多花黃精PcWRKY1基因的克隆及響應高溫脅迫功能分析

摘要：探究WRKY轉錄因子家族在多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）適應高溫脅迫中的作用，基于前期轉錄組分析鑒定到受高溫影響顯著下調的基因PcWRKY1，克隆了PcWRKY1基因，并利用生物信息學、RT-qPCR和玉米原生質體瞬時轉化體系等技術對其編碼蛋白的基本特性、組織表達特異性、高溫脅迫下表達模式及功能進行了分析。結果顯示：PcWRKY1基因CDS序列全長共1 560 bp，編碼519個氨基酸；PcWRKY1蛋白沒有跨膜結構，分子量為 56.93 ku，等電點為7.2，具有2個WRKY保守結構域，屬于Group Ⅰa類群；RT-qPCR分析結果顯示，PcWRKY1基因在多花黃精不同組織中均有表達，且在種子中表達量最高，其轉錄水平受高溫脅迫的抑制；玉米原生質體中PcWRKY1定位于細胞核中，且高溫處理不影響其位點；在玉米原生質體中瞬時過表達PcWRKY1，與無高溫脅迫相比，抑制了過氧化氫酶（CAT）活性的增加，提高了高溫脅迫誘導的丙二醛（MDA）含量的增加，說明過表達PcWRKY1降低了原生質體在高溫脅迫下的耐性。綜上所述，PcWRKY1可能在多花黃精響應高溫脅迫中起負調控作用。

關鍵詞：多花黃精；WRKY轉錄因子；高溫脅迫；生物信息學分析；功能分析

中圖分類號：S188；S567.23+9.01" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0200-09

收稿日期：2024-10-29

基金項目：國家重點研發計劃（編號：2022YFD1601808）；國家現代農業產業技術體系建設專項（編號：CARS-21）；河南省現代農業產業技術體系建設專項（編號：HARS-22-11-G2）。

作者簡介：賈 慧（1999—），女，河南滎陽人，碩士研究生，主要從事中藥資源學研究。E-mail：2396554366@qq.com。

通信作者：臘貴曉，博士，副研究員，主要從事中藥材生態栽培、育種等研究。E-mail：zju-1@163.com。

多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）為百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygonatum）多年生草本植物，其根莖常被用作藥物和食物，具有降低血糖、抗癌、調節免疫力及抑菌等功效，是《中華人民共和國藥典》收錄的3種藥用黃精之一［1-2］。近年來，隨著對多花黃精的藥用價值和營養保健等功能的逐步挖掘，其原料的需求量也日益增加，致使價格不斷上漲，供不應求。但掠奪式的采挖方式導致自然資源枯竭，野生產能急劇下降，遠不能滿足市場需求，因此，越來越多的人開始選擇人工種植多花黃精［3］。

隨著溫室氣體濃度的逐年上升，全球氣候日益變暖，極端高溫的發生更為頻繁、強度更強、持續時間更久［4］。氣溫升高已成為限制植物生長和產量的主要非生物脅迫之一。當植物遭受高溫脅迫時，常常會對其生理、生化和發育造成嚴重的影響。例如高溫使蛋白質變性、聚集和降解，同時抑制蛋白質的合成，加速活性氧（ROS）的產生和葉綠素降解，增加膜脂的流動性和滲透性，引起細胞器的功能紊亂，加速細胞衰老，引起植物光合作用器官的提前衰老等［5- 9］。而多花黃精作為中性需光植物，喜陰涼和濕潤的環境，但極端高溫災害事件的頻發，給多花黃精種植帶來極大阻礙。大田栽培過程中，夏季的極端高溫天氣會對多花黃精造成高溫脅迫，從而引起植物細胞膜損傷，損害葉綠體結構導致凈光合速率下降，影響其根莖生長和有效活性成分的積累，嚴重的還會使多花黃精提前倒伏、病蟲害加重甚至整株死亡［10-11］。但是，目前對多花黃精在響應高溫脅迫中的研究少之又少。因此，克隆調控多花黃精耐熱性相關的基因，并解析其在高溫脅迫的作用機制，不但有助于對多花黃精耐熱機制的理解，而且可以為多花黃精分子輔助育種提供新的理論依據。

研究報道，植物可以通過調控許多轉錄因子（TF）進而調控相關基因的表達，從而參與對外界脅迫的響應，如MYB、AP2/ERFBP、NAC和WRKY［12］。而植物特異性WRKY轉錄因子是一種研究最為廣泛的基因轉錄因子家族之一，能夠響應不同非生物脅迫（寒冷、干旱、UV-B、高溫、鹽和堿性環境），并且通過結合下游基因啟動子的W-box順式作用元件，以作為靶基因表達的抑制因子和激活因子，并在關鍵信號通路發揮重要作用［13］。AtWRKY57可以直接與RD29A和NCED3啟動子區域的W-box結合，上調了這2個脅迫基因的表達，而且擬南芥過表達植株的耐旱性也得到了增強［14］；棉花中GhWRKY17的轉錄水平受到干旱脅迫、鹽脅迫和H2O2的誘導，從而有可能調控下游耐性基因的表達增強其耐性［15］；通過UV-B輻射處理，可以誘導擬南芥中3個AtWRKY基因和水稻中OsWRKY89的表達，而它們通過調控蠟質物質合成的基因從而使其在葉片表面產生較厚的蠟質物質，提高了對高溫的耐受性［16-17］。此外，越來越多的研究表明WRKY家族參與了植物對高溫脅迫的響應，當植物受到高溫脅迫時，其通過調控多種途徑的下游靶基因的表達，從而響應外部脅迫［18-19］。

目前，有關多花黃精WRKY轉錄因子的報道尚不多見，并且在高溫中的功能也并不清楚。因此，本研究以前期多花黃精在轉錄組學中鑒定得到的顯著受高溫下調的PcWRKY1為研究對象（數據未發表）為基礎，克隆其基因編碼序列的全長，并利用生物信息學分析其基因，同時探究其在不同組織、高溫脅迫處理后的表達模式；同時，又利用玉米原生質體瞬時轉化體系對其正常條件和高溫脅迫下亞細胞定位和生理指標進行分析，初步確定PcWRKY1在高溫下的功能。以期對進一步研究PcWRKY1在高溫中功能及其作用機制奠定基礎，也為培育耐熱性強、適應性廣的優良多花黃精新品種提供優良的基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以2年生多花黃精根莖為無性繁殖材料，于2023年10月種植于河南省農業科學院現代農業科技試驗示范基地的多花黃精為試驗材料，用于基因的克隆、表達模式分析；質粒pCAMBIA1302-GFP由河南農業大學胡秀麗教授提供，用于亞細胞定位和瞬時過表達；暗培養的玉米自交系B73的第2張完全展開葉，用于提取玉米原生質體。

試驗試劑：KOD OneTM PCR Master Mix-Blue高保真酶（貨號：KMM-201，TOYOBO，上海），RNA提取試劑盒（貨號：R6827-01，Omega Bio-Tek，廣州）、HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper） 逆轉錄試劑盒（貨號：R212-01，諾唯贊，南京）、小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（貨號：ZP202-2，莊盟，北京）、Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix熒光定量試劑盒（貨號：Q712-02，諾唯贊，南京）、限制性內切酶（NEB，美國）、一步法無縫克隆試劑盒（貨號：10923ES50，翊圣，上海）、大腸桿菌DH5α感受態（貨號：DL1001，唯地，上海）、質粒小提試劑盒（貨號：DP103，天根，北京）、無內毒素質粒大提試劑盒（增強型）（貨號：DP120，天根，北京）、纖維素酶Cellulose R-10（貨號：MX7352，Yakult，日本）、離析酶Macerozyme R-10（貨號：MX7351，Yakult，日本）、丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒（貨號：BC0025，索萊寶，上海）和過氧化氫酶（CAT）活性檢測試劑盒（貨號：BC0205，索萊寶，上海），其他試劑均購自索萊寶。

1.2 PcWRKY1基因的克隆及生物信息學分析

1.2.1 基因克隆 以有1個完整頂芽的多花黃精根莖（2年生）為無性繁殖材料培育的多花黃精幼苗的葉片、根、莖和塊莖的混合材料為基礎，利用RNA提取試劑盒提取總RNA，使用逆轉錄試劑盒逆轉錄生成cDNA；根據轉錄組所提供的臨時轉錄本為參考，設計特異性引物（F：5′-ATGGCTTCTTCAACTGGGAGTTT-3′，R：5′-TTAACATAGCAGCGATTCGATGAACA-3′），使用高保真酶進行PCR擴增，擴增程序為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，68 ℃ 10 s，共計35個循環；68 ℃、10 min，4 ℃保存；使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行電泳檢測，檢測無誤后利用膠回收試劑盒切膠回收，回收產物送到生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序（試劑盒具體操作步驟見說明書）。

1.2.2 生物信息學分析 通過相關的在線生信網站（表1）對測序獲得PcWRKY1基因編碼蛋白的氨基酸數目、蛋白相對分子質量、等電點、蛋白的親疏水性、跨膜區域、蛋白結構域和蛋白的二級、三維結構等；利用軟件MEGA 8.0和在線網站對其同源蛋白序列進行進化樹分析。

1.3 材料處理

1.3.1 組織特異性表達分析 2024年6月，取種植在現代農業科技試驗示范基地中多花黃精的根、莖、葉、塊莖以及保存的種子為試驗材料，取樣后用液氮速凍放置于-80 ℃保存。

1.3.2 高溫脅迫處理 2024年6月，取種植在現代農業科技試驗示范基地中多花黃精幼苗，移栽入新的花盆中，在人工氣候箱中進行培養（培養溫度為白天28 ℃/夜晚22 ℃，光照14 h—黑暗 10 h），培養幼苗株高至20 cm左右，選取生長狀態一致的幼苗進行高溫脅迫處理。高溫處理采取2種不同的處理方法：直接高溫處理，處理的溫度為40 ℃，高溫處理的時間為0、0.5、1、2、4、8、10 h；模擬大田高溫處理的方法為采用梯度升溫的方法，以2 ℃/h的升溫速度從28 ℃上升到40 ℃，并在40 ℃維持 2 h，共計高溫脅迫處理8 h。取樣后用液氮速凍放置于 -80 ℃ 保存；原生質體的高溫脅迫處理條件是 38 ℃、30 min。

1.3.3 實時熒光定量PCR分析 對所需進行表達模式分析的材料利用RNA提取試劑盒提取RNA，經檢驗合格后逆轉錄合成cDNA。利用Primer Premier 6.0設計所需特異性引物（F：5′-ATCCTCCATCTCTCCCGA-3′，R：5′-CCTCTTTGACGCCTTGCT-3′），使用SYBR Green熒光染料、Step One Plus熒光定量PCR儀（ABI，USA）進行RT-qPCR檢測，用2-ΔΔCT法計算相對表達量數值。PcGAPDH為本試驗的內參基因（F：5′-CCATGGTCAACGTCGGAATC-3′，R：5′-GCGAAGATGTGGATGGCTTT-3′）。

1.4 PcWRKY1基因的瞬時過表達載體的構建

使用同源重組的方法進行載體的構建。用限制性內切酶NcoⅠ和SpeⅠ將pCAMBIA1302-GFP的質粒進行雙酶切，完全酶切后純化回收并與純化回收的PcWRKY1基因進行酶連，體系為：3 μL的PcWRKY1基因擴增產物、2 μL回收后的酶切產物、5 μL 的同源重組酶，條件為：50 ℃、15 min。然后，將連接產物利用熱激法轉化至大腸桿菌DH5α感受態后加入800 μL無抗性的LB培養基，37 ℃、220 r/min 活化1 h；涂于相應抗性的LB固體平板，37 ℃培養至單菌落形成；在超凈工作臺中挑取陽性單菌落至1 mL相應抗性的LB培養液中，37 ℃、220 r/min 擴搖 16 h 后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結果使用DNAman 8.0軟件進行序列比對，比對結果無誤的菌液加入終濃度為25%的甘油置于-80 ℃冰箱保存，用于后續研究。其中PcWRKY1基因擴增的同源重組引物為F：5′-acgggggactcttgaccatggaaATGGCTTCTTCAACTGGGAGTTT-3′，R：5′-aagttcttctcctttactagtACATAGCAGCGATTCGATGAACA-3′。

1.5 玉米原生質體的提取和轉化

玉米原生質體的提取和轉化參照Zhao等的方法［20］。

1.5.1 原生質體的提取 剪下玉米黃化苗（從玉米幼苗出土后約5 cm后置于黑暗條件下培養10～12 d）的第2張葉片，用鋒利的刀片將其切成1～2 mm 的細絲，然后浸入20 mL的酶解液中［1.5%（質量體積比） 纖維素酶、0.3%（質量體積比）離析酶、600 mmol/L甘露醇、1 mmol/L MES（一水合物）、1 mmol/L氯化鈣、0.1%（質量體積比）牛血清蛋白和0.035%（體積比）β-巰基乙醇，pH值5.8］；然后將其放入避光的真空泵中抽真空1 h；取出酶解液置于水平搖床上40 r/min、25 ℃避光酶解3 h；然后80 r/min、25 ℃劇烈振蕩5 min；最后利用300目細胞篩過濾掉未酶解組織，收集過濾液至 50 mL 離心管中，100 g離心3 min，輕棄上清液，加入5 mL洗脫緩沖液［600 mmol/L甘露醇、4 mmol/L MES（一水合物）、20 mmol/L氯化鉀，pH值 5.8］再次100 g離心3 min，重復1次；再加入10 mL的洗脫緩沖液，用移液槍輕吹混勻，置于冰上黑暗靜置30 min；然后100 g離心3 min，輕棄上清液，在沉淀中加入約5 mL的Mmg［400 mmol/L甘露醇、15 mmol/L 六水氯化鎂、4 mmol/L MES（一水合物），pH值5.8］重懸浮原生質體，使用細胞計數板調整溶液中原生質體密度為2×105 個/mL后用于下步試驗。

1.5.2 質粒的大量提取 從-80 ℃保存的構建好的甘油菌中吸取50 μL菌液，接種5 mL的相應抗性液體LB培養基中37 ℃、220 r/min培養至D600 nm為1.6～1.8；取上步2 mL的菌液于200 mL的LB液體培養基中，37 ℃，220 r/min培養至D600 nm為2.0。然后利用無內毒素質粒大提試劑盒提取質粒，質粒的終濃度應大于1 μg/μL（試劑盒具體操作步驟見說明書）。

1.5.3 原生質體的轉化 將上述大量提取的 10 μg 的質粒DNA和100 μL的原生質體（濃度約為5×105個/mL）分別加入2 mL的離心管底部，移液槍輕吹混勻；加入等體積的PEG轉化試劑［40%（質量體積比） PEG 4000、200 mmol/L甘露醇和 100 mmol/L 氯化鈣］，然后輕輕混勻，置于25 ℃黑暗條件下培養 40 min；用440 μL的W5［600 mmol/L甘露醇、3 mmol/L MES（一水合物）和20 mmol/L氯化鉀，pH值5.8］輕輕混勻后100 g離心3 min后輕棄上清，重復2～3遍，直至完全清洗干凈；最后置于1 mL的原生質體培養液［600 mmol/L甘露醇、3 mmol/L MES（一水合物）和4 mmol/L氯化鉀，pH值5.8］，25 ℃ 黑暗條件下培養16 h用于后續研究。

1.6 亞細胞定位的觀察

將35S：AtIMP4-mCherry分別與重組質粒35S：PcWRKY1-GFP和35S：GFP混勻后，利用PEG-Ca介導的玉米原生質體瞬時轉化技術轉化入玉米原生質體，培養結束后，用激光共聚焦顯微鏡（Nikon AIR HD25，日本）進行觀察，其中AtIMP4是擬南芥中定位于細胞核的蛋白。觀察GFP熒光的最大激發波長為488 nm，最大發射波長為 507 nm；觀察mCherry熒光的最大激發波長為 587 nm，最大發射波長為610 nm。

1.7 生理指標的測定

收集高溫脅迫處理后以及未處理的原生質體進行MDA含量和CAT活性測定，測定的方法參照試劑盒說明書進行。

2 結果與分析

2.1 PcWRKY1基因的克隆及生物信息學分析

以多花黃精的根、莖、葉和塊莖混合組織提取的總RNA逆轉錄合成的cDNA為模版，利用轉錄組數據提供的參考轉錄本設計引物，PCR擴增獲得PcWRKY1的CDS序列，回收測序后分析其長度為 1 560 bp（圖1-A中泳道1、2和3所示），與參考轉錄本的序列一致。對其編碼蛋白序列進行生物信息學分析，結果顯示其編碼蛋白的相對分子質量為56.93 ku，理論等電點為7.20，屬于中性蛋白；跨膜結構分析結果表明，該蛋白不具有跨膜結構（圖1-B）；保守結構域分析結果表明，該蛋白含有2個WRKY轉錄因子家族所特有的保守結構域，且每個保守結構域中含有1個七肽保守基序（WRKYGQK）和C2H2（C-X4-C-X23-H-X1-H）型鋅指基序（圖1-C、圖1-D），屬于WRKY轉錄因子家族Group Ⅰa類群；信號肽分析結果表明，該蛋白不存在信號肽（圖 1-E）；蛋白親疏水性分析結果表現，其可能是一種親水性蛋白（圖1-F）；蛋白三級結構預測結果顯示其含無規卷曲含量較多（圖1-G），說明預測蛋白的結構可靠性較低；通過亞細胞預測網站分析，其亞細胞位點都是細胞核，位于其他部位的可能性都很低。

2.2 PcWRKY1進化樹分析

對多花黃精PcWRKY1基因編碼的蛋白序列通過數據庫（https：//www.uniprot.org/）進行蛋白序列比對，從結果中篩出13個物種中同源蛋白序列，利用軟件MEGA 8.0中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統進化樹，結果（圖2）表明，多花黃精中的PcWRKY1與石刁柏（Asparagus officinalis L.）的親緣關系最為接近，其次是深圳擬蘭（Apostasia shenzhenica）與黃石斛（Dendrobium catenatum L.）；與鳳梨（Ananas comosus）的親緣關系最遠。

2.3 PcWRKY1組織表達模式分析

為了檢驗PcWRKY1在多花黃精各個組織中的表達情況，利用RT-qPCR方法分析了PcWRKY1在2年生的多花黃精的根、莖、葉、塊莖和種子中的表達情況，結果（圖3）顯示，PcWRKY1在多花黃精的根、莖、葉、塊莖和種子均有表達，其表達量由高到低的組織部位分別種子、塊莖、根、莖和葉片，其中在根和塊莖中的表達量無明顯差異。

2.4 PcWRKY1基因表達受高溫脅迫的抑制

為了進一步確定PcWRKY1基因的表達是否受高溫的影響，對已有1個完整頂芽的多花黃精根莖（2年生）為無性繁殖材料培育的幼苗分別進行高溫梯度處理和模擬大田高溫處理， 然后選取中上部成

熟葉片提取總RNA，通過RT-qPCR分析PcWRKY1在高溫脅迫下表達，結果如圖4-A所示，以正常條件下作為對照，PcWRKY1在高溫脅迫下的轉錄水平降低了10倍，說明高溫脅迫顯著抑制了它的表達；此外，高溫梯度處理顯示，PcWRKY1的表達量在2 h受到顯著抑制，并且隨著高溫處理時間的增加到 10 h 后又恢復至原始水平（圖4-B）。

2.5 高溫脅迫對PcWRKY1亞細胞位點影響分析

為了進一步確定PcWRKY1的亞細胞位點，本研究首先用植物蛋白亞細胞定位預測網站預測，結果顯示PcWRKY1定位于細胞核中。然后，本試驗利用同源重組的方法構建了一個35S：PcWRKY1-GFP（綠色熒光蛋白標記的融合載體），用已知定位細胞核的AtIMP4偶聯櫻桃紅熒光蛋白的融合載體35S：AtIMP4-mCherry作為對照，利用PEG介導的玉米原生質體瞬時表達體系進行共表達。共表達的原生質體在黑暗條件下，25 ℃培養16 h后在激光共聚焦顯微鏡下進行熒光觀察。結果如圖5所示，在正常條件下，PcWRKY1的綠色熒光信號與AtIMP4的櫻桃紅熒光相重合，這說明PcWRKY1定位于細胞核中。

此外，為了確定高溫脅迫是否會影響其亞細胞定位，對培養后的原生質體進行高溫處理，處理的條件為38 ℃、30 min，結果如圖5顯示，當高溫處理后，PcWRKY1的亞細胞位點與不進行高溫處理一樣。這些結果說明，PcWRKY1的亞細胞位點跟網絡

預測的結果一致，定位于細胞核中，且位點不受高溫影響。

2.6 PcWRKY1提高了玉米原生質體在高溫脅迫中的耐性

為了研究PcWRKY1在高溫中的作用，利用PEG介導的玉米原生質體中瞬時遺傳轉化技術，將PcWRKY1過表達轉化入玉米原生質體中，黑暗培養16 h后再進行高溫38 ℃、30 min的脅迫處理，以不進行高溫處理的作為對照組，然后對其MDA含量和CAT活性進行測定， 結果如圖6所示， 在玉米原

生質體中瞬時過表達PcWRKY1提高了高溫誘導MDA含量的增加，降低了CAT活性的提高。這些結果可以說明，PcWRKY1過表達顯著降低了玉米原生質體在高溫脅迫下的耐性。

3 討論與結論

近年來，由于溫室氣體的大量排放，全球日益變暖， 氣候變暖導致的高溫已經成為全球主要的自然災害之一。高溫脅迫往往通過改變植物生化、生理和代謝過程，最終引起植物的萎蔫、生殖系統發育異常，顯著影響了植物的產量和品質［21-22］。而許多轉錄因子有助于植物對不利環境條件的耐受性，并被廣泛用作作物育種的潛在候選基因［23］。

WRKY轉錄因子作為植物中所特有的一種轉錄因子家族，已經越來越多被報道在植物響應高溫脅迫中起著重要作用［24-26］，但在多花黃精中的研究卻少之又少。本研究在前期通過對多花黃精在高溫脅迫下的轉錄組學研究發現PcWRKY1顯著受高溫脅迫抑制的基礎上，從根、莖、葉和塊莖混合組織中，克隆獲得了轉錄因子PcWRKY1的CDS序列，經測序發現其CDS序列全長共1 560 bp；根據測序得到的CDS所翻譯的氨基酸序列中，分析發現其具有2個WRKY保守的結構域，該結構域中含有WRKYGQK的七肽核心基序和C2H2（C-X4-C-X23-H-X1-H）鋅指結構，屬于WRKY轉錄因子家族GroupⅠa類群；系統進化樹分析結果顯示PcWRKY1與石刁柏的親緣關系最為接近，說明它們之間的功能可能存在相似性；對PcWRKY1在不同組織的表達模式分析，發現其在根、莖、葉、塊莖和種子中均有表達，且在種子中表達量最高；利用PEG介導的玉米原生質體瞬時轉化體系，對PcWRKY1在正常和高溫脅迫下的亞細胞位點進行了分析，與已知報道的WRKY亞細胞位點一樣，都定位于細胞核，并且其位點還不受高溫脅迫的影響。

研究認為，WRKY家族常常通過識別靶基因啟動子中所含的順式作用元件W-box并與其結合，從而調控植物中的各種靶基因信號通路從而應對各種脅迫。如百合中的LIWRKY39作為LIMBF1c上游調控因子，結合LIMBF1c啟動子上保守的W-box順式作用元件，激活了LIMBF1c的轉錄活性從而正調控百合的耐熱性［27］。在擬南芥中過表達小麥TaWRKY1和TaWRKY33，激活了下游脅迫反應相關基因從而調節對高溫的耐受性［28］。此外，WRKY可以調控下游與熱脅迫相關基因的表達，調控抗氧化防護酶的活性，從而提高植物的耐熱性。如在辣椒中，CaWRKY40參與了植物對高溫脅迫的響應，通過提高高溫脅迫下相關熱脅迫應答蛋白編碼基因的轉錄（如HSP等標志基因）來響應高溫；同時在其煙草轉基因植株中顯示，過表達降低了煙草對高溫處理的敏感性，而缺失突變體正好相反［29-30］。此外，在煙草中過表達小麥TaWRKY10后，降低了由高溫脅迫誘導升高的MDA含量，提高了受高溫脅迫促進的抗氧化防護酶的活性，從而降低了由高溫脅迫帶來的損傷［31］；并且在玉米中高溫能夠誘導ZmWRKY106基因的表達，并且在其擬南芥過表達株系中可以通過誘導抗氧化防護酶的活性，從而提高轉基因株系的耐熱性［32］。水稻中的OsWRKY10能夠與VQ8相互拮抗從而調控水稻熱脅迫下ROS穩態以及熱休克轉錄因子和蛋白基因的表達，從而適應高溫脅迫［33］。然而，植物中也有一些WRKY對高溫耐受性起負調控作用，如在擬南芥中的過表達向日葵HaWRKY6會顯著降低其對高溫的耐受性［34］。在本研究中，利用RT-qPCR分析PcWRKY1的轉錄水平顯著受到高溫的抑制，并且對其進行高溫處理2 h時，表達量最低，說明其對高溫脅迫較敏感；同時利用玉米原生質體瞬時轉化體系，瞬時過表達PcWRKY1后，對其在高溫脅迫下的生理指標進行了測定，發現瞬時過表達PcWRKY1進一步升高了由高溫造成的MDA含量的增加，降低了受高溫脅迫提高的CAT活性的增加，說明PcWRKY1的過表達加重了高溫脅迫對玉米原生質體造成的氧化損傷，降低了其在高溫脅迫中的耐性。這些結果表明PcWRKY1在多花黃精適應高溫脅迫中起負調控作用。為進一步分析和確認PcWRKY1具體調控哪些基因的表達進而參與高溫脅迫，可以通過DAP-sequence、ChIP、EMSA等試驗篩選和驗證。

本研究從多花黃精中克隆得到了一個顯著受高溫抑制的WRKY轉錄因子GroupⅠa類群成員PcWRKY1，其CDS序列長為1 650 bp，編碼519個氨基酸。并且利用玉米原生質體瞬時表達體系，發現其過表達降低了玉米原生質體在高溫脅迫下的耐性，推測其在多花黃精高溫脅迫響應中起負調控作用。這可以為闡述多花黃精在適應高溫脅迫中的作用機制及開展分子育種研究提供理論依據。

參考文獻：

［1］Shen F M，Song Z J，Xie P，et al. Polygonatum sibiricum polysaccharide prevents depression-like behaviors by reducing oxidative stress，inflammation，and cellular and synaptic damage［J］. Journal of" Ethnopharmacology，2021，275：114164.

［2］國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典：一部［M］. 北京：中國醫藥科技出版社，2020：215-216.

［3］毛海斌. 多花黃精種植管理技術［J］. 農村新技術，2022（12）：11-13.

［4］羅 瀾，于 桐，劉 蕊，等. 多圈層透視全球氣候變化最新狀況［N］. 中國氣象報，2024-07-10（3）.

［5］Zhu T T，de Lima C F F，Smet D I. The heat is on：how crop growth，development and yield respond to high temperature［J］. Journal of Experimental Botany，2021，72（21）：7359-7373.

［6］Zhao Y L，Liu Song，Yang K F，et al. Fine-control of growth and thermotolerance in the plant response to heat stress［J］. Journal of Integrative Agriculture，2025，24（2）：409-428.

［7］Zhu J K. Abiotic stress signaling and responses in plants［J］. Cell，2016，167（2）：313-324.

［8］Scafaro A P，Fan Y Z，Posch B C，et al. Responses of leaf respiration to heatwaves［J］. Plant，Cell and Environment，2021，44（7）：2090-2101.

［9］Dusenge M E，Duarte A G，Way D A. Plant carbon metabolism and climate change：elevated CO2 and temperature impacts on photosynthesis，photorespiration and respiration［J］. New Phytologist，2019，221（1）：32-49.

［10］梁永富，王康才，薛 啟，等. 高溫強光脅迫下水楊酸對多花黃精生理及光合特性的影響［J］. 南京農業大學學報，2018，41（5）：839-847.

［11］王慶爽. 基于代謝組學的武夷山脈多花黃精種質評價與高溫脅迫研究［D］. 福州：福建農林大學，2023：94-96.

［12］張正勇，楊 雪. 植物對高溫干旱復合脅迫的響應機理［J］. 農技服務，2020，37（8）：34-36.

［13］Chen F，Hu Y，Vannozzi A，et al. The WRKY transcription factor family in model plants and crops［J］. Critical Reviews in Plant Sciences，2018，36（5）：1-25.

［14］Jiang Y J，Liang G，Yu D Q. Activated expression of WRKY57 confers drought tolerance in Arabidopsis［J］. Molecular Plant，2012，5（6）：1375-1388.

［15］Yan H R，Jia H H，Chen X B，et al. The cotton WRKY transcription factor GhWRKY17 functions in drought and salt stress in transgenic Nicotiana benthamiana through ABA signaling and the modulation of reactive oxygen species production［J］. Plant Cell Physiology，2014，55（12）：2060-2076.

［16］Zhou Q Y，Tian A G，Zou H F，et al. Soybean WRKY-type transcription factor genes，GmWRKY13，GmWRKY21，and GmWRKY54，confer differential tolerance to abiotic stresses in transgenic Arabidopsis plants［J］. Plant Biotechnology Journal，2008，6（5）：486-503.

［17］Kilian J，Whitehead D，Horak J，et al. The AtGenExpress global stress expression data set：protocols，evaluation and model data analysis of UV-B light，drought and cold stress responses［J］. The Plant Journal，2007，50（2）：347-363.

［18］Eulgem T. Regulation of the Arabidopsis defense transcriptome［J］. Trends in Plant Science，2005，10（2）：71-78.

［19］Hussain A，Noman A，Khan M I，et al. Molecular regulation of pepper innate immunity and stress tolerance：an overview of WRKY TFs［J］. Microbial Pathogenesis，2019，135：103610.

［20］Zhao Y L，Du H W，Wang Y K，et al. The calcium-dependent protein kinase ZmCDPK7 functions in heat-stress tolerance in maize［J］. Journal of Integrative Plant Biology，2021，63（3）：510-527.

［21］陳賽華，仲偉杰，薛 明. 植物有性生殖對高溫脅迫的響應機制［J］. 作物學報，2023，49（12）：3143-3153.

［22］Djalovic I，Kundu S，Bahuguna R N，et al. Maize and heat stress：Physiological，genetic，and molecular insights［J］. The Plant Genome，2024，17（1）：e20378.

［23］Javed T，Shabbir R，Ali A，et al. Transcription factors in plant stress responses：challenges and potential for sugarcane improvement［J］. Plants，2020，9（4）：491.

［24］Wang H L，Cheng X，Yin D M，et al. Advances in the research on plant WRKY transcription factors responsive to external stresses［J］. Current Issues in Molecular Biology，2023，45（4）：2861-2880.

［25］Chen L G，Song Y，Li S J，et al. The role of WRKY transcription factors in plant abiotic stressess［J］. BBA Gene Regulatory Mechanisms，2012，1819（2）：120-128.

［26］陳 娜，邵 勤，李曉鵬. 番茄WRKY轉錄因子功能的研究進展［J］. 江蘇農業科學，2023，51（13）：6-17.

［27］Ding L P，Wu Z，Teng R D，et al. LlWRKY39 is involved in thermotolerance by activating LlMBF1c and interacting with LlCaM3 in lily （Lilium longiflorum）［J］. Horticulture Research，2021，8：36.

［28］He G H，Xu J Y，Wang Y X，et al. Drought-responsive WRKY transcription factor genes TaWRKY1 and TaWRKY33 from wheat confer drought and/or heat resistance in Arabidopsis［J］. BMC Plant Biology，2016，16（1）：116.

［29］Yang S，Cai W W，Shen L，et al. A CaCDPK29-CaWRKY27b module promotes CaWRKY40-mediated thermotolerance and immunity to Ralstonia solanacearum in pepper［J］. New Phytologist，2022，233（4）：1843-1863.

［30］Liu Z Q，Shi L P，Yang S，et al. A conserved double-W box in the promoter of CaWRKY40 mediates autoregulation during response to pathogen attack and heat stress in pepper［J］. Molecular Plant Pathology，2021，22（1）：3-18.

［31］Wang C，Deng P Y，Chen L L，et al. A wheat WRKY transcription factor TaWRKY10 confers tolerance to multiple abiotic stresses in transgenic tobacco［J］. PLoS One，2013，8（6）：e65120.

［32］Wang C T，Ru J N，Liu Y W，et al. Maize WRKY transcription factor ZmWRKY106 confers drought and heat tolerance in transgenic plants［J］. International" Journal of" Molecular Sciences，2018，19（10）：3046.

［33］Chen S，Cao H，Huang B，et al. The WRKY10-VQ8 module safely and effectively regulates rice thermotolerance［J］. Plant Cell Environ，2022，45（7）：2126-2144.

［34］Giacomelli J I，Weigel D，Chan R L，et al. Role of recently evolved miRNA regulation of sunflower HaWRKY6 in response to temperature damage［J］. New Phytologist，2012，195（4）：766-773.