丹參SmDREB2A基因的克隆與抗鹽功能鑒定

摘要：DREB家族基因是研究植物非生物脅迫的重要轉錄因子之一。利用基因克隆技術和丹參遺傳轉化體系對丹參SmDREB2A基因進行克隆和功能驗證，同時對其進行生物信息學分析和熒光定量PCR（qRT-RCR）分析。結果表明，丹參SmDREB2A開放閱讀框（ORF）全長為1 014 bp，編碼氨基酸337個，等電點為5.00；丹參SmDREB2A蛋白為不穩定親水蛋白，定位于細胞核，不存在信號肽區域及跨膜區域；丹參與紫蘇親緣關系較近。qRT-PCR分析顯示，鹽脅迫能顯著誘導SmDREB2A基因的表達，轉基因丹參抗鹽性鑒定顯示鹽脅迫下過量表達SmDREB2A基因能夠提高丹參的耐鹽性。這是首次從丹參中克隆出SmDREB2A基因，獲得了轉基因丹參植株，驗證了SmDREB2A基因參與了丹參逆境脅迫下的表達，為培育丹參抗逆品種提供了參考依據。

關鍵詞：丹參；DREB轉錄因子；基因克??；轉基因；抗性鑒定；鹽脅迫

中圖分類號：S567.5+30.1" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0133-08

收稿日期：2024-09-18

基金項目：國家現代農業產業技術體系建設專項（編號：CARS-21）；河北省科技計劃（編號：22326301D）；河北省重大科技支撐計劃（編號：242N6402Z）；新疆維吾爾自治區科技援疆計劃（編號：2024E02012）；新疆維吾爾自治區科技特派員農村科技創業行動項目（編號：2024KZ008）。

作者簡介：歐陽艷飛（1989—），男，河北武強人，碩士，助理研究員，主要從事中藥資源開發利用及分子生藥學研究。E-mail：1411424695@qq.com。

通信作者：姜 濤，博士，副研究員，主要從事藥用植物育種等研究。E-mail：jttaojiang@163.com。

丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）是唇形科鼠尾草屬多年生雙子葉草本植物，其根及根莖部位有著重要的藥用價值，是我國常用的大宗中藥材之一，最早于《神農本草經》中有記載，其應用歷史已有 2 000 多年［1］。丹參味微苦，略寒，其主要功能有通經活血、安神養血、清心除煩、祛瘀止痛等［2］，臨床上廣泛用于肝硬化、心腦血管疾病、抗腫瘤及新生兒缺氧性腦疾病等的治療及預防，具有廣泛的應用前景，也是現代中藥藥理研究的熱門對象［3-10］。

DREB轉錄因子是一類含有AP2/ERF結構域的調控因子，通過結合上下游基因的啟動子區域，調控相關基因的表達參與了植物的抗逆應答機制。它由4個功能區組成，分別包括核定位信號區、轉錄調控區、DNA結合區和寡聚化位點［11］。DREB轉錄因子通過其功能域與其他蛋白質靶基因啟動子相互作用調控基因的表達［12］。植物DREB家族基因AP2/ERF保守結構域是由60～70個氨基酸組成，其14位的纈氨酸和19位的谷氨酸影響著該轉錄因子與順式作用元件的結合［13-14］。DREB家族有6個（A1～A6）亞族，其中亞族A1主要參與了水稻（Oryza sativa）冷脅迫反應［15］，亞族A2主要參與了高粱干旱和高鹽應激調節［16］。亞族A3～A6主要與植物的生長發育和非生物脅迫有關，研究發現，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的A5亞族基因DEAR4參與了植物葉片衰老調控，其表達受激素脫落酸（ABA）和非生物脅迫干旱影響［17］；菊花中的CmDREB6基因過表達可提高菊花的抗逆性［18］，擬南芥的A6家族成員中的RAP2.4基因可在干旱條件下促進葉片表皮蠟的合成［19］。

DREB家族基因參與了植物生長發育調控和逆境脅迫響應機制，已從泰山海棠［20］、甜葉菊［21］、月季［22］和紫花苜蓿［23］等植物中克隆出來并進行了功能研究，結果顯示，DREB基因受非生物脅迫誘導參與了下游基因的表達，提高了植物的抗逆性。目前關于丹參DREB家族基因的研究尚未報道，本研究以丹參DREB轉錄因子為研究對象，對丹參SmDREB2A基因進行克隆和生物信息學分析，利用丹參遺傳轉化體系獲得丹參轉基因植株，解析SmDREB2A基因調控丹參逆境響應的分子機制，為丹參的抗逆性選育提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料于2023年11月采自河北省藥用植物中心丹參種質資源圃，取新鮮干凈葉片，置于液氮中，-80 ℃保存，作為提取丹參總RNA的材料。RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒、質粒提取試劑盒、熒光定量試劑盒等均購自天根生化科技（北京）有限公司；2×Taq Plus MasterMix、pMD19-T載體、大腸桿菌DH5α和農桿菌EHA105購自北京蕾創生物科技有限公司；質粒pCambia1300-GFP來自于中國農業大學。

1.2 丹參RNA的提取和cDNA的合成

取適量的丹參幼嫩葉片液氮研磨至細碎粉末，按照天根生化科技（北京）有限公司的RNA提取試劑盒提取丹參總RNA，檢測合格后根據cDNA反轉錄試劑盒基因擴增的反應條件進行試驗操作，將RNA反轉錄成cDNA。

1.3 丹參DREB基因的cDNA序列克隆

依據丹參轉錄組數據庫，利用軟件Primer 5.0設計SmDREB2A基因特異性引物SmDREB2A-F和SmDREB2A-R，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成部進行引物的合成（表1）。以丹參cDNA為模板，擴增SmDREB2A基因全長。總擴增體系 20 μL，其中2×Taq Plus MasterMix 10μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 8 μL。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，目的片段膠回收后與pMD19-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，培養過夜，挑取陽性克隆進行PCR檢測并送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。

1.4 丹參SmDREB2A基因cDNA序列的生物信息學分析

將測序得到的丹參SmDREB2A基因序列進行Blast比對，利用ORFFinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線分析工具查找SmDREB2A序列開放閱讀框；利用在線軟件ExPASy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）、ExPASy-ProScale（https：//web.expasy.org/protscale/）對其理化性質和親疏水性進行分析；利用Conserved Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）軟件分析結構域；利用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1 /）和TMHMM 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM/）對其序列信號肽和跨膜結構進行分析；利用NetNGlyc 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）、NetPhos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在線分析其磷酸化和糖基化位點，以及PSORT Prediction（http：//psortl .hgc.jp/form.html）預測SmDREB2A的氨基酸序列亞細胞定位；利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODLE（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）預測SmDREB2A蛋白的二、三級結構；利用軟件DNAMAN和MEME（http：//meme-suite.org/）對SmDREB2A基因cDNA編碼氨基酸序列進行多序列比對并分析其保守基序；用軟件MEGA 11.0對基因SmDREB2A編碼的氨基酸序列進行系統進化樹分析；利用軟件CodonW和EMBOOS（http：//www.bioinfbrmatics.nl/cgi-bin/emboss/cusp）對SmDREB2A基因的cDNA序列進行密碼子偏好性分析。

1.5 丹參SmDREB2A基因表達分析

對丹參開展NaCl逆境處理，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析丹參SmDREB2A基因表達情況，以丹參肌動蛋白基因Actin為內參基因，利用在線軟件Primer 3 Input （version 3）設計熒光定量PCR引物SmDREB2A-QF和SmDREB2A-QR（表1），進行熒光定量PCR試驗，qRT-PCR反應體系如下：10 μL PerfectStart Green qPCR SuperMix，0.4 μL引物-F，0.4 μL 引物-R，2.0 μL cDNA （1 ng），7.2 μL ddH2O，3次重復，分析丹參SmDREB2A基因在丹參不同組織部位和逆境下的表達量。

1.6 轉SmDREB2A基因丹參植株的獲得及抗性鑒定

將SmDREB2A基因的CDS序列構建到植物過量表達pCambia1300-GFP載體上，獲得含有CaMV 35S啟動子的pCB-SmDREB2A過量表達載體。將含有pCB-SmDREB2A的重組質粒轉入到農桿菌中，利用葉盤轉化法將獲得重組質粒的農桿菌介導到丹參中，經過共培養、選擇培養和不定根培養獲得轉基因植株。利用qRT-PCR法對轉基因植株進行鑒定，將獲得的轉SmDREB2A基因陽性植株和對照植株培養6個星期后，用NaCl（0.4%）進行逆境處理7 d，利用分光光度計測定SOD活性、MDA和AsA含量，驗證其功能。

2 結果與分析

2.1 丹參SmDREB2A基因cDNA序列克隆及分析

提取丹參總RNA，對其質量、濃度進行測定，結果發現條帶清晰，無彌散拖尾跡象，且RNA的D260 nm/280 nm在1.9～2.0范圍，說明提取的丹參總RNA質量較好，可以滿足后續基因擴增的需要。根據丹參轉錄組DREB2A序列信息設計引物，PCR擴增后獲得特異性目的條帶在1 000 bp附近（圖1-A）。將丹參DREB2A目的片段用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收特異性序列，連接轉化選取陽性克隆測序，結果顯示丹參DREB基因開放閱讀框（ORF）全長為1 014 bp，命名為SmDREB2A，其編碼氨基酸有337個（圖1-B）。

2.2 丹參SmDREB2A蛋白理化性質分析和結構預測

2.2.1 丹參SmDREB2A蛋白理化性質分析

利用ProtParam分析SmDREB2A蛋白的理化性質，結果發現該蛋白分子式為C1 588H2 528N462O532S16，理論相對分子質量為37.12 ku，等電點為5.00，不穩定指數和親水性總平均值分別為43.01和-0.766lt;0，分析顯示SmDREB2A為不穩定性親水蛋白。該基因編碼氨基酸中，帶負電荷殘基（Asp+Glu）和帶正電荷殘基（Arg+Lys）分別為59、47個，其中絲氨酸（Ser）殘基數量最高，高達9.80%，而組氨酸數量最少，僅有總數的0.90%。

利用NCBI網站中的Conserved Domains進行蛋白保守結構域分析發現，SmDREB2A蛋白中具有參與轉錄調節的DREB轉錄因子包含結構域，其中包括APETALA2和EREBP結構域，該結構域屬于AP2超家族，通常與植物的非生物脅迫相關，在低溫、鹽脅迫和病害等逆境脅迫下參與信號通路間的相互調節作用。通過ExPasy-ProtScale分析發現，StL3OH蛋白親/疏水性存在明顯差異：第325個和第326個氨基酸的親水性表達量達到了1.711，第23個氨基酸的親水性則達到了-3.478（圖2-A）。根據氨基酸序列的預測，這種基因所編碼的肽鏈中的氨基酸多數具有親水特征，結合前期對該蛋白質理化性質的預測，可猜測該基因編碼的蛋白為一種親水性蛋白質。

利用SignaIP 4.1 Server和TMHMM 2.0 Server分析和預測該蛋白的信號肽和其跨膜結構，結果表明該蛋白無信號肽，可能為非分泌蛋白；無跨膜結構域，為非跨膜蛋白。利用NetPhos 3.1 Server分析發現，丹參SmDREB2A蛋白含有73個超過閾值線的潛在磷酸化位點，包含57個絲氨酸（S）、13個蘇氨酸（T）、3個酪氨酸（Y）（圖2-B），主要涉及到蛋白激酶C（PKC）、蛋白激酶A（PKA）、絡蛋白激酶Ⅱ（CKⅡ）、絲氨酸/蘇氨酸激酶（RSK）、unsp等多種特異性蛋白激酶結合位點。通過在線軟件NetNGlyc 1.0 Server預測SmDREB2A蛋白存在2個糖基化位點（274，287）。用PSORT Prediction在線預測SmDREB2A蛋白位于細胞核上的可能性最大，定位其細胞核、葉綠體、細胞質K值分別為10、2、2。這可能與DREB轉錄因子中調節機制相關。

2.2.2 丹參SmDREB2A蛋白結構預測

用在線軟件SOPMA分析SmDREB2A蛋白的二級結構發現，不規則曲線占比為59.94%，其次是α-螺旋、β-轉

角、延伸鏈，分別占31.45%、4.45%、4.15%（圖3-A）。用在線軟件SWISS-Model預測SmDREB2A蛋白的三級結構，以乙烯反應性元素結合因子1為模板對其建模，用于建模的氨基酸殘基為81～138位，結果如圖3-B所示，序列相似度達67.24%。

2.3 丹參SmDREB2A基因編碼氨基酸序列比對及保守基分析

利用NCBI中的BLASTp對SmDREB2A進行同源性比對，結果發現丹參SmDREB2A蛋白與一串紅（Salvia splendens，XP042030811.1）、紫蘇（Perilla frutescens，KAH6802258.1）、猴面花（Erythranthe guttata，XP_012858842.1）、泡桐（Paulow niafortunei，KAI3458489.1）、芝麻（Sesamum indicum，XP011076647.1）具有較高同源性，其中與紫蘇編碼蛋白（KAH6802258.1）相似度最高，可達72.73%，與一串紅、刺桐、泡桐、芝麻比對的相似度分別為71.88%、57.94%、55.65%、58.33%（圖4）。

使用MEME（5.1.1）軟件對6種植物基因氨基酸序列的保守基序進行分析，并將參數排名前九的基序進行比較，結果表明這些基序的長度分別為50、50、40、39、27、23、20、20和8（圖5），這些基序很可能是蛋白質的功能位點。

2.4 丹參SmDREB2A基因系統進化樹分析

利用MEGA 11.0軟件構建系統進化樹，結果表明，丹參SmDREB2A基因與紫蘇基因匯于一支，表明親緣關系較近。同時比較各物種間的遺傳進化距離，結果顯示，紫蘇基因與丹參的遺傳距離最近，相差0.07，且其置信度可達90%，在同一分支上馬鈴薯與丹參遺傳距離最遠，再次說明丹參與紫蘇基因的相似性很高（圖6）。

2.5 丹參SmDREB2A基因cDNA序列密碼子分析

利用CodonW和EMBOSS在線軟件分析丹參SmDREB2A基因cDNA序列的密碼子偏好性，結果顯示其適應指數（codon adaptation index，CAI）為0.18，有效密碼子數（effective number of codons，ENC）為56.98，說明密碼子使用偏好性較弱?？侴C含量為0.483 2，各位置的GC含量（GC1s、GC2s、GC3s）分別為55.03%、44.97%、44.97%，說明該基因編碼區的G/C含量要低于A/T含量。用同義密碼子相對使用度（relative synonymou codon usage，RSCU）來判斷密碼子偏好性，當RSCU值超過1時，密碼子具有偏好性，共有25個密碼子RSCU值超過1，其中18個密碼子以A/T（U）結尾，7個以G/C結尾（表2），說明丹參SmDREB2A基因偏好使用A/T（U）結尾的密碼子。

根據Codon Usage Database和EMBOSS-CHIP數據庫查找煙草（Nicotiana tabacum L.，Nt）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，At）、大腸桿菌（Escherichia coli，Ec）3種模式生物的基因組密碼子使用頻率，分析丹參SmDREB2A基因密碼子使用頻率，計算丹參SmDREB2A基因與煙草、擬南芥、大腸桿菌密碼子使用頻率的比值，結果（表3）發現，丹參SmDREB2A基因與煙草、擬南芥、大腸桿菌的密碼子差異大的個數依次為13、14、29，預測煙草轉化體系適合丹參SmDREB2A基因的遺傳轉化。

2.6 丹參SmDREB2A基因表達量分析

qRT-PCR分析SmDREB2A基因在丹參不同組織部位中的表達水平，結果顯示，SmDREB2A基因在丹參根中的表達量高于在莖和葉中的表達量，差異不顯著（圖7-A）。qRT-PCR分析NaCl逆境下的SmDREB2A基因相對表達量，試驗結果顯示，在NaCl處理6 h后 SmDREB2A基因量上升，處理48 h后其相對表達量較高，隨后SmDREB2A基因表達量開始下降（圖7-B），表明SmDREB2A響應了NaCl的誘導表達，參與了丹參逆境脅迫的調控反應機制。

2.7 轉SmDREB2A基因丹參抗鹽性鑒定

通過丹參遺傳轉化體系獲得了轉SmDREB2A基因丹參陽性植株（OE1、OE2、OE3），將轉基因植株和非轉基因植株培養1個月后取整株提取RNA，qRT-

PCR測定SmDREB2A基因的表達量。結果表明，轉基因陽性丹參中SmDREB2A基因的表達量顯著高于非轉基因植物冀丹4號，差異顯著（圖8-A）。將轉基因丹參植株和非轉基因丹參植株在溫室培養1個月后進行鹽脅迫處理，由圖 8-B可知，鹽脅迫下轉SmDREB2A基因丹參的生長發育狀態和生根情況優于對照丹參；同時陽性丹參植株中SOD活性和抗壞血酸（AsA）含量顯著高于對照，MDA含量顯著低于對照（圖8-C、D、E），結果顯示過量表達SmDREB2A基因能夠提高丹參的抗逆性。

3 討論

植物在整個生育期中會受到各種逆境脅迫影響，如鹽堿、寒冷、干旱、高溫等，為了適應逆境環境，抵御各種脅迫對植物帶來的損傷，植物通過體內的信號轉導網絡調控基因的表達適應外界的逆境條件［24］。DREB家族轉錄因子是一類抗逆應答元件的結合蛋白，可特異性與基因啟動子區域的順式作用元件結合，在信號傳導中誘導下游基因功能表達，在高低溫、鹽堿、干旱等脅迫的分子反應中發揮重要作用［25］。研究顯示，草莓［26］（Fragaria ananassa）、谷子［27］（Setaria italica Beauv.）、辣椒［28］（Capsicum annuum L.）及馬鈴薯［29］（Solanum tuberosum）等都已鑒定出DREB家族。

本研究利用實驗室構建的丹參轉錄組數據庫序列信息，基于基因克隆技術，成功地獲得了丹參SmDREB2A基因ORF序列；通過預測分析丹參SmDREB2A基因的蛋白理化性質、蛋白質磷酸化位點，推測在丹參SmDREB2A蛋白中發生以絲氨酸為主的磷酸化修飾；通過對SmDREB2A蛋白質信號肽、跨膜結構及亞細胞定位預測發現，該蛋白不存在信號肽，可能屬于非分泌蛋白；蛋白系統進化樹構建結果顯示，丹參SmDREB2A蛋白與紫蘇蛋白聚類到一起，可信度達90% ，說明SmDREB2A蛋白在生物進化過程中還是比較保守的，這為將來深入研究DREB基因功能提供了參考依據。

實時熒光定量試驗結果表明，丹參SmDREB2A基因響應鹽脅迫的誘導，并存在顯著性差異，這可能與丹參響應逆境脅迫機制相關。研究發現，水稻中DREB轉錄因子OsDREB1F基因響應ABA的誘導和冷、鹽、干旱脅迫，在擬南芥中過表達OsDREB1F基因，提高了擬南芥對鹽、干旱和低溫的抗逆性［30］；有學者研究將蘋果中ＭdCBF1基因轉入野生擬南芥中，發現轉基因擬南芥的耐低溫脅迫能力顯著提高［31］；DREB1A基因能夠誘導擬南芥 PIP1-1 基因表達，在鹽環境下提高擬南芥的抗逆性［32］。在逆境脅迫下誘導基因的表達主要發生在轉錄調控水平，植物脅迫應答的重要過程就是轉錄因子激活或抑制逆境脅迫相關基因的表達，本研究對DREB轉錄因子進行克隆，利用丹參遺傳轉化體系成功獲得了轉SmDREB2A基因丹參植株，驗證了該基因在丹參抗逆性中的作用機制，為篩選優質抗逆藥用種質資源、培育藥用植物抗逆新品種提供了理論參考依據。

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