn)移癌組織和25個原位癌組織中的miRNAs表達譜；GSE191230包含5個腦轉(zhuǎn)移癌組織和13個原位癌組織中的mRNA表達譜。利用GEO2R對miRNA和mRNA表達譜進行差異分析，以P＜0.05作為篩選標準。

1.2 miRNAs下游靶mRNAs的預測" 利用miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）[13]、TargetScan（https：//www.targetscan.org/vert_80/）[14]和miRDB（http：//mirdb.org/cgi-bin/custom.cgi）[15]軟件預測miRNA-mRNA之間可能的靶向關系，選取在3個數(shù)據(jù)庫都預測到的視為miRNAs下游靶mRNAs。

1.3候選靶mRNAs的功能分析" 選用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）[16]數(shù)據(jù)庫在線分析篩選出的靶mRNAs，對其進行GO功能富集分析，包括細胞組分和定位（cellular component， CC）、生物過程（biological process， BP）以及分子功能（molecular function， MF）；同時進行KEGG信號通路富集分析。富集標準為P＜0.05。

1.4候選靶mRNAs的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡分析" 使用String（https：//string-db.org/）[17]數(shù)據(jù)庫預測靶mRNAs的蛋白互作（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡圖，并利用Cytoscape[18]軟件進行可視化展示。

1.5候選靶mRNAs上游TFs的預測" 利用FunRich軟件[19]預測靶mRNAs的TFs，按照差異倍數(shù)（fold change， FC）進行排序選取P＜0.05的排名前10位TFs進行展示。

1.6 miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡的構建" 將得到miRNA-靶mRNA和TF-mRNA的靶向關系導入Cytoscape軟件中，基于Degree 值（度）進行miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡的可視化分析。

2結果

2.1篩選乳腺癌腦轉(zhuǎn)移組織中差異表達miRNAs和mRNAs" 經(jīng)過GEO2R的分析，根據(jù)P＜0.05的標準分別從GSE134108和GSE191230數(shù)據(jù)集中篩選出差異表達miRNAs和mRNAs，并繪制火山圖。其中差異表達miRNAs 54個，都為上調(diào)miRNAs（圖1A）；差異表達mRNAs 3935個，上調(diào)mRNAs 2434個，下調(diào)mRNAs 1501個（圖1B）。

2.2預測差異表達miRNAs與下游mRNAs的靶向關系" 利用miRWalk、TargetScan和miRDB軟件預測差異表達miRNAs的下游靶mRNA，共獲得129個靶mRNAs。與差異表達mRNAs取交集后，共獲得41個候選靶mRNAs（圖2），與差異表達miRNAs相對應后，得到67對miRNA-mRNA。

2.3候選靶mRNAs的GO和KEGG富集分析" 將41個候選靶mRNAs導入在線分析軟件DAVID進行GO和KEGG富集分析，結果見圖3。GO富集分析顯示：細胞成分注釋方面，候選靶mRNAs最常見的細胞定位為細胞核，其次是胞質(zhì)溶膠、染色質(zhì)等；生物過程注釋方面，候選靶mRNAs主要參與基因表達的正調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的負調(diào)控、細胞成分運動的調(diào)控、內(nèi)皮細胞的增殖等；分子功能注釋方面，候選靶mRNAs主要參與調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子和泛素結合酶的活性。KEGG富集結果顯示：候選靶mRNAs主要集中在癌癥相關的Ras信號通路。

2.4候選靶mRNAs的蛋白互作網(wǎng)絡（PPI）分析" 通過String數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件構建41個候選靶mRNAs的PPI網(wǎng)絡（圖4），去除游離的靶mRNAs，共有23個靶mRNAs之間有相互作用關系，包括SUMO1、DAXX、UBA2、RBX1等。其中，節(jié)點越大、顏色越深代表Degree值越大，靶mRNAs的互作關系也越大。

2.5預測候選靶mRNAs與上游TFs的靶向關系" 基于FunRich軟件預測候選靶mRNAs的TFs，以P＜0.05和FC＞1為篩選標準，選取FC值排位前10的TFs用作后續(xù)研究（表1），分別為SMAD1、HOXA3、FOXO1、BARX2、FOXJ2、MAFB、PRRX2、PAX6、PPARA、IRF1。

2.6構建乳腺癌腦轉(zhuǎn)移相關miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡" 利用Cytoscape軟件構建乳腺癌腦轉(zhuǎn)移相關miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡（圖5），由3個miRNAs節(jié)點（miR-532-3p、miR-1224-5p、miR-877-5p）、10個TFs節(jié)點（SMAD1、HOXA3、FOXO1等）、23個候選靶mRNAs（SUMO1、DAXX、UBA2等）節(jié)點組成，顯示了miRNAs在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中可能的作用機制。

3討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，隨著醫(yī)學影像技術的迅速發(fā)展，乳腺癌的早期診斷率逐漸提高，但仍有約2.7%的患者初診時即發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[3]。且隨著治療方式的多樣性，患者生存時間延長，乳腺癌腦轉(zhuǎn)移發(fā)病率逐年升高[4]。乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的治療是姑息性治療，包括手術、放療、化療等，但治療效果不佳[7]。因此，深入探討乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)病機制，尋找新的特異性靶點，實現(xiàn)早期診斷和治療尤為重要。越來越多的研究表明，miRNA作為生物體內(nèi)重要的一類基因表達調(diào)控因子，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，有研究發(fā)現(xiàn)[20]，miR-199通過靶向RGS17可抑制肺癌的增殖和侵襲等過程，但在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中尚沒有報道完整的miRNA調(diào)控機制，因此深入研究miRNA在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機制具有重要意義。

本研究通過對GSE134108和GSE191230數(shù)據(jù)集進行差異表達分析，共篩選出54個差異表達miRNAs和3935個差異表達mRNAs。猜測這些miRNAs和mRNAs可能在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定的作用。為了進一步研究miRNAs的分子機制，本研究預測差異表達miRNAs的下游靶mRNAs，并與差異表達mRNAs相適應，獲得41個交集靶mRNAs。對其進行GO和KEGG功能富集分析，結果顯示mRNAs多定位為細胞核中，參與基因表達調(diào)控和內(nèi)皮細胞增殖等生物過程，還涉及調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子和泛素結合酶的活性，且集中在癌癥相關的Ras信號通路中。進一步分析靶mRNAs的蛋白互作關系，共篩選出包括SUMO1、DAXX、UBA2、RBX1等在內(nèi)的23個關鍵基因。研究發(fā)現(xiàn)，SUMO1和UBA2在乳腺癌中可抑制細胞增殖和遷移[21，22]，DAXX與RBX1也可抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展[23，24]。因此可以推測這些關鍵基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

已有研究表明，TFs可調(diào)控mRNA的表達，且在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)病過程中具有重要意義。本研究預測了關鍵基因的TFs，選取差異倍數(shù)前10位的TFs，分別為SMAD1、HOXA3、FOXO1、BARX2、FOXJ2、MAFB、PRRX2、PAX6、PPARA、IRF1，其中SMAD1排位最靠前。有研究報道，SMAD1可以轉(zhuǎn)錄因子的方式通過靶向Runx2調(diào)控乳腺癌骨轉(zhuǎn)移過程[25]，同時還可以在miR-145的調(diào)控下抑制子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的增殖和凋亡[26]，因此研究TFs對mRNAs的調(diào)控作用對研究疾病的發(fā)生提供理論依據(jù)。本研究利用Cytoscape軟件將得到的差異表達miRNAs、TFs和mRNAs繪制成調(diào)控網(wǎng)絡圖，其中包含了3個miRNAs（miR-532-3p、miR-1224-5p、miR-877-5p）、10個TFs（SMAD1、HOXA3、FOXO1等）、23個靶mRNAs（SUMO1、DAXX、UBA2等），提示此miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡可能在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，后續(xù)可通過實驗確定具體的miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡，為研究乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展奠定基礎。

綜上所述，本研究利用生物信息學的方法篩選出乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中相關的miRNAs、TFs和mRNAs，確定了乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中miRNA-TFs-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡，這些調(diào)控網(wǎng)絡可能在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)著重要的位置，為進一步挖掘乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的分子機制、尋找潛在的miRNAs診斷標志物提供一定的研究依據(jù)。

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收稿日期：2024-01-31；修回日期：2024-02-22

編輯/成森