西瓜AUX／LAX基因的鑒定及在芽再生過程中的表達分析

摘要：生長素是最重要的植物激素之一，生長素內流載體AUX/LAX（AUXIN RESISTENT1/LIKE AUX1）與多膜跨越蛋白和氨基酸轉運蛋白有關，參與生長素的主動運輸過程。AUX/LAX基因已在多個物種中被鑒定，被發現在植物多個生長發育過程中發揮非常重要的作用，但在西瓜中還沒有相關報道。本研究在全基因組水平對西瓜AUX/LAX基因進行鑒定，并對其結構、系統發育、啟動子順式調控元件等進行了分析。結果表明，從西瓜全基因組中鑒定到5個AUX/LAX基因，都含有保守的Aa_trans結構域；對西瓜與擬南芥、水稻、黃瓜的21個AUX/LAX蛋白進行系統進化分析，它們被聚為兩個亞族，而絕大多數西瓜與黃瓜的AUX/LAX蛋白存在一對一同源關系；從西瓜AUX/LAX基因啟動子上鑒定到脫落酸、茉莉酸甲酯、水楊酸響應元件（TCA-element），以及赤霉素等激素和厭氧誘導、低溫、干旱等防御和非生物脅迫響應元件。實時熒光定量PCR（RT-qPCR）分析發現，除了ClAUX/LAX4，其他ClAUX/LAXs均在雄花中的表達水平最低，具有顯著的組織特異性：而且西瓜AUX/LAXs基因在分化能力不同的西瓜材料中的表達各不相同，其中ClAUX/LAX5在分化Sd的高再生材料中的表達水平顯著高于低再生材料，暗示其可能在西瓜芽再生過程中發揮重要作用。本研究結果可為進一步研究生長素在西瓜芽再生過程中的作用提供證據，并為挖掘西瓜芽再生調控基因奠定基礎。

關鍵詞：生長素轉運載體；AUX/LAX基因；西瓜；芽再生過程；基因表達

中圖分類號：S651： Q78 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025） 03-0001-09

生長素作為最重要的植物激素之一，參與調節植物的頂端優勢、向光性、向地性、花序和葉片發育、側根和不定根形成、維管組織分化及果實成熟等過程。生長素通過建立濃度梯度影響植物生長發育，其濃度梯度是由其合成、代謝、運輸和信號轉導等共同決定的。生長素在植物的活性部位，如莖尖、頂芽、幼葉、發育中的種子、主根尖分生組織和發育中的側根中合成，然后通過莖維管組織中的大量流動以非極性自由擴散的方式或通過轉運蛋白介導主動轉運至遠端目標組織。生長素轉運載體參與了生長素的主動運輸過程，這些轉運載體主要包括AUXIN RESIS-TENTI/LIKE AUXI（AUX/LAX）內流載體、PIN -FORMED （PIN）外排載體和ATP結合盒B/P -糖蛋白／多藥耐藥（ABCB/MDR/PGP）外排／狀態載體。其中，AUX/LAX與氨基酸轉運蛋白有關，是氨基酸／生長素滲透酶超家族中植物特有的亞類。

研究發現，AUX/LAX基因在植物生長發育過程中發揮非常重要的作用。在擬南芥中，AUX/LAX包括AUX1、LAX1、LAX2和LAX3四個成員，盡管它們在序列和生化功能上高度保守，但每個成員都表現出不同的時空表達模式，并在各種發育過程中獨立或聯合起作用。AUX1是AUX/LAX家族中最早發現的成員，其突變會導致根系向地性的顯著喪失：此外，AUX1不對稱地存在于根韌皮部細胞的質膜中，促進生長素從根向頂部和底部的運輸，進而促進根毛生長。AtLAX3和AtAUX1通過調節側根原基的萌發和起始來協調側根的發育。LAX2參與葉脈形成和木質部發育。在水稻基因組中鑒定到5個高度保守的AUX/LAX成員，分別是OsAUX1、Os-AUX2、OsAUX3、OsAUX4和OsAUX5，其中Os-AUX1和OsA UX3主要調節根的發育。在番茄中共鑒定出5個SlLAX基因，除了SlLAX3以外，其余SlAUX/LAX基因在番茄果實生長發育期間的表達量比成熟時高。黃瓜CsLAX2將細胞外生長素運輸到果實的凸側，從而控制黃瓜果實彎曲。除了上述功能外，AUX/LAX基因還參與植物的種子萌發、不定根和雌性配子體發育等過程。

西瓜（Citrullus lanatus）是炎炎夏日里的解暑水果之一，富含多種維生素，可起到調節心臟功能和平衡血壓的作用。然而，在生長發育過程中，西瓜易受不同病害和逆境脅迫的危害，導致果實品質和產量下降。近年來，轉基因技術被廣泛應用于培育抗逆作物品種中，然而，有些西瓜品種的芽分化能力低下，進而導致其遺傳轉化效率較低。研究證實，AUX/LAX基因在植物芽再生過程中發揮著十分重要的作用。目前已經在擬南芥、水稻、番茄等物種中鑒定了AUX/LAX基因，但西瓜AUX/LAX基因的相關研究還未見報道。

本研究在全基因組水平對西瓜AUX/LAX基因進行鑒定，并從基因數量、系統發育、基因結構、啟動子順式調控元件、時空表達模式等方面進行分析，同時利用浙江省農業科學院蔬菜研究所西瓜甜瓜育種研究室前期篩選獲得的再生能力不同的兩份西瓜材料，探索ClAUX/LAXs基因在芽再生過程中的表達模式，以期為將來進一步開展ClAUX/LAXs的功能和調控機制研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料處理和樣品采集

2023年6月從浙江省農業科學院長安基地分別采集再生能力強（RC）和弱（NRC）的兩份西瓜材料的種子，用濃度為20%的NaClO溶液消毒30 min，期間不斷用鑷子攪拌：用無菌水清洗4次，每次5 min，用濾紙吸干表面多余水分后置于1/2 MS培養基上，30℃催芽36 h后轉移到光下培養12 h：待子葉微張開時切下子葉中段，置于MS培養基的無菌濾紙上暗培養，4d后轉到分化培養基（含有2 mg/L玉米素和300 mg/L特美汀的MS培養基）上進行分化誘導，分別在分化Sd和10 d取愈傷組織。將西瓜幼苗置于30℃光照16 h、25℃黑暗8h的條件下生長至4周大，然后分別取其根、莖、葉、雄花、雌花和授粉后3d的果實，每種樣品3個重復，每個重復至少10株幼苗。所有樣品采集后立即置于液氮中，帶回實驗室并保存在-80 ℃超低溫冰箱中，用于后續ClAUX/LAX基因的表達分析。

1.2 西瓜AUX/LAX基因的鑒定

從The Arabidopsis Information Resource（TAIR）10和Rice Genome Annotation Project數據庫分別下載擬南芥和水稻的AUX/LAX蛋白序列，并在CuGenDBv2（http：//cucurbitgenomics. org/）進行BLASTP檢索，初步篩選出西瓜AUX/LAX家族的候選成員，同時利用HMM軟件檢索西瓜AUX/LAX，結合兩種方法獲取的候選蛋白，去掉冗余后使用Pfam數據庫分析（E值為1.08）候選序列以確認MFS-2（PF13347.6）結構域的存在，過濾掉沒有MFS-2結構域的候選蛋白。

1.3 西瓜AUX/LAX基因家族的系統發育、保守基序和理化性質分析

利用ClustalW對擬南芥、水稻、黃瓜和西瓜的AUX/LAX蛋白進行多序列比對。系統發育樹使用MEGA X（10.0.1版本）采用鄰接法（1 000次置信值）構建。為了分析基因結構，使用基因結構顯示服務器（GSDS）在線程序（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）將ClAUX/LAXs基因的編碼序列（CDS）與其對應的基因組序列（DNA）進行比較。利用ExPASy ProtParam（http：//www. expasy. org/proteomics）網站分析CIAUX/LAXs的理化參數，包括蛋白質長度、分子量和等電點（pI）等。使用Multiple Em for Motif Elicitation（MEME）（ht-tps：//meme-suite. org/tools/meme）分析CIAUX/LAXs蛋白的保守基序，基序數目設置為5個。利用ProtCompv9.0（http：//linuxl. sofberry. com/berry.phtml？topic=protcompplamp;group=programsamp;subgroup=proloc）預測蛋白的亞細胞定位。

1.4 ClAUX/LAXs啟動子順式作用元件分析

利用ClAUX/LAXs基因的ID號在葫蘆科基因組數據庫CuGenDBv2中下載這些基因起始密碼子（ATG）上游2 000 bp的啟動子序列，并提交到PlantCARE數據庫進行順式作用元件分析。利用TBtools軟件制圖。

1.5 總RNA提取及實時熒光定量PCR分析

采用RNA Easy Fast植物組織RNA提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取西瓜總RNA。按照操作說明書，使用FastKing一步法反轉錄為cDNA，用于RT - qPCR分析。所用引物序列見表1。RT-qPCR分析在BioRad CFX96實時PCR儀上進行，使用試劑為GoTaq Green Master Mix（Pro-mega，北京）。PCR體系包括TOROGreenqPCRMaster Mix 10μL，primer-F 0.8μL， primer-R 0.8μL，cDNA 2μL，ddH2O 6.4μL。程序設置為：預變性9 5℃3 min；9 5℃變性10s，5 5℃退火1 min，40個循環：熔解曲線設定為95℃15 s，60℃1min，95℃15 s。選用西瓜Actin基因（ClActin）作為內參基因，進行3次生物學和技術重復，用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達水平。柱狀圖用Mi-crosoft Excel軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 西瓜AUX/LAX家族基因的鑒定

本研究從西瓜基因組中篩選并鑒定出5個ClAUX/LAX基因，根據在西瓜染色體上的排列順序分別被命名為ClAUX/LAX1-ClAUX/LAX5（表2）。這5個ClAUX/LAX蛋白的氨基酸長度為466（ClAUX/LAX2）～497 aa（ClAUX/LAX1），分子量范圍為52.59-55.91 kDa，等電點范圍為8.45（ClAUX/LAX3）～9.09（ClAUX/LAX1），蛋白亞細胞定位預測均在質膜上。

2.2 ClAUX/LAX家族成員的系統發育分析

為了更好地了解ClAUX/LAXs與其他植物同源蛋白的進化關系，本研究利用西瓜、擬南芥、水稻和黃瓜的AUX/LAX蛋白序列構建了進化樹。結果（圖1）發現，這4個物種的21個AUX/LAX蛋白被劃分為兩個亞族，亞族Ⅰ和Ⅱ分別包含10個和11個成員。其中，西瓜的ClAUX/LAXI和ClAUX/LAX2被聚類在亞族Ⅰ，而ClAUX/LAX3、ClAUX/LAX4、ClAUX/LAX5則被聚類在亞族Ⅱ。

2.3 ClAUX/LAX家族成員的結構分析

利用SMART網站對5個ClAUX/LAX蛋白的結構域進行分析，結果發現它們均含有一個保守的Aa_trans結構域（圖2）。利用MEME網站對其保守基序進行分析，結果顯示它們均含有5個保守的蛋白基序（圖3）。使用GSDS在線軟件分析ClAUX/LAXs的內含子-外顯子結構，結果顯示，除了ClAUX/LAX4有6個內含子，其余4個基因均含有7個內含子（圖4）。

2.4 ClAUX/LAXs的染色體定位分析

5個ClAUX/LAX基因隨機分布在西瓜的5條染色體上（圖5）。其中，ClAUX/LAX1分布在2號染色體上，ClAUX/LAX2分布在3號染色體上，ClAUX/LAX3分布在4號染色體上，ClAUX/LAX4分布在10號染色體上，ClAUX/LAX5分布在11號染色體上。沒有發現由大片段復制和串聯重復造成的基因家族擴張事件。

2.5 ClAUX/LAXs啟動子區的順式作用元件分析

利用PlantCARE在線軟件分析ClAUX/LAXs基因起始密碼子上游2 000 bp啟動子序列上的順式作用元件，結果檢測到21個激素和逆境脅迫響應元件（圖6）。其中，激素響應元件包括1個脫落酸響應元件（ABRE）、3個茉莉酸甲酯響應元件（CGTCA-motif和TGACG - motif）、2個水楊酸響應元件（TCA - element）和1個赤霉素響應元件（GARE-motif），而逆境脅迫響應元件包括8個厭氧誘導響應元件（ARE）、2個低溫響應元件（LTR）、2個干旱響應元件（MBS）和2個參與防御和非生物脅迫響應的元件（TC-rich repeats）．

2.6 ClAUX/LAXs基因在西瓜不同組織中的表達分析

利用RT-qPCR對ClAUX/LAXs基因在西瓜根、莖、葉、雄花、雌花和授粉后3d的果實中的表達水平進行測定分析，結果（圖7）發現，所有ClAUX/LAX成員的表達均表現出較強的組織特異性。其中，ClAUX/LAX2和ClAUX/LAX5分別在葉和根中表達水平最高，在雄花中最低：ClAUX／LAX1在雌花中的表達水平最高，在雄花中幾乎不表達：ClAUX/LAX3在莖中的表達水平最高，在雄花中最低：而ClAUX/LAX4在雄花中表達水平最高，在根中最低。

2.7 ClAUX/LAXs在西瓜芽再生過程中的表達分析

為了探討ClAUX/LAXs基因在西瓜芽再生過程中的潛在功能，本研究利用RT-qPCR對分化5d和10 d的西瓜高再生材料（RC）和低再生材料（NRC）愈傷組織中ClAUX/LAXs基因的表達特征進行了分析。結果（圖8）發現，除ClAUX/LAX5外，ClAUX/LAXs基因在分化10 d的RC和NRC西瓜中的表達水平均比分化Sd時顯著降低。在分化5d時，與NRC相比，ClAUX/LAX1、ClAUX／LAX3和ClAUX/LAX4在RC中的表達水平顯著降低，是NRC的60％～85％；ClAUX/LAX2在RC中的表達水平稍高，是NRC的1.34倍；而ClAUX/LAX5在RC中的表達量顯著增高，是NRC的2.77倍。在分化10 d時，與NRC相比，除ClAUX/LAX5表達量明顯增高外，其余ClAUX/LAXs在兩種材料中的表達水平基本一致。

3 討論與結論

本研究在西瓜基因組中共鑒定到5個ClAUX/LAXs基因，比較發現，西瓜中AUX／LAX基因的數量與水稻（5個）一致，略高于擬南芥（4個），但比黃瓜（7個）少。對擬南芥、水稻、黃瓜和西瓜的AUX/LAXs蛋白進行系統發育分析，結果表明這些AUX/LAXs蛋白被分為兩個亞族，這與之前的文獻報道一致：在各個亞族中，單子葉（水稻）和雙子葉（擬南芥、黃瓜和西瓜）植物的AUX/LAXs蛋白又形成了各自的分支：西瓜與黃瓜AUX/LAXs蛋白存在一對一的同源關系，表明它們可能來自共同的祖先，但是西瓜中缺失了與黃瓜CsLAX1和CsLAX4蛋白對應的同源蛋白，這說明葫蘆科物種的AUX/LAX家族進化存在特異性，西瓜AUX/LAX家族在進化過程中可能丟失了部分成員。研究還發現，ClAUX/LAXs基因的結構與擬南芥的相似，均包含6-8個內含子，而水稻的AUX/LAXs基因則包含2-7個內含子：與其他物種的研究報道相似，ClAUX/LAXs蛋白也被預測均定位在質膜上。表明ClAUX/LAXs基因的結構保守。

本研究進一步對ClAUX/LAXs基因的組織表達特異性進行了分析，結果發現，除了ClAUX／LAX4，其他ClAUX/LAXs均在雄花中的表達水平最低。其中，ClAUX/LAX2與擬南芥AtLAX3同源，在根中的表達水平較高，而AtLAX3是側根原基起始和發育的重要調控因子，說明ClAUX/LAX2很可能在西瓜根的發育過程中發揮重要作用。進化分析發現，ClAUX/LAX3與ClAUX/LAX4的親緣關系比其與擬南芥和水稻直系同源蛋白的更近，與擬南芥AtLAX1聚類在同一分支。但ClAUX/LAX3和ClAUX/LAX4的表達具有明顯的組織特異性：ClAUX/LAX3在莖中高表達，其次是根，這與擬南芥AtLAX1相似，而AtLAX1在莖和根組織中均促進木質部分化，這為后續研究ClAUX/LAX3基因的生物學功能提供了一定的借鑒：ClAUX/LAX4在雄花和雌花中高表達，表明其很可能在花發育過程中發揮調控功能。

同時，本研究選用再生能力不同的兩種西瓜材料，分析ClAUX/LAXs基因在其分化5d和10 d的愈傷組織中的表達情況，結果發現ClAUX/LAXs的表達水平隨著西瓜子葉的分化逐漸降低，表明它們很可能與西瓜的再生能力相關。值得注意的是，只有ClAUX/LAX5在分化Sd的高再生材料中的表達水平顯著高于低再生材料，其余ClAUX/LAXs在兩種材料中的表達水平差異不顯著。

本研究還發現，ClAUX/LAX5與擬南芥AtAUX1是同源蛋白。AtAUX1不僅影響側根的形成和定位，還能調控擬南芥愈傷組織生長。而ClAUX/LAX5在西瓜根中特異表達，推測其很可能也在西瓜愈傷組織生長和芽再生過程中發揮調控作用。

本研究結果可為進一步研究西瓜再生調控基因、提高西瓜的再生能力、完善西瓜轉基因技術奠定基礎。

基金項目：國家自然科學基金項目（32202478）；浙江省自然科學基金項目（LY22C150010）；浙江省農業新品種選育重大科技專項子課題（2021C02065-3-1-1）