2株黃連根腐病生防菌的鑒定

摘要：本文采用平板對峙、分子生物學鑒定和不同指示培養基檢測相結合的方法，篩選并鑒定土壤中具有拮抗黃連根腐病菌的菌株并研究其抑菌機制，以期為黃連根腐病（Fusarium sp.）的防治提供更好的生物防治方法。結果表明，從土壤中篩選出2株對黃連根腐病具有明顯拮抗效果的芽孢桿菌，編號BYH9、BYH3，均為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。經抗菌譜實驗證明，2株菌株具有廣譜抗菌性，對多種植物病原真菌均有明顯拮抗作用，其中對辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）的抑制效果最明顯，分別為66.27 %、57.66 %。特定平板測定發現，BYH9、BYH3均能產生纖維素酶和磷酸酯酶，是有極高生物防治潛力的菌株。

關鍵詞：黃連；根腐病菌；抑制作用；貝萊斯芽孢桿菌

中圖分類號：S476.1文獻識別碼：A文獻編號：10056114（2025）0202205

黃連（Coptis chinensis）是毛茛科、黃連屬的多年生草本植物，具有抗菌、抗毒和解毒的功效［1］，主要產于廣西、云南、貴州等地區，是一味重要的民間中藥材。黃連根腐病是危害黃連生產的主要土傳病害之一，發病面積廣，發病情況嚴重，主要危害黃連的地下莖塊，初期葉片發黃，后變黑褐色并干枯，極大影響了黃連的生產。目前，防治黃連根腐病害的方法包括農業防治、化學防治和生物防治［2，3］，但農業防治效果差，化學防治雖然效果好，操作便捷，價格低，但長期使用容易造成農藥殘留量超標，中藥材污染，危害人類健康并造成環境污染，而且還易產生抗藥性。

隨著人們對健康和環保意識的加強，安全無污染的中藥材根腐病的防治方法越來越受到重視；而生物防治法可以彌補以上不足，不僅成本低且對環境友好，是一種理想的防治手段［4］。近年來，中藥材根腐病的生物防治多為微生物活菌體。沈永昶等從三七植株中篩選出解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）WZZ-6和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）WZZ-25，對三七根腐病具有顯著的拮抗效果，其防治效果高達100%［5］；游景茂等從白術體內分離得到一株枯草芽孢桿菌BZJN1，經田間防效試驗證明，抑菌率超過70%，具有促生效果［6］。

生物防治作為抗病研究的先鋒，其中的芽孢桿菌更是以可產生具有拮抗效果的次生代謝產物以及抗逆性強的芽孢而倍受推崇，并且芽孢桿菌拮抗機制多樣化，能在植物根際有效定殖并保持較高群體數量［7，8］，而貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是芽孢桿菌中的一種，是連接土壤和植物的優勢微生物，對環境兼容性高、可抑制植物病原菌和促進植物生長，具有廣譜抗菌活性，在植物病蟲害生物防治、提高糧食產量和品質以及生物農藥開發應用上有較大應用前景［9］。陳爽等探究了貝萊斯芽孢桿菌HM3-3對大豆根腐病盆栽防治效果和防御酶活性，結果表明，HM3-3不僅具有促生作用，對大豆根腐病還具有防治作用，可以誘導防御酶的活性［10］。

近年來，因黃連根腐病發病率高，嚴重制約了黃連的產業化發展，但尚未見利用貝萊斯芽孢桿菌防治黃連根腐病的報道。本文將以黃連根腐病菌（Fusarium sp.）為防治對象，從土壤中分離出微生物進行平板對峙試驗，篩選并鑒定土壤中具有拮抗黃連根腐病菌的菌株并探究其抑菌機制，以期為黃連根腐病的最佳防治方法提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1土壤

2021年10月在貴州省貴陽市白云區青山村采集黃連根腐病發病較重地塊的健康植株根際土壤，使用5點取樣法采集5～10 cm深度的土壤，再用經75%酒精滅菌10 s、無菌水清洗3次的鐵鍬收集土壤于滅菌過的牛皮紙信封袋中，在實驗室進行分離培養。

1.1.2菌株

病原菌為黃連根腐病菌（Fusarium sp.）、煙草黑脛病菌（Phytophthora nicotianae）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒炭疽病菌（C. capsici），由貴州大學農學院植物病理學教研室保存并提供。

1.1.3供試培養基

參照文獻［11］配制LB液體培養基、LB固體培養基、PDA固體培養基、纖維素酶檢測培養基和磷酸酯酶檢測培養基。

1.2試驗方法

1.2.1菌株分離

將10 g試驗土壤添加至盛有90 mL無菌水的錐形瓶中，于80℃水浴鍋中水浴30 min，每隔5 min振蕩錐形瓶，使混合液中大部分細菌除芽孢桿菌外被殺死；搖培結束后靜置10 min，將1 mL混合液添加至9 mL無菌水中，并采用梯度稀釋法，分別得到10-1、10-2、10-3、10-4的稀釋液。取10-4稀釋液100 μL均勻涂抹至固體LB培養基上，待菌液干漬后密封，倒置存放于細菌培養箱中，在25℃下培養1 d。

1.2.2菌液制備

挑取菌株單菌落接種劃線于固體LB培養基上純化菌株，將純化后的菌株接種到10 mL的離心管中（內有3 mL的LB液體養基），在搖床中以37℃、200 r/min黑暗條件下培養12 h，培養結束后以10 000 r/min離心收集離心管底部菌體，最后加入1 mL無菌水懸浮制備成細菌懸浮液；另外取700 μL的菌液與700 μL滅過菌的30 %甘油混合，保存于-80℃冰箱中。

1.2.3拮抗芽孢桿菌篩選及抑菌譜測定

以黃連根腐病菌為靶標病原菌。煙草黑脛病菌、番茄灰霉病菌、辣椒炭疽病菌為對峙病原菌。采用平板對峙法［11］，同1.2.2制備懸浮菌液，再將病原菌菌餅（使用打孔器切割直徑約2 mm）接種至PDA平板中央處，距菌餅2.5 cm處對稱滴加細菌懸浮液3 μL。以只接病原菌PDA板為對照組（CK）。26℃培養，待空白對照病原菌菌落長滿整個平板時，觀察并記錄菌落直徑，采用十字交叉法［12］計算抑菌率。

抑菌率（%）=（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100

1.2.4菌落形態觀察

根據1.2.2制備的懸浮液滴，加3 μL至LB平板中央，密封于培養箱中，28℃條件下暗培養12 h觀察。

1.2.5生理生化特征測定

根據《常見細菌系統鑒定手冊》進行生理生化特性測定［13］。

1.2.6分子生物學鑒定

利用細菌DNA提取試劑盒（無錫百泰克生物技術有限公司）提取待測菌株基因組DNA。以菌株DNA為模板，通用引物gyrA（gyrA5P：CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT，gyrA3P：CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT）和16S rDNA（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA，1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT）對菌株DNA進行PCR擴增，擴增采用25 μL的反應體系（DNA 1 μL，引物各1 μL，Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL），16S rDNA PCR反應程序：94℃預變性10 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環后72℃延伸10 min。gyrA的PCR反應程序與16S rDNA相似，但退火溫度為57℃ 30 s。擴增產物送生工生物工程（上海）有限公司進行測序。

將獲取的基因序列在Genbank基因數據庫中，通過BLAST進行同源序列相似性比對分析，再在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上下載相關權威菌種對應序列。使用Bioedit軟件將所測序列和從NCBI下載的相關序列進行人工調整以保證各對堿基的同源性，利用PAUP*4.0b10軟件［14］進行分析。系統構建采用啟發式搜索（Heuristic search），以隨機添加序列方式1 000次重復。自展法檢驗（Bootstrap），用于評估系統樹各節點的支持率，在測試中重復1 000次分別構建gyrA和16s rDNA、gyrA的多基因系統發育樹［15，16］。

1.2.7機制測定

通過制備特定平板檢測菌株是否產生纖維素酶、磷酸酯酶等，測定其生防機制。

1.3數據統計與分析

試驗所得數據采用DPS分析軟件處理，Duncans新復極差法進行顯著性分析（P＜0.05）。

2結果與分析

2.1拮抗菌篩選

初篩：通過平板對峙篩選出對黃連根腐病菌有拮抗效果的菌株，分別編號BYH9、BYH3（圖1）。

2.2拮抗菌鑒定

2.2.1菌株生理生化測定

測定結果表明，BYH9菌株和BYH3菌株革蘭氏染色、甲基紅、硫化氫、亞硝酸還原及V.P反應均呈陽性，可以產生過氧化氫酶、淀粉水解酶，使明膠液化、葡萄糖氧化發酵，并能分解麥芽糖、鼠李糖和甘露醇（表1）。

2.2.2拮抗菌分子鑒定

經過16S rDNA基因比對發現，BYH3與貝萊斯芽孢桿菌GIPB04、FZB42的同源性為63%，BYH9與貝萊斯芽孢桿菌17467的同源性為64%。通過gyrA的基因比對發現，BYH9與貝萊斯芽孢桿菌B-41580、B-4257的同源性為97%，BYH3與貝萊斯芽孢桿菌B-41580、B-4257及B-569的同源性為100%（圖4、圖5）。

2.2.3拮抗菌形態

通過芽孢桿菌形態鑒定可知，BYH3均為圓形乳黃色菌落、BYH9為圓形乳白色菌落；BYH3有一圈隆起狀圈中部分干燥、BYH9中心光滑呈花狀（圖6）。

結合以上部分，通過形態學、分子生理學鑒定得知，菌株BYH3、BYH9均為貝萊斯芽孢桿菌。

2.3生防機制

2.3.1抑菌譜測定

室內對2株芽孢桿菌抑菌譜進行測定，并對其抑菌率進行方差分析，結果如圖7和表2所示。發現BYH9、BYH3菌株對辣椒炭疽病的抑菌效果最明顯，抑菌率分別為57.66 %、66.27 %；2株菌株對煙草黑脛病也有抑制效果，抑菌率分別為39.23%、47.28%；此外，對番茄灰霉病抑制效果較差，抑制率分別為33.72%、31.93%；2株菌株對煙草黑脛病、番茄灰霉病、辣椒炭疽病的抑制率不存在明顯差異。

2.3.2機制測定

由圖8可知，2株芽孢桿菌均在磷酸酯酶和纖維素酶檢測平板產生消解圈，表明其均能產生磷酸酯酶和纖維素酶等物質。

3結論與討論

本研究從采集的土壤中分離得到對黃連根腐病有明顯生防能力的BYH9、BYH3菌株，經形態學、生理生化和分子學鑒定2株菌株均為貝萊斯芽孢桿菌，并發現BYH9、BYH3可以使黃連根腐病菌菌絲膨大和畸形，對煙草黑脛病菌、番茄灰霉病菌和辣椒炭疽病菌的病原菌均具有明顯的抑制效果。對2株菌株的抑菌機理進行了初步的探究，發現其均可產生纖維素酶和磷酸酯酶，具有降解真菌細胞壁，去磷酸化促進生長的潛力和產生伊枯草菌素C14、伊枯草菌素C15等脂肽類物質從而防治植物病原菌。

程歡歡等研究發現，從辣椒根部土壤中篩選獲得的貝萊斯芽孢桿菌AL210可以抑制多種病原菌生長，并且能產生纖維素酶和磷酸酯酶［17］；而倪方方等發現芽孢桿菌分泌的蛋白質酶、纖維素酶等能致使真菌細胞壁破壞，導致真菌結構不穩定，使得真菌菌絲膨大、畸形，從而直接抑制真菌的生長［18］。菌株BYH9、BYH3不僅擁有廣泛的抑菌譜，還可產生纖維素和磷酸酯酶，這說明菌株BYH9、BYH3可以分泌纖維素酶等物質直接抑制病原真菌的生長。自然環境下，能被植物直接吸收利用的無機磷較少，但卻有較多的有機磷，而有機磷可以被溶磷類菌株有效地分解成無機磷并直接被植物吸收利用，有研究指出菌株S.maltophilia JYD-4能夠產生磷酸酯酶，能高效地分解土壤中的有機磷，其解磷量可高達75.54 mg/L［19］。而菌株BYH9和菌株BYH3能使磷酸酯酶檢測培養基產生消解圈，證明菌株BYH9和菌株BYH3具有分解土壤有機磷促進植物生長的能力。

生物防治是當代的研究熱門方向之一，大量拮抗菌如芽孢桿菌被用于生物防治，且已有芽孢桿菌成為商業產品投入作物生產中。本次研究表明，菌株BYH9和菌株BYH3具有較高的生防潛力，下一步，將繼續更深入的研究菌株BYH9和菌株BYH3的盆栽防效和促生作用，并對防御酶活性及主要抑菌物質進行探究，以期為黃連根腐病菌提供更好的生物防治方法，推動黃連的產業化發展。

參考文獻

［1］程歡歡，楊芳，高晉，等.黃連根腐病病原鑒定及其對殺菌劑敏感性測定［J］.植物病理學報，2020，50（3）：377380.

［2］穆向榮，馬逾英，楊枝中，等.藥用植物根腐病防治的研究進展［J］.中藥與臨床，2014，5（2）：58+52.

［3］鄭祿宇.常見根莖類中藥材根腐病的為害與防治［J］.植物醫生，2006（4）：1819.

［4］Ding Z，Guan F，Yu X，et al. Identification of the anchoring protein SpoIIIJ for construction of the microbial cell surface display system in Bacillus spp.［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2019 Jul 15；133：614623.

［5］沈永昶，曹貝貝，胡淼，等.三七根腐病原菌拮抗菌的篩選與活性分析［J］.浙江理工大學學報（自然科學版），2019，41（6）：806811.

［6］游景茂，熊坤，穆森，等.內生細菌BZJN1的鑒定及對白術根腐病的生物防治研究［J］.中國中藥雜志，2018，43（3）：478483.

［7］郭慶港，王培培，董麗紅，等.PhoR/PhoP雙組分系統對枯草芽胞桿菌NCD2菌落形態和芽胞形成的影響［J］.植物病理學報，2019，49（4）：552559.

［8］Liu Y，Zhang N，Qiu M，et al. Enhanced rhizosphere colonization of beneficial Bacillus amyloliquefaciens SQR9 by pathogen infection［J］.FEMS Microbiology Letters，2014，353（1）：4956.

［9］蔡高磊，張凡，歐陽友香，等.貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）研究進展［J］.北方園藝，2018（12）：162167.

［10］陳爽，王繼華，張必弦，等.貝萊斯芽孢桿菌對大豆根腐病盆栽防效及防御酶活性檢測［J/OL］.分子植物育種：114［20220417］.

［11］方中達.植病研究方法［M］.第3版.北京：中國農業出版社，2007.

［12］邱德文.我國植物病害生物防治的現狀及發展策略［J］.植物保護.2010，36（4）：1518.

［13］東秀珠，蔡秒英.常見細菌系統鑒定手冊［M］.北京：科學出版社，2021.

［14］Swofford，D.L.PAUP*.Phylogenetic Analysis Using Parsimony（*and other methods）. Version 4.0. Sinauer Associates，Sunderland，Massachusetts，2001.

［15］Hibbett D.S，Binder M，Bischoff J.F，et al. A higherlevel phylogenetic classification of the Fungi. Mycol. Res. 2007，111：509547.

［16］Brewer M T，Turner A N，Brannen P M. Exobasidium maculosum，a new species causing leaf and fruit spots on blueberry in the southeastern USA and its relationship with other Exobasidium spp. parasitic to blueberry and cranberry［J］.Mycologia，2014，106（3）：415423.

［17］程歡歡，姚偉偉，彭麗娟，等.一株辣椒炭疽病生防芽孢桿菌的篩選［J］.北方園藝，2019（23）：611.

［18］倪方方，徐紅梅，宋騰蛟，等.生防菌對白術根腐病菌的拮抗作用及盆栽防治效果［J］.浙江中醫藥大學學報，2017，41（3）：179185+204.

［19］晉婷婷，任嘉紅，劉瑞祥.南方紅豆杉根際解有機磷細菌的鑒定及其解磷特性和促生作用研究［J］.西北植物學報，2016，36（9）：18191827.