梔子TCP基因家族鑒定及響應鹽脅迫表達模式分析

摘要：為明確梔子TCP基因家族及鹽脅迫響應，利用生物信息學手段對梔子TCP基因家族進行鑒定、分析和鹽脅迫表達試驗分析。結果表明，在梔子中共鑒定出16個TCP基因，分為PCF、CYC和CIN共3個亞家族。保守基序、基因結構和理化性質表明，同亞家族基因保守基序相似，不同亞家族的基因保守基序差異較大，16個梔子TCP基因均為親水蛋白。染色體定位表明，16個梔子TCP基因不均勻地分布在8條染色體上，且包含多個片斷段復制事件。順式作用元件分析發現，梔子TCP基因中含有多種與植物生長發育、應激反應及激素調節相關的作用元件，以脅迫響應元件MYB和MYc最多；鹽脅迫表達量顯示，梔子TCP基因均能響應鹽脅迫，部分基因在重度鹽脅迫特異性表達，推測GjTCP13、GjTCP12和GjTCP6可能為梔子耐鹽調控的關鍵基因。綜上所述，梔子TCP基因家族成員能夠積極響應鹽脅迫，增強梔子的耐鹽抗性。

關鍵詞：TCP基因家族；梔子；生物信息學；鹽脅迫

中圖分類號：S188；S685.990.1" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0126-07

收稿日期：2024-03-18

基金項目：福建省林業科技推廣項目（編號：2022TG09、閩［2024］TG22號）；福建省科技廳高校產學合作項目（編號：2022N5009）。

作者簡介：林宇清 （1999—），男，江西贛州人，碩士研究生，主要從事藥用植物栽培與利用研究。E-mail：2397193102@qq.com。

通信作者：鄒雙全，研究員，博士生導師，主要從事森林培育、觀賞藥用植物研究。E-mail：zou@fafu.edu.cn。

梔子（Gardenia jasminoides）是優質茜草科灌木，耐陰和抗毒性強，是綠化和美化環境的優質園林樹種，果實為傳統藥材，富含天然梔子黃色素，是國際上流行的天然色素和食品添加劑［1］。梔子耐干旱、耐瘠薄，適應力強，廣泛分布于我國大部分地區。研究表明，梔子對旱澇脅迫具有不同程度的適應性，是優良的園林植物材料［2］。筆者所在課題組在泉州濱海森林公園發現，梔子能在近海鹽堿地正常生長，但對其鹽脅迫響應分子機制尚不清楚。

植物特異性TCP基因家族是一組編碼轉錄調控因子的基因，在植物發育過程中起著核心作用［3］。TCP的命名源自TB1基因、CYC基因、PCF1和PCF2基因，該類基因編碼產物的N端均有1個55～59個氨基酸且高度保守的結構域，并形成1個非典型的螺旋－環－螺旋結構（bHLH），其中2個螺旋結構均由保守的親水氨基酸構成［4-5］。因此，基于TCP基因家族結構域同源性分析，可將TCP基因家族分為ClassⅠ（或者TCP-P）和ClassⅡ（或者TCP-C）2個類群［3］。ClassⅠ類又名PCF亞家族，ClassⅡ則進一步劃分為CIN和CYC/TB1這2個亞家族［6］。目前，TCP基因在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、茄子（Solanum melongena）、穿心蓮（Andrographis paniculata）和苦蕎（Fagopyrum tataricum）等物種完成了鑒定［7-10］。已有研究表明，AtTCP15能參與葉片發育和節間長度的調控，AtTCP20參與茉莉酸（JA）代謝，AtTCP21、AtTCP22和AtTCP23調控植株生長［11-13］。西瓜（Citrullus lanatus）ClTCP14a和ClTCP15參與株高調控［14］。毛竹（Phyllostachys heterocycla）中PeTCP10可以通過MeJA途徑負調控側根的生長發育［15］。近年來，許多研究發現，TCP轉錄因子能夠提高植物多種生物脅迫和非生物脅迫的抗性。例如，在茄子中，ClassⅠ類TCP成員在熱脅迫下存在明顯上調響應［8］。在穿心蓮中，結合逆境脅迫表達模式和 qRT-PCR 驗證，預測到ApTCP4、ApTCP5、ApTCP6和ApTCP11可能參與響應干旱、高溫和茉莉酸甲酯（MeJA）等多種非生物脅迫［9］。在苦蕎中，qRT-PCR驗證表明，FtTCP3在應對干旱和鹽脅迫時起正向調控作用［10］。以上研究表明，TCP轉錄因子能廣泛參與植物生長及非生物脅迫過程，然而在梔子中關于TCP基因家族及鹽脅迫研究還未有報道。因此，通過研究梔子全基因組鑒定分析TCP基因家族成員，探究其分子抗逆機制，對濱海梔子鹽堿品種培育具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從NCBI數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中搜索獲得梔子全基因組數據。從Ensembl plants（http：//plants.ensembl.org/index.html）中下載擬南芥和水稻的基因文件和GFF注釋文件。

1.2 梔子TCP基因家族的鑒定

通過Pfam（http：//pfam.xfam.org/）在線軟件下載TCP基因隱馬爾可夫模型Pfam（PF03634）。以擬南芥TCP基因家族的氨基酸序列作為對照，進行本地BLAST，并按照閾值E-value≤1×10-5將可信度較高的梔子TCP基因初步篩選出來。再通過NCBI中的CDD（https//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）驗證特征性蛋白結構域，剔除不含特征性結構域的基因。

1.3 梔子TCP基因染色體定位及基因結構分析

利用TBtools軟件對梔子TCP基因的染色體進行定位，并通過TBtools軟件中Gene Location Visualize from GTF/GFF將可視化后再進一步分析。

1.4 梔子TCP蛋白保守基序分析

通過網站MEME（https：//meme-suit.org/tools/meme）對梔子TCP基因進行保守基序鑒定，（參數設置：任意重復次序，最大基數為10），并通過TBtools軟件進行可視化分析。

1.5 梔子TCP基因系統進化樹分析

選擇擬南芥、水稻和梔子TCP蛋白通過MAGE-X進行氨基酸序列比對，采用N-J法構建進化樹。并用在線軟件itol（https：//itol.embl.de）和Adobe Illustrator 軟件進行美化。根據擬南芥已有分組對梔子TCP基因家族進行聚類分析。

1.6 梔子TCP基因鹽脅迫表達特征

2021年8月7日選擇生長一致的1年生梔子扦插苗，置于福建農林大學溫室大棚進行鹽脅迫處理。脅迫試驗共設置4個梯度（CK、LS、MS和SS），每個鹽濃度處理6盆，重復3次，共72盆。CK、LS、MS、SS 處理分別用0、50、100、200 mmol/L NaCl每天定時澆灌1次，每次每盆澆50 mL，共脅迫15 d。在脅迫結束后取功能正常無病害葉片，用液氮速凍后放入-80 ℃冰箱保存，用于測定不同鹽濃度下梔子TCP基因家族成員表達量，通過TBtools軟件繪制表達量熱圖。

1.7 梔子TCP基因順式作用元件分析

用TBtools軟件提取梔子TCP基因的上游序列（2 000 bp）作為啟動子序列，并通過在線網站Plant CARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/）預測各成員的啟動子數量，并通過TBtools軟件進行可視化分析。

2 結果和分析

2.1 梔子TCP家族鑒定分析

對梔子TCP家族理化性質分析表明，梔子氨基酸數量在183（GjTCP6）～472（GjTCP1）之間，分子質量在19 819.43 u（GjTCP6）～52 523.41 u（GjTCP1）之間。梔子TCP基因平均疏水性均小于0，表明16個基因均為親水蛋白基因。其中，GjTCP1的氨基酸數量最多，為472個，分子質量也最高，達到了 52 523.41。在亞細胞定位中，所有基因都位于細胞核中，這符合轉錄因子的特征。預測蛋白二級結構可為研究其功能及二級結構之間的相互作用模式提供理論基礎。梔子TCP二級蛋白結構主要為無規則卷曲結構為主，除GjTCP1、GjTCP2和GjTCP5這3個基因的α螺旋＜延伸鏈，其余蛋白均為無規則卷曲＞α螺旋＞延伸鏈＞β轉角（表1）。

2.2 梔子TCP家族系統進化樹分析

為研究梔子和模式植物擬南芥和水稻之間TCP基因家族的進化關系，用MAGE X將擬南芥、水稻和梔子3個物種TCP家族成員序列構建系統發育樹（圖1）。根據模式植物擬南芥TCP基因家族的分類方法，將梔子的16個序列分為3個亞家族，其中PCF亞家族有11個成員，分別是GjTCP8、GjTCP15、GjTCP13、GjTCP13、GjTCP2、GjTCP6、GjTCP9、GjTCP11、GjTCP5、GjTCP14、GjTCP16和GjTCP3；CIN亞家族有個3成員，分別是GjTCP1、GjTCP4和GjTCP7；CYC亞家族有2個成員，分別是GjTCP10和GjTCP12。

2.3 梔子TCP染色體定位

梔子16個TCP基因不均勻分布于8條染色體上。Chr9染色體中有9條基因，占總數的56.25%。剩余的7條染色體上都只各自分布1個基因，而染色體Chr3、Chr4和Chr5上則不含TCP基因成員（圖2）。

促進基因家族進化的主要原因是基因的串聯重復和片段復制。為了解梔子TCP基因家族的擴增機制，對梔子基因組復制事件進行分析。結果顯示，16個梔子TCP基因家族成員中有9個基因（GjTCP16/GjTCP3、GjTCP4/GjTCP7、GjTCP6/GjTCP8、GjTCP7/GjTCP1和GjTCP9/GjTCP11）參與了5次片段復制事件。

2.4 梔子TCP基因家族結構分析

梔子TCP基因的保守基序，保守蛋白結構域及基因結構如圖3所示。所有基因都包含TCP domain或TCP superfamily。梔子16個TCP基因共鑒定到10個保守基序。所有梔子TCP基因都含有motif1，GjTCP14、GjTCP15和GjTCP8以外的基因都含有motif2。GjTCP5和GjTCP1含有最多的motif，有6個，GjTCP8含有最少的motif，僅為1個。僅GjTCP1、GjTCP4和GjTCP7同時含有motif1、motif2、motif3和motif9，且它們同屬CIN亞家族，說明這些基因可能具有相似的功能。梔子TCP基因結構相對簡單，所有基因均有CDS（與蛋白序列一一對應的DNA序列），均在1～3個之間。

2.5 梔子TCP家族啟動子順式作用元件

為確定梔子TCP基因潛在的生物學作用，對梔子16個TCP基因進行2 000 bp啟動子順式元件分析。結果（圖4）顯示，梔子TCP基因包含了大量激素響應、光響應和脅迫響應元件。激素類響應元件中，發現了ABRE、P-box和AuxRR-core等反應元件，以ABRE元件最多；光響應元件中，發現了Box4、G-Box和I-Box等響應元件，以G-box和Box4元件數量最多；脅迫響應元件中，發現了LTR、MBS和ARE等響應元件，以MYB和Myc響應元件最多。綜上所述，推測TCP基因家族成員在植物激素響應、光響應和逆境脅迫中均發揮重要作用。

2.6 梔子TCP基因表達模式分析

將梔子鹽脅迫下表達量繪制成熱圖（圖5）。結果顯示，GjTCP8、GjTCP7、GjTCP9、GjTCP15、GjTCP2、GjTCP14、GjTCP16和GjTCP11在輕度或中度鹽脅迫表達量呈現先增加后減少的趨勢；GjTCP3和GjTCP10在輕度鹽脅迫下表達量減少，在中度鹽脅迫下增加，呈現先減后增的趨勢；GjTCP4隨著鹽脅迫程度加深其表達量遞減。此外，GjTCP6、GjTCP12和GjTCP13在重度鹽脅迫下表達量增加，分別為對照組的1.32倍、4.03倍和1.21倍。

3 討論

TCP基因家族是植物特有的轉錄因子，在植物生長、發育和脅迫響應中起著關鍵作用［16］。因此，研究TCP基因家族對梔子非生物脅迫調控機制具有重要意義。本研究在梔子基因組中共鑒定出16個TCP基因成員，比水稻（27個）、擬南芥（23個）、茄子（32個）和苦蕎（28個）、牡丹（18個）數量更少，比莧菜（14個）數量更多，這說明植物TCP基因家族成員數量在不同物種間存在差異［7-8，10，17-18］。

TCP基因家族可分為ClassⅠ和ClassⅡ兩大類，其中ClassⅡ又分CYC和TB1這2個分支［3］。梔子TCP基因家族成員也分為CIN、PCF和CYC這3個亞家族。其中CIN亞家族包含梔子TCP基因家族成員3個，PCF亞家族包含11個，CYC亞家族包含2個。16個成員均為親水蛋白，且都位于細胞核中，這與莧菜和穿心蓮TCP基因家族的報道［9，18］一致。保守基序基因結構分析顯示，16個梔子TCP基因均含有motif1，說明motif1在梔子TCP進化過程中高度保守。同亞家族的基因保守基序相似，而不同亞家族的基因保守基序有差異。在GjTCP1、GjTCP4和GjTCP7中發現共同含有motif1、 motif2、 motif3和motif9，均屬于CIN亞家族，這說明這3個基因可能具有相似的功能。染色體定位發現，梔子TCP基因成員不均勻分布在8條染色體上，梔子TCP基因家族中不存在串聯重復事件，說明梔子主要由片段復制事件為TCP家族提供進化動力。

TCP轉錄因子在非生物脅迫中具有重要調控作用［19-21］。順式作用元件分析發現，梔子TCP基因成員包含ABRE、LTR和MBS等多個與非生物脅迫應答元件，其中MYB和MYc最多，說明這些基因可能參與響應高鹽或低溫脅迫過程。結合鹽脅迫下基因表達模式，多數TCP基因在輕度及中度鹽脅迫下響應表達，在重度鹽脅迫下被抑制，部分TCP基因在重度鹽脅迫下高表達，這說明梔子TCP轉錄因子在鹽脅迫中具有重要調控作用。已研究表明，水曲柳中FmTCP4基因對冷、鹽、旱等非生物脅迫響應，說明其參與了水曲柳的生長發育和逆境平衡；沙棘TCP轉錄因子同樣也受到干旱、高鹽和激素誘導表達，進而調控沙棘對干旱脅迫的響應；馬鈴薯TCP基因在鹽和甘露醇脅迫下表達量下調［22-24］。本研究中，GjTCP4隨著鹽脅迫程度加深其表達量遞減。系統進化樹顯示，OsTCP1與GjTCP4為同源基因，OsTCP1在水稻中對干旱和鹽脅迫中表現出強烈的響應，推測GjTCP4在鹽脅迫中也具有重要調控作用［25］。此外，GjTCP13、GjTCP12和GjTCP6在重度脅迫下表達量上調顯著，推測其可能梔子耐鹽調控的關鍵基因。

綜上所述，本研究共鑒定出16個梔子TCP基因成員。它們在不同程度鹽脅迫下均有響應。研究結果可為進一步研究梔子TCP基因家族及鹽脅迫下分子機制提供參考，對梔子鹽堿品種培育具有重要意義。

參考文獻：

［1］那 莎，郭國田，王宗殿，等. 梔子及其有效成分藥理研究進展［J］. 中國中醫藥信息雜志，2005，12（1）：90-92.

［2］李 燦，翁殊斐，秦昊林，等. 5種熱帶花灌木對旱澇脅迫的生理和形態響應及園林應用［J］. 云南農業大學學報（自然科學），2020，35（2）：318-323.

［3］Martín-Trillo M，Cubas P. TCP genes：a family snapshot ten years later［J］. Trends in Plant Science，2010，15（1）：31-39.

［4］Doebley J，Stec A，Hubbard L. The evolution of apical dominance in maize［J］. Nature，1997，386（6624）：485-488.

［5］Luo D，Carpenter R，Vincent C，et al. Origin of floral asymmetry in Antirrhinum［J］. Nature，1996，383（6603）：794-799.

［6］Lin Y F，Chen Y Y，Hsiao Y Y，et al. Genome-wide identification and characterization of TCP genes involved in ovule development of Phalaenopsis equestris［J］. Journal of Experimental Botany，2016，67（17）：5051-5066.

［7］Yao X，Ma H，Wang J，et al. Genome-wide comparative analysis and expression pattern of TCP gene families in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa［J］. Journal of Integrative Plant Biology，2007，49（6）：885-897.

［8］楊 婷，黎 成，申佳瑜，等. 茄子TCP基因家族全基因組的鑒定與分析［J］. 生物工程學報，2022，38（8）：2974-2988.

［9］張 龍，徐世強，李靜宇，等. 穿心蓮TCP基因家族全基因組鑒定及非生物脅迫下的表達分析［J］. 中國中藥雜志，2024，49（2）：379-388.

［10］楊蘭鋒，朱旭東，周賓寒，等. 苦蕎TCP轉錄因子全基因組鑒定及非生物脅迫分析［J］. 廣西植物，2024（7）：1364-1376.

［11］Resentini F，Felipo-Benavent A，Colombo L，et al. TCP14 and TCP15 mediate the promotion of seed germination by gibberellins in Arabidopsis thaliana［J］. Molecular Plant，2015，8（3）：482-485.

［12］Hervé C，Dabos P，Bardet C，et al. In vivo interference with AtTCP20 function induces severe plant growth alterations and deregulates the expression of many genes important for development［J］. Plant Physiology，2009，149（3）：1462-1477.

［13］Aguilar-Martínez J A，Sinha N.Analysis of the role of Arabidopsis classⅠ TCP genes AtTCP7，AtTCP8，AtTCP22，and AtTCP23 in leaf development［J］. Frontiers in Plant Science，2013，4：406.

［14］Shi P B，Guy K M，Wu W F，et al. Genome-wide identification and expression analysis of the ClTCP transcription factors in Citrullus lanatus［J］. BMC Plant Biology，2016，16：85.

［15］Liu Y Y，Wu C，Hu X，et al. Transcriptome profiling reveals the crucial biological pathways involved in cold response in Moso bamboo （Phyllostachys edulis）［J］. Tree Physiology，2020，40（4）：538-556.

［16］魏 娜，李艷鵬，馬藝桐，等. 全基因組水平紫花苜蓿TCP基因家族的鑒定及其在干旱脅迫下表達模式分析［J］. 草業學報，2022，31（1）：118-130.

［17］張延召，羅 新，李會云，等. 牡丹TCP家族基因的鑒定與生物信息學分析［J］. 分子植物育種，2022，20（1）：31-37.

［18］安子賢，李宜軒，鄭友峰，等. 基于莧菜轉錄組的TCP基因家族成員鑒定及表達分析［J］. 福建農業學報，2022，37（7）：869-879.

［19］Lei N，Yu X，Li S X，et al. Phylogeny and expression pattern analysis of TCP transcription factors in cassava seedlings exposed to cold and/or drought stress［J］. Scientific Reports，2017，7（1）：10016.

［20］Xu Y M，Xiao X M，Zeng Z X，et al. BrTCP7 transcription factor is associated with MeJA-promoted leaf senescence by activating the expression of BrOPR3 and BrRCCR［J］. International Journal of Molecular Sciences，2019，20（16）：3963.

［21］李曉靜，李圣龍，岳亮亮. 石榴TCP基因家族的生物信息學與表達分析［J］. 江蘇農業科學，2024，52（1）：41-48.

［22］劉春浩，梁楠松，于 磊，等. 水曲柳TCP4轉錄因子克隆及脅迫和激素下的表達分析［J］. 北京林業大學學報，2017，39（6）：22-31.

［23］姚 瑩，王 偉，孫永媛，等. 沙棘HrTCP轉錄因子家族鑒定及其干旱脅迫下的表達分析［J］. 西北植物學報，2021，41（4）：576-584.

［24］馮建英，李立芹，李佳皓，等. 馬鈴薯TCP家族轉錄因子鑒定與表達模式分析［J］. 基因組學與應用生物學，2021，40（增刊2）：2756-2764.

［25］Gull S，Uddin S，Hussain H A，et al. Genome-wide analysis reveals the TCP-miR159-miR319 module is crucial for rice （Oryza sativa L.） growth and response to drought and salinity［J］. Plant Stress，2023，10：100215.