熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應用于GⅠ型和GⅡ型諾如病毒的檢測效能

摘要：目的" 探究熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）對GⅠ型、GⅡ型諾如病毒（NV）的檢測效能。方法" 以2020年12月-2023年12月南昌市灣里管理局疾病預防控制中心收治的50例疑似NV感染患者為研究對象，采集其糞便樣本，依次應用常規RT-PCR與熒光定量RT-PCR檢測方式進行檢驗，比較兩種檢驗方式的陽性檢出率及檢測效能（檢測準確性、敏感度、特異度）。結果" 熒光定量RT-PCR對GⅠ型、GⅡ型諾如病毒的陽性檢出率高于常規RT-PCR檢測（P＜0.05）。熒光定量RT-PCR對GⅠ型、GⅡ型諾如病毒的檢測準確性、敏感度、特異度高于常規RT-PCR檢測（P＜0.05）。結論" 熒光定量RT-PCR在GⅠ型、GⅡ型諾如病毒診斷中具有較高檢測效能。

關鍵詞：諾如病毒；熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應；GⅠ型；GⅡ型；檢測效能

中圖分類號：R445.1" " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2025.06.022

文章編號：1006-1959（2025）06-0127-04

Detection Efficiency of Fluorescence Quantitative Reverse Transcription

Polymerase Chain Reaction for GⅠ and GⅡ Norovirus

XIAO Chaoguang

（Inspection Unit， Nanchang Wanli Administration Center for Disease Control and Prevention， Nanchang 330004， Jiangxi， China）

Abstract： Objective" To explore the detection efficiency of fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） for GⅠ and GⅡ norovirus （NV）. Methods" From December 2020 to December 2023， 50 patients with suspected NV infection admitted to the Nanchang Wanli Administration Center for Disease Control and Prevention from December 2020 to December 2023 were selected as the research objects. Their fecal samples were collected and tested by conventional RT-PCR and fluorescence quantitative RT-PCR in turn. The positive detection rate and detection efficiency （detection accuracy， sensitivity， specificity） of the two test methods were compared. Results" The positive detection rate of GⅠ and GⅡ norovirus by fluorescence quantitative RT-PCR was higher than that by conventional RT-PCR （Plt;0.05）. The detection accuracy， sensitivity and specificity of GⅠ and GⅡ norovirus by fluorescence quantitative RT-PCR were higher than those by conventional RT-PCR （Plt;0.05）. Conclusion" Fluorescence quantitative RT-PCR has a high detection efficiency in the diagnosis of GⅠ and GⅡ norovirus.

Key words： Norovirus; Fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction; GⅠ type; GⅡ type; Detection efficiency

諾如病毒（Norovirus， NV）是引發急性胃腸炎的主要病原體之一，以GⅠ型、GⅡ型最為常見，其傳播途徑廣、感染劑量低、病毒變異快，易引發諾如病毒感染聚集性疫情，對我國公共衛生安全構成了一定威脅，病毒的準確檢驗及快速管控是降低其傳播風險的重要前提[1，2]。近年來，隨著諾如病毒全基因及部分序列的逐步測定，分子生物學技術被廣泛應用于該病毒的檢驗及臨床研究中，其中，反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR）為當前常用病毒檢測方式，該技術可通過RNA提取、反轉錄及PCR擴增等過程，獲取目的基因序列及其表達水平[3，4]。在此基礎上，熒光定量RT-PCR可將熒光基團加入其PCR擴增反應體系中，利用其熒光信號的實時表達，實現病毒RNA的定量檢測[5，6]。為了進一步探究熒光定量RT-PCR在NV檢測中的應用價值，本研究結合2020年12月-2023年12月南昌市灣里管理局疾病預防控制中心收治的50例疑似NV感染患者，分析熒光定量RT-PCR對GⅠ型、GⅡ型NV的檢測效能，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料" 以2020年12月-2023年12月南昌市灣里管理局疾病預防控制中心收治的50例疑似NV感染患者為研究對象，男29例，女21例，年齡18～68歲，平均年齡（33.84±7.65）歲，以上受檢者均以惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等消化道癥狀為主訴就診，所有研究對象均知情且自愿參與本次研究。

1.2納入和排除標準" 納入標準：①經臨床初步診斷為疑似NV感染；②可按要求采集糞便樣本；③取樣前未服用抗病毒藥物。排除標準：①合并其他消化道疾病者；②伴全身感染者；③遺傳代謝疾病史者；④糞便樣本采集不合格者。

1.3方法

1.3.1 RNA提取" 采用西安天隆CqEx-DNA/RNA病毒（CDC）核酸提取試劑盒對糞便樣本進行處理，按試劑盒說明書提取RNA，隨后取50 μl DEPC水溶液用于RNA沉淀的溶解，靜置2 min后，離心處理（4000 r/min，20 min），隨后取上清液分為兩份，開始以下檢測。

1.3.2常規RT-PCR" 取逆轉錄試劑盒（上海伯杰醫療科技股份有限公司）進行逆轉錄操作，其過程嚴格按說明書進行，PCR反應體系共25 μl，包括2.5 μl 反應緩沖液（10×PCR Buffer）、0.5 U 耐熱 DNA 聚合酶（Taq 酶）、3 μl脫氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、3 μl互補脫氧核糖核酸（cDNA）與2.5 μl引物混合物，剩余取滅菌蒸餾水補足。反應條件：94 ℃預變性處理3 min→94 ℃變性處理30 s→54 ℃退火處理30 s→72 ℃延伸30 s，共40個循環。

1.3.3熒光定量RT-PCR" 逆轉錄步驟同上，PCR反應體系為20 μl，包括10 μl 2×Premix Ex Taq、0.4 μl 50×ROX Reference Dye Ⅱ、2 μl cDNA、3.2 μl引物混合物、0.8 μl探針，剩余取滅菌蒸餾水補足。反應條件：50 ℃處理2 min→95 ℃預變性處理30 s→95 ℃變性處理5 s→60 ℃退火處理34 s，共40個循環，于60 ℃條件下收集其熒光信號，獲取CT值，繪制相應標準曲線。

1.4觀察指標" ①比較兩種檢驗方式的陽性檢出率；②以最終診斷結果為金標準，比較兩種檢驗方式的檢測效能，包括診斷準確性、敏感度與特異度。診斷準確性=（真陽性+真陰性）/總例數×100%；敏感度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%；特異度=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%。

1.5統計學方法nbsp; 采用SPSS 24.0軟件進行數據處理，計量資料以（x±s）表示，組間行t檢驗對比，計數資料以[n（%）]表示，組間行χ2檢驗分析，P＜0.05表明差異有統計學意義。

2結果

2.1兩種檢驗方式的陽性檢出率比較" 熒光定量RT-PCR對GⅠ型、GⅡ型諾如病毒的陽性檢出率高于常規RT-PCR檢測（χ2=4.105，P=0.043），見表1。

2.2兩種檢驗方式的檢測效能比較" 熒光定量RT-PCR對GⅠ型、GⅡ型諾如病毒的檢測準確性、敏感度、特異度高于常規RT-PCR檢測（P＜0.05），見表2、表3。

3討論

諾如病毒是人類杯狀病毒科諾如病毒屬的原型代表株，為單股正鏈RNA病毒，具有較高的傳染性及傳播能力，易引起非細菌性腹瀉爆發，導致公共衛生安全問題，在此背景下，尋求特異、靈敏、快速的檢測方法對諾如病毒感染的防控具有重要意義[7，8]。目前，病原學檢查為諾如病毒診斷金標準，現以RT-PCR等分子生物學檢測方法最為常見，其中，常規RT-PCR檢測技術可充分利用RNA逆轉錄與聚合酶鏈式反應等步驟，完成特定RNA序列的復制與擴增，實現病毒的定性、定量檢驗[9，10]。常規RT-PCR檢測方案成本較低、應用廣泛，但其操作繁瑣、敏感性中等，存在一定污染風險及非特異性擴增問題，應用局限性明顯[11，12]。熒光定量RT-PCR則是基于RT-PCR檢測體系制定的精確化分析手段，可利用熒光基團的加入，憑借其熒光信號的累積情況，反映PCR擴增體系中循環擴增產物的變化，以此實現PCR進程的實時監測，完成目標分子的定量檢測[13，14]。近年來，該技術已日益成熟，其操作簡單、敏感性高，可增加定量檢測的精確性，在基因表達分析及病毒載量檢測中具有較高應用價值[15，16]。

本研究結果顯示，熒光定量RT-PCR對GⅠ型、GⅡ型諾如病毒的陽性檢出率高于常規RT-PCR檢測（P＜0.05），提示熒光定量RT-PCR在GⅠ型、GⅡ型諾如病毒的篩查中具有更高檢測價值。分析認為，常規RT-PCR檢測為非特異性測定方式，僅可反映病毒核酸的總載量，無法實現擴增反應的實時檢測，存在定量不準確等問題，易引發漏檢、誤檢等情況[17]。相較之下，熒光定量PCR加入了熒光信號采集系統與計算機分析處理系統，可借助熒光信號監測擴增循環產物的積累情況，實時掌握擴增進程的同時，通過熒光曲線及Cq 值等參數，完成目標病毒的定量檢測，其精確性更高，檢出效果更佳[18，19]。本研究顯示，熒光定量RT-PCR對GⅠ型、GⅡ型諾如病毒的檢測準確性、敏感度、特異度高于常規RT-PCR檢測（P＜0.05），表明熒光定量RT-PCR對諾如病毒的診斷效能優于常規RT-PCR檢測。究其原因，常規RT-PCR檢測技術僅可對PCR擴增反應的終點產物進行分析，無法完成起始模板的準確定量，其對病毒RNA質量的依賴性較高，易受到逆轉錄酶及PCR引物等因素的影響，隨著循環次數的增多，其產物的擴增偏離模板劑量較不可控，檢測效能較為有限[20，21]。熒光定量RT-PCR則可充分利用擴增循環中的熒光表達，測定PCR的最終產物量，用于諾如病毒的檢測，其操作過程均于封閉體系下完成，大大降低了污染概率，且解決了常規RT-PCR只能終點檢測的局限性問題，其熒光信號檢測可覆蓋每輪循環，避免了擴增偏離引起的檢測誤差，有效降低了反應的非特異性，具有更高的檢測準確性、敏感度及特異度[22，23]。

綜上所述，熒光定量RT-PCR在GⅠ型、GⅡ型諾如病毒診斷中具有較高檢測效能，可為其病毒感染的診斷提供可靠參考信息，值得臨床應用。

參考文獻：

[1]楊艷歌，吳占文，李濤，等. GI和GII諾如病毒ERA的可視化快速檢測[J].華南理工大學學報（自然科學版），2023，51（12）：140-151.

[2]Dey SK，Sharif N.Evaluation of a rapid immunochromatography（IC） diagnosis kit for the detection of rotavirus and norovirus in diarrheal stool specimens in Bangladesh[J].International Journal of Infectious Diseases，2021，101（S1）：180-203.

[3]付瑤，劉海婷，施俊超，等.反轉錄酶在微小RNA實時熒光定量聚合酶鏈反應中的作用[J].實用檢驗醫師雜志，2023，15（2）：193-197.

[4]Chhabra P，Browne H，Huynh T，et al.Single-step RT-PCR assay for dual genotyping of GI and GII norovirus strains[J].J Clin Virol，2021，134：104689.

[5]Bonura F，Urone N，Bonura C，et al.Recombinant GII.P16 genotype challenges RT-PCR-based typing in region A of norovirus genome[J].J Infect，2021，83（1）：69-75.

[6]王娉，田卓，齊欣，等.聚乙二醇沉淀富集和預擴增反轉錄實時定量聚合酶鏈式反應高靈敏檢測小漿果中低濃度甲型肝炎病毒[J].分析化學，2022，50（8）：1168-1178.

[7]Quee FA，de Hoog MLA，Schuurman R，et al.Community burden and transmission of acute gastroenteritis caused by norovirus and rotavirus in the Netherlands （RotaFam）： a prospective household-based cohort study[J].Lancet Infect Dis，2020，20（5）：598-606.

[8]Han Y，Wang J，Zhang S，et al.Rapid detection of norovirus genogroup II in clinical and environmental samples using recombinase polymerase amplification[J].Anal Biochem，2020，605：113834.

[9]溫靜，鄭天馳，王希峰，等.2019年北京市大興區諾如病毒GI引起急性胃腸炎疫情的病原學分析[J].中國衛生檢驗雜志，2021，31（14）：1783-1786.

[10]卞蓮蓮，王一平，孫世洋，等.基于疊氮溴化丙錠-定量反轉錄-聚合酶鏈式反應的甲型肝炎疫苗病毒滴度快速檢測方法[J].中國病毒病雜志，2020，10（6）：421-425.

[11]祝琳，佟靖軒，姚秀林，等.2017-2019年撫順市急性胃腸炎患者諾如病毒檢測結果分析[J].中國國境衛生檢疫雜志，2020，43（5）：337-339.

[12]趙躍麗，饒清，孫強明，等.糞便標本中諾如病毒GⅡ拷貝數定量檢測方法的建立和應用[J].中國感染控制雜志，2020，19（10）：864-870.

[13]紀蕾，劉光濤，劉彬輝，等.一起GⅠ、GⅡ型諾如病毒混合感染疫情的病原鑒定及基因特征分析[J].中國衛生檢驗雜志，2020，30（13）：1567-1570，1573.

[14]黃晨璐，許偉，胡乾坤，等.實時熒光核酸恒溫擴增試驗和定量反轉錄-聚合酶鏈反應對血清乙型肝炎病毒RNA定量檢測的一致性評價[J].微生物與感染，2020，15（3）：158-165.

[15]賈添慧，董蕾，王永杰，等.牡蠣中GⅡ型諾如病毒巢式RT-PCR檢測方法的優化與評價[J].上海海洋大學學報，2021，30（2）：239-246.

[16]曲莉，王洪艷，李環，等.常規RT-PCR快速檢測諾如病毒方法的建立[J].北華大學學報（自然科學版），2020，21（2）：188-190.

[17]顏偉，張靜，吳杰，等. 2017-2018年濱州市病毒性腹瀉流行病學特征及病原學監測分析[J].熱帶醫學雜志，2020，20（2）：264-266，278.

[18]Skyum F，Chen M，Mogensen CB.Evaluation of a new fast in-house Real-Time PCR assay for detecting both Norovirus and toxigenic Clostridium difficile using fecal sample and rectal swab[J].Am J Infect Control，2022，50（1）：67-71.

[19]Jahne MA，Brinkman NE，Keely SP，et al.Droplet digital PCR quantification of norovirus and adenovirus in decentralized wastewater and graywater collections： Implications for onsite reuse[J].Water Res，2020，169：115213.

[20]陳海麗，楊春憶，張萬菊，等.2015-2016年上海地區成人門診腹瀉病例中諾如病毒GⅡ型流行特征[J].中華實驗和臨床病毒學雜志，2020，34（2）：145-150.

[21]嚴寒秋，王永全，崔海洋，等.應用2種RT-PCR方法檢測和分析北京市市場銷售牡蠣中諾如病毒基因特征[J].中華流行病學雜志，2022，43（1）：92-97.

[22]毛瑞，曹三成，王增國，等.673例急性腹瀉患兒諾如病毒GⅠ、GⅡ型感染快速篩查結果分析[J].傳染病信息，2023，36（4）：351-354.

[23]Kulis-Horn RK，Tiemann C.Evaluation of a laboratory-developed test for simultaneous detection of norovirus and rotavirus by real-time RT-PCR on the Panther Fusion system[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2020，39（1）：103-112.

收稿日期：2024-02-19；修回日期：2024-02-28

編輯/成森