小麥花粉孔發育相關TaINP1基因鑒定及表達分析

關鍵詞：小麥；花粉孔發育；INP1 基因家族；表達模式；低溫

花粉在高等植物的有性生殖過程中扮演著傳遞雄性親本遺傳信息的核心角色，是植物遺傳、進化、生殖等領域研究的關鍵對象[1-4]。花粉粒通常由2個保護層構成：內層與堅固的外層。外層又可進一步細分為內、外2層，建立在底外層之上，由富含脂質且高抗性的孢子花粉素組成。其中，沉積層對花粉表面孔徑的大小起決定性作用[5-8]。在不同物種間，花粉孔的大小、形狀、位置及數量均表現出顯著差異。作為外壁沉積層中的間隙，這些微小的孔徑對花粉的萌發至關重要[9‐10]。在谷類作物的花粉中，孔徑通常位于遠端極點，形成單一的孔道，周圍環繞著凸起的環狀結構，并被帽狀鰓蓋所覆蓋[11]。環狀結構作為外膜的凸起和增厚邊界，而鰓蓋則是由被稱為Zwischenk?rper的層所支撐的外膜孤立區域邊界[12]。在擬南芥中，花粉孔徑因子（INP1）通過促使質膜靠近胼胝體壁來影響花粉孔的形成。這一過程不僅標記了未來的孔位點，還防止了初壁的形成和孢粉質的沉積[13‐14]。在水稻中，花粉孔形成缺陷OsDAF1 基因的分離和表征揭示了其在孔形成中的關鍵作用[15]。OsDAF1的缺失會導致花粉環面消失，進而引發完全的雄性不育，OsDAF1蛋白定位于發育花粉中未來的孔位點，此外，OsDAF1與OsINP1共定位并直接相互作用。當OsINP1 發生突變時，OsDAF1的極定位被破壞，導致整個孔徑消失，進而引發雄性不育[16]。研究表明，編碼 STRUBBELIG受體家族8蛋白的OsSRF8 基因對于水稻花粉孔的形成至關重要，缺失功能性OsSRF8 的突變體表現出花粉孔徑質膜突起和花粉孔徑形成缺陷；OsSRF8 在花藥發育早期特異性表達，最初彌漫分布在小孢子細胞中，在四分體階段，OsSRF8通過蛋白-蛋白相互作用被OsINP1募集到孔徑前區域，促進花粉孔徑質膜突起的形成[17]。上述研究結果為谷類物種花粉孔形成的調控機制提供了見解。

小麥（Triticum aestivum L.）是全球重要的糧食作物之一，其花粉孔徑形成的研究對于花粉萌發及授粉結實具有不可忽視的重要性[18]。然而，關于引導花粉孔開閉的復雜過程在小麥中尚未見相關研究報道。鑒于此，本研究從花粉孔徑關鍵調控因子INP1 出發，利用小麥全基因組序列信息鑒定小麥TaINPI 基因家族成員，并對其進行生物信息學分析，同時利用qPCR分析其在不同溫度處理下小麥花粉中表達模式，初步探究TaINP1 基因家族在小麥花粉孔徑開閉過程中的作用，為研究小麥TaINP1 基因家族在花粉發育中的功能奠定基礎，也為小麥分子育種遺傳改良提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料及數據來源

以常規小麥品種濟麥22 為試驗材料，于2023年10月種植于北京市農林科學院小麥試驗基地。從Ensembl Plants 數據庫 （http：//plants.ensembl. org/index. html） 中下載小麥（Triticumaestivum L.）、水稻（Oryza sativa L.）、玉米（Zeamays L.） 、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大麥（Hordeum vulgare L.）和帕滕斯藻（Physcomitriumpatens L.）的相關數據，主要包括全基因組序列、CDS（coding sequence）序列、全蛋白質序列以及基因組注釋信息。在NCBI 數據庫 （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 上搜索小麥INP1 數據庫中得到INP1 家族的pfam號：Ff14144；在pfam數據庫中下載其隱馬爾可夫模型。

1.2 小麥TaINP1 基因的鑒定

根據INP1 基因的隱馬爾可夫模型進行HMM搜索及Clustal W 多序列比對，創建小麥INP1 基因家族特異性的隱馬爾可夫模型，進行二次HMM搜索，篩選出Ｅ值lt;0.001的基因，將其對應的蛋白序列提交至Pfam（http：//pfam-legacy.xfam.org/）、NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和SMART 數據庫（https：//smart.embl.de/）進行再次確認，去除不含INP1 結構域或可信度較低的成員，得到小麥TaINP1 基因家族成員。

1.3 小麥TaINP1 蛋白的系統進化分析

利用MAGA 11軟件中的Clustal W功能對小麥、水稻、玉米、擬南芥、大麥共5個物種的INP1蛋白序列進行了多序列比對。選擇NJ（neighborjoining）法構建系統進化樹，并設定Bootstrap校驗參數為1 000，以確保結果的準確性，并借助在線網站Evolview （https：//evolgenius.info//evolview）對進化樹進行美化。

1.4 小麥TaINP1 基因啟動子順式作用元件分析

利用TBtools軟件提取TaINP1 基因編碼區上游2 000 bp 序列，并提交到PlantCARE 數據庫（https：//bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/）分析順式作用元件的種類和數量。采用ExPASY 預測TaINP1 基因家族成員的等電點和分子質量，通過Gpos-mPLoc在線網站（http： //www.csbio.sjtu.edu.Cn/ bioinf /Gpos-multi/）進行亞細胞定位預測。

1.5 小麥TaINP1 基因共線性關系

利用TBtools 軟件，對小麥TaINP1 基因組與水稻、擬南芥、玉米間進行共線性分析，采用Circos軟件繪制詳細的共線性圖譜。

1.6 小麥TaINP1 基因網站數據庫組織表達檢測

利用ExpVIP 數據庫網站 （https：//www.wheatexpression.com/）獲取小麥TaINP1 基因在不同組織中的表達數據，同時在WheatOmics 網站 （http：//wheatomics.sdau.edu.cn/） 查閱小麥TaINP1 基因在穗狀早期發育階段的具體表現。利用TBtools軟件繪制表達熱圖。

1.7 小麥材料處理及熒光定量檢測

在小麥抽穗中晚期，采集濟麥22的根、莖、葉以及穗樣品，迅速放入預先準備好的錫箔紙中后，置于液氮中進行速凍處理。選擇發育良好的小麥采集花粉，并置于4 ℃避光保存。由于小麥花粉的活性維持時間相對較短（0.5～3.0 h），需盡快進行低溫轉化處理。采用優化的DP419 試劑盒流程，對處理后的花粉、根、莖、葉及穗樣品高效提取RNA。隨后，利用RT reagent Kit將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA作為模板，設計特定引物（表1），利用ChamQ qPCR Mix 進行qPCR。qPCR 程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環。采用GraphPad Prism 8 進行統計分析及可視化處理。

1.8 花粉萌發及顯微鏡觀察

將上述取回的小麥花粉盡快進行低溫誘導轉化。將誘導溫度分別設置為6、8、10、12和25 ℃；轉化液為質量體積分數20%蔗糖、10% PEG4000、40 mg·L?1 H3BO3、3×10?3 mol·L?1 Ca（NO3）2、10 mg·L?1VB1。誘導轉化30 min后，利用Leica光學顯微鏡（北京德耳斯儀器有限公司）觀察花粉的萌發狀態，并統計萌發率。

1.9 轉RFP 蛋白花粉激光共聚焦檢測

提取特定的RFP質粒，將其與磁性納米顆粒（magnetic nanoparticle，MNP）在25 ℃下輕柔混合，并持續孵育20 min，使之形成穩定而緊密的復合物（MNP-DNA），準備具有活力的小麥花粉并加入適量轉化液，置于冰上10 min；將磁性納米顆粒和目的質粒DNA的復合物與花粉和轉化液混合液混合，并分別在10 和25 ℃處理20 min，每隔10 min利用磁力攪拌器混合以促進復合物與花粉細胞的充分接觸與內化。待所有步驟結束，將處理后的樣品放置恒溫培養箱，在28 ℃避光培養18 h，并利用Leica TCS SP8激光掃描共聚焦顯微鏡（北京普瑞賽司儀器有限公司）觀察紅色熒光情況。

2 結果與分析

2.1 小麥TaINP1 基因的鑒定及蛋白理化性質分析

在小麥基因組中共鑒定出53個TaINP1 基因家族成員（表2），它們編碼的蛋白序列長度為198～573 aa，等電點為5.24～10.37，有32個表現為酸性特征，另有21個呈現堿性特征。所有TaINP1蛋白的總親水性指數在?0.647～?0.078，屬于親水性蛋白，不穩定指數在43.61～70.75，均超過40，為穩定蛋白。亞細胞定位預測分析發現，絕大多數TaINP1蛋白定位于細胞核中，少數定位于葉綠體、線粒體和細胞質中，表明細胞核可能是其發揮功能的主要場所。

2.2 小麥TaINP1 基因家族的系統進化分析

構建小麥與水稻、玉米、擬南芥、大麥、帕滕斯藻INP1 基因的系統進化樹，如圖1 所示。將這6個物種共計126個INP1 基因劃分為4個Group。其中，TaINP2.2、TaINP2.5、TaINP2.8、TaINP4.1、TaINP4.4和TaINP1.1基因屬于Group 4。TaINP3.2、TaINP3.7 和TaINP3.12 基因位于Group 4 的末端。在Group 1 中，小麥TaINP6.2、TaINP6.4、TaINP6.6 基因與水稻Os02t0661300-01基因位于同一分支，表明二者間親緣關系較近。每個Group 中都包含有擬南芥、水稻、玉米、大麥、帕滕斯藻的INP1 基因，說明該家族基因在不同物種中比較保守。

2.3 小麥TaINP1 基因啟動子順式作用調控元件

分析小麥TaINP1 基因啟動子上游2.0 kb區域的順式作用元件，共鑒定出37 種順式作用元件（圖2），主要包括光響應元件（light responsiveelements，LRE）、激素響應元件（hormone responsiveelements，HRE）、組織特異性元件（tissue specificelements，TSE）和其他響應元件（other responsiveelements，ORE）。植物激素、光和脅迫響應相關元件存在于所有TaINP1 基因的啟動子區，其中包括脫落酸（abscisic acid，ABA）、茉莉酸甲酯（methyljasmonate，MeJA）和赤霉素（gibberellin，GA）等激素的響應元件。在小麥TaINP1 基因家族中，大多數成員都包含ABA響應元件AB RE以及 MeJA響應元件CGTCA-motif和TGACG-motif；每個TaINP1基因都包含1～6個響應低溫、缺氧、干旱等脅迫的元件SRE；在組織特異性元件中有RY-element、CATbox和GCN4-motif等順式作用元件，分別與種子、分生組織和胚乳發育及休眠相關；在18個TaINP1基因的啟動子中均由低溫響應元件LTR；TaINP2.2、TaINP3.2、TaINP3.9 等基因還有TGACG-motif、ABRE、LTR、TGACG-motif順式作用元件，表明TaINP1 基因可能具有復雜的調控機制和多種功能，能夠響應多種內、外信號，并參與多種生物學過程。

2.4 小麥TaINP1 基因共線性分析

共線性分析結果（圖3A）表明，共識別出10對共線性基因，表明這些基因對可能源于基因組的大片段復制事件。TaINP1 基因在2、4、6、7 同源群染色體上保持了良好的共線性，表明這些區域在小麥屬不同物種間高度保守，其中3和7同源群染色體上展現出良好的共線性，推測這些區域在進化過程中可能經歷了較少的重組或重排。同時，將小麥與擬南芥、水稻、玉米的INP1 基因進行跨物種共線性分析，結果（圖3B）表明，小麥與水稻間的共線性關系優于玉米，這表明小麥TaINP1 基因與水稻在序列上可能具有更高的同源性。

2.5 小麥TaINP1 基因數據庫表達模式分析

基于Wheatomics （WheatOmics sdau. edu. cn）和Wheat Expression Browser （https：//www. wheatexpression.com/） 在線數據庫，分析53 個小麥TaINP1 基因家族成員在不同組織及穗早期各發育階段的表達，結果（圖4）發現，TaINP4.4、TaINP2.8 和TaINP3.14 基因在根和籽粒中特異性高表達，表達量為其他TaINP1 基因相對表達量的2 倍以上（圖4A）；TaINP2.2 和TaINP2.5 基因在根、莖、葉、籽粒、穗中表達量均較高，較其他TaINP1 基因高4倍（圖4B），表明它們可能參與小麥從營養生長到生殖生長整個生命周期的多個發育階段，意味著這2個基因在植物生長發育過程中可能具有重要作用。TaINP2.2、TaINP2.5、TaINP4.1 和TaINP4.6 在小麥穗的單棱期、二棱期、護穎分化期、小花分化期和雌雄蕊分化期均表達活躍，表達量最高達到30（圖4C），表明TaINP1是小麥穗部生長及發育的重要因子。不同溫度處理下，TaINP2.2、TaINP2.5、TaINP2.8、TaINP3.12、TaINP4.1、TaINP4.6 等基因在4、12、23、27 ℃下的相對表達量高于其他基因（圖4D），表明這些基因在不同溫度條件下均保持較高的轉錄活性，可能在小麥生長發育或環境適應過程中發揮重要作用。值得注意的是，TaINP2.2、TaINP2.5、TaINP2.8、TaINP3.12、TaINP4.1、TaINP4.6 在多種組織及多種溫度處理下的表達量均較高。

2.6 小麥TaINP1 基因組織特異性和低溫表達模式分析

進一步篩選出11個表達水平顯著較高的基因，包括TaINP2.2、TaINP2.5、TaINP2.8、TaINP3.2、TaINP3.4、TaINP3.7、TaINP3.9、TaINP3.12、TaINP3.14及TaINP4.4。進一步分析這11個TaINP1 基因在濟麥22號中的組織表達模式，結果（圖5）表明，在不同組織間，11個TaINP1 基因在穗部表達量幾乎都在1.0～2.0，與在線結果一致。TaINP3.2和TaINP3.7 基因在根、莖、葉及穗中的相對表達量均較高，表明它們在小麥整個發育過程中可能均發揮著重要作用。TaINP2.5 和TaINP3.14 基因在莖中的表達量最高，其中TaINP2.5 的相對表達量為3.5，表明它們可能與莖的伸長和結構相關； TaINP2.2、TaINP2.8、TaINP3.2、TaINP3.7、TaINP3.12、TaINP3.9 基因在葉中的表達量最高，其中TaINP3.7 相對表達量最高，表明它們可能與光合作用及葉片發育緊密相關；TaINP3.4、TaINP4.1、TaINP4.4 基因在穗部表達量最高。

由圖6 可知，TaINP2.2、TaINP2.5、TaINP2.8、TaINP3.2、TaINP3.7、TaINP3.14、TaINP4.1、TaINP4.4 基因在25 ℃ 處理下的表達量最高；TaINP3.9、TaINP3.12 基因在10 ℃處理下的表達量最高；TaINP3.4 基因在6 ℃處理下的表達量最高。

2.7 花粉萌發及光學顯微觀察

為進一步探究溫度對小麥花粉萌發效率的影響，將花粉轉化液分別于6、8 、10、12和 25 ℃轉化培養30 min，對不同溫度處理的小麥花粉進行形態學觀察，并統計萌發率，結果（圖7）表明，隨著環境溫度的升高，小麥花粉萌發率呈線性增長趨勢，表明溫度是影響花粉萌發的關鍵因素之一。在10～12 ℃，花粉萌發率達到42.6%～50.0％，較25 ℃處理降低8％左右，而在6～8 ℃，花粉萌發率為31.0%～31.8%。由此表明，10～12 ℃是小麥花粉活性低溫保存的最佳條件。

2.8 RFP 基因花粉轉化及紅色熒光可視化檢測分析

由圖8可知，RFP 基因成功轉入小麥花粉中，轉化后的花粉不僅展現出良好的萌發與生長態勢，且RFP 基因的熒光表達穩定。進一步對不同視野下熒光圖像深入分析發現，不同培養溫度下的花粉在熒光強度上存在差異，總體來說10 ℃條件下檢測到的RFP紅色熒光信號較強，說明在該溫度下含有RFP 基因的質粒表達載體的轉化效率較高。

3 討論

本研究在小麥基因組中共鑒定到53 個TaINP1 基因，主要定位于細胞核，意味著這些基因主要在細胞核內發揮作用。系統進化樹分析表明，位于同一類群的基因成員可能擁有相似或相同的功能；共線性分析識別出33對具有共線性的基因，其中水稻中有9個INP1 基因與小麥TaINP1基因具有共線性關系，推斷它們可能起源于共同的祖先[19]。啟動子上游區域的順式作用元件對于調控應激相關基因的表達起到至關重要的作用，并能增強植物對生物和非生物脅迫的抗性。轉錄因子通過與基因啟動子區域中的順式作用元件特異性結合，從而參與植物生長、發育以及脅迫信號的傳導等多種過程。本研究發現，小麥TaINP1 基因的啟動區域包含多種順式作用元件，其中包括植物激素、光響應和脅迫響應元件，這些原件作為種子休眠的主要調控因子，并涉及花發育、種子成熟等生物學過程，同時能對生物和非生物脅迫作出響應。其中RY-element、CAT-box 和GCN4_motif順式作用元件分別與種子、分生組織和胚乳發育相關，作為種子休眠的關鍵調控因子，能夠與ABA協同作用以延遲種子萌發[19-21]。

研究表明，OsINP1 和OsDAF1 是水稻APMP和花粉孔徑形成的重要調節因子[16]，STRUBBELIG 受體家族8 蛋白的禾本科特異性OsSRF8 基因對于水稻花粉孔的形成至關重要[17]。因此，小麥TaINP1 基因在小麥花發育和種子萌發中也扮演著關鍵角色。由于參與花發育的基因通常在植物的花器官中表達，其表達模式相當復雜，涵蓋多個基因家族和不同的時期，這些基因在植物花器官中的表達模式既復雜又精細[16]，所以本研究進一步分析了常規小麥種質不同組織中TaINP1 基因的表達模式，結果顯示，TaINP3.4、TaINP4.1 和TaINP4.4 基因在穗中高度表達，并且包含響應種子休眠的順式作用元件DOG1 和bZIP superfamily，推測這些基因可能在小麥種子發育和休眠調控中起著重要作用。鑒于INP1 基因是花粉孔徑因子，本研究對小麥常規品種的成熟花粉進行了表達分析發現，TaINP2.5、TaINP3.2基因在花粉中顯著表達。同時，考慮到INP1 基因在小麥中可能與花粉孔開閉有關，采用低溫誘導轉化并進行花粉萌發試驗，通過光學顯微鏡觀察花粉萌發狀態，結果顯示，經過10 ℃花粉轉化液處理后，花粉萌發狀態極佳。因此，10～12 ℃的處理可以視為較理想的條件，用于后期納米磁珠轉化的依據。為了后期研究TaINP1 基因和遺傳物質的有效轉化，結合納米磁珠方法將RFP 報告基因轉入小麥花粉，通過觀察發現這些花粉顆粒散發出明亮且均勻的紅色熒光，對于優化低溫條件下的小麥高效遺傳轉化體系研究具有重要意義，而且為小麥分子改良開辟了新途徑。該結果間接證明了小麥TaINP1 基因在10 ℃低溫下調控花粉孔的高效開放，為小麥花粉納米磁珠遺傳轉化技術中花粉的科學處理與保存提供了強有力的理論支持與實踐指導，對小麥TaINP1 基因遺傳轉化及納米磁珠轉化具有重要意義[22]。然而，關于小麥TaINP1 基因是否通過低溫表達調控花粉孔開閉的直接證據還有待于進一步深入研究。綜上所述，本文通過全基因組水平的基因家族鑒定及表達譜分析有效地篩選出了響應的靶基因并預測基因功能。然而，關于TaINP1 基因在花粉孔徑及開閉相關性方面的功能研究，仍有待進一步的試驗驗證。