人參皂苷Rg1通過抑制MAPK/NF-κB信號通路減輕膿毒癥大鼠急性呼吸窘迫綜合征

[摘" "要]" "目的： 探討人參皂苷Rg1對膿毒癥大鼠急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome， ARDS）的保護作用及機制。方法：將雄性SD大鼠隨機分為3組，每組12只。分別為ARDS組：采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecal ligation and puncture， CLP）建立膿毒癥大鼠ARDS模型；ARDS+Rg1組：于CLP術(shù)后6 h予大鼠人參皂苷Rg1灌胃（10 mg/kg），連續(xù)2 d；對照組（Control組）：只開腹不手術(shù)；ARDS組和Control組大鼠等量生理鹽水灌胃。各組大鼠于術(shù)后3 d處死并留取肺組織標本。檢測大鼠肺組織濕干重比，組織切片H-E染色、光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變并對損傷情況進行評分；檢測肺組織丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量以及髓過氧化物酶（myeloperoxidase， MPO）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）的活性；ELISA檢測肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-2的表達水平；Western Blot檢測MAPK和NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白p-p38和p-p65在肺組織中的表達情況。結(jié)果：與Control組相比，ARDS組大鼠肺組織水腫，肺泡結(jié)構(gòu)受損嚴重，大量炎性細胞浸潤并伴有出血。與ARDS組相比，ARDS+Rg1組大鼠肺組織損傷程度較輕，肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，肺濕干重比和肺損傷評分顯著下降（Plt;0.05），MDA含量和MPO活性下降（Plt;0.05），SOD活性上升（Plt;0.05）。ARDS+Rg1組大鼠肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-2的表達水平以及p-p38和p-p65蛋白表達水平均明顯低于ARDS組（均Plt;0.05）。結(jié)論：人參皂苷Rg1對膿毒癥ARDS具有一定的保護作用，能發(fā)揮抗氧化、抗炎等作用，可能與抑制MAPK/NF-κB信號通路激活有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]" "膿毒癥；急性呼吸窘迫綜合征；人參皂苷Rg1；絲裂原活化蛋白激酶；核因子-κB；大鼠

[中圖分類號]" "R285.5" " " " " " " "[文獻標志碼]" "A" " " " " " " "[文章編號]" "1674-7887（2025）02-0151-05

Ginsenoside Rg1 attenuates acute respiratory distress syndrome in septic rats by inhibiting

MAPK/NF-κB signaling pathway*

QIAN Jiayan1**， SHI Guanglin1， MAO Xinxin1， MIAO Yuqing1， SUN Baier2***" " " " （1Department of Respiratory and Critical Care Medicine， the Sixth People？蒺s Hospital of Nantong， Jiangsu 226011; 2Department of Respiratory and Critical Care Medicine， Affiliated Hosptial of Nantong University）

[Abstract]" "Objective： To explore the protective effects and mechanisms of ginsenoside Rg1 on acute respiratory distress syndrome（ARDS） in rats with sepsis. Methods： Male SD rats were randomly divided into 3 groups with 12 rats in each group. ARDS group： ARDS model was established by cecal ligation and puncture（CLP）; ARDS+Rg1 group： rats were given ginsenoside Rg1（10 mg/kg） by gavage at 6 h after CLP for 2 days; Control group： only laparotomy without operation; ARDS group and Control group were given the same amount of saline by gavage. Rats were sacrificed 3 days after operation and lung tissue samples were collected. The ratio of wet to dry weight of lung tissue was measured; H-E staining was used to observe the morphological changes of lung tissue and the injury was scored; the content of malondialdehyde（MDA） and the activities of myeloperoxidase（MPO） and superoxide dismutase（SOD） were detected; ELISA was used to determine the levels of TNF-α， IL-1β， IL-6 and IL-2; Western Blot was used to detect the expression of key proteins of MAPK and NF-κB signaling pathway includng p-p38 and p-p65 in lung tissues. Results： Compared with Control group， rats in ARDS group presented pulmonary edema， alveolar structure damage， inflammatory cells infiltration and bleeding. Compared with ARDS group， ARDS+Rg1 group had less lung injury， lower lung wet to dry weight ratio and lung injury score（Plt;0.05）， decreased MDA content and MPO activity（Plt;0.05）， and increased SOD activity（Plt;0.05）. The expression levels of cytokines TNF-α， IL-1β， IL-6 and IL-2， and the protein expression levels of p-p38 and p-p65 in ARDS+Rg1 group were significantly lower than those in ARDS group（all Plt;0.05）. Conclusion： Ginsenoside Rg1 has protective effects on ARDS induced by sepsis involving anti-oxidation and anti-inflammatory roles， which might be associated with inhibition the activities of MAPK/NF-κB signaling pathway.

[Key words]" "sepsis; acute respiratory distress syndrome; ginsenoside Rg1; mitogen activated protein kinase; nuclear factor- kappa B; rat

膿毒癥的發(fā)生是復(fù)雜的病理生理過程，是由感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào)，進而導(dǎo)致循環(huán)功能障礙及器官功能損害。急診患者膿毒癥的發(fā)病率高，是危重癥患者死亡的主要原因之一，死亡率達25%～55%[1-2]。肺部作為易受損器官，在膿毒癥患者中，常發(fā)生肺損傷可能進展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome， ARDS），ARDS是膿毒癥致死的主要原因，探索相關(guān)分子機制并進行干預(yù)對改善患者的預(yù)后具有重要意義[3]。目前的研究[3-4]認為過度的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、肺泡毛細血管內(nèi)皮損傷通透性增加等在ARDS的發(fā)生發(fā)展中有起重要作用。其中涉及一系列重要的信號通路包括MAPK、NF-κB、Akt等，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、氧化-抗氧化平衡、損傷-修復(fù)等過程[5-6]。近年來，中藥及其活性成分在ARDS和其他肺部疾病中的應(yīng)用研究受到關(guān)注。人參皂苷Rg1作為傳統(tǒng)中藥人參的重要活性成分，具有廣泛的藥理學(xué)作用[7]。本研究擬探討人參皂苷Rg1在膿毒癥大鼠ARDS中的作用及相關(guān)分子機制。

1" "材料和方法

1.1" "實驗藥品與試劑" "人參皂苷Rg1購自美國Sigma公司；H-E染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；p-p38、p-p65、β-actin抗體購自英國Abcam公司；丙二醛（malondialdehyde， MDA）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase， MPO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）檢測試劑盒購自南京建成生物公司；TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2檢測ELISA試劑盒及RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2" "實驗動物及分組" "健康清潔級SD大鼠36只，體質(zhì)量180～220 g，購自南通大學(xué)實驗動物中心。隨機分為3組，每組12只。ARDS組：采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecal ligation and puncture， CLP）建立膿毒癥大鼠ARDS模型；人參皂苷Rg1治療組（ARDS+Rg1組）：大鼠在ARDS術(shù)后6 h用人參皂苷Rg1（10 mg/kg）灌胃，連續(xù)2 d；對照組（Control組）大鼠只開腹不手術(shù)。Control組和ARDS組大鼠以等量生理鹽水灌胃。各組大鼠于術(shù)后3 d處死，留取肺組織標本。研究經(jīng)南通大學(xué)實驗動物中心倫理審查委員會批準（P20230224-011）。

1.3" "組織學(xué)分析" "以4%多聚甲醛固定肺組織標本，脫水后石蠟包埋，制作肺組織切片（4 μm厚度），按照H-E染色試劑盒說明書方法進行染色，在光鏡下觀察肺組織病理變化并對損傷情況進行評分。

1.4" "肺組織濕干重比測定" "大鼠處死后迅速摘取部分肺組織，PBS洗去殘血后用濾紙吸干并稱重（即為濕重）。置于65 ℃烘箱中直至肺組織重量不再發(fā)生變化，稱重（即為干重），計算濕干重比。

1.5" "肺組織MDA含量測定及MPO、SOD活性檢測" "取部分肺組織于４ ℃條件下制成組織勻漿，離心后吸取上清液。根據(jù)試劑盒標準操作流程分別測定肺組織勻漿中MDA的含量和MPO、SOD的活性。

1.6" "肺組織勻漿細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-2的表達量測定" "按照試劑盒說明書的操作流程，采用ELSIA方法分別對肺組織勻漿中的細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-2的表達量進行測定。

1.7" "肺組織中MAPK和NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白p-p38和p-p65表達水平檢測" "采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測肺組織中MAPK和NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白p-p38和p-p65的表達情況。取適量大鼠肺組織加入RIPA裂解液，研磨勻漿后，離心收集上清液，BCA法檢測蛋白濃度。每個樣本取等量蛋白進行電泳和轉(zhuǎn)膜。將膜置于封閉液（3%牛血清白蛋白）中37 ℃封閉2 h。加入抗p-p38、p-p65和內(nèi)參β-actin抗體，4 ℃孵育過夜后室溫下孵育二抗，ECL顯色。采用FluorChem FC2成像系統(tǒng)采集圖像并用Image J軟件分析條帶灰度。

1.8" "統(tǒng)計學(xué)方法" "采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計分析和作圖。實驗數(shù)據(jù)采用■±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用LSD方法。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2" "結(jié)" " " 果

2.1" "人參皂苷Rg1可以減輕膿毒癥大鼠的肺損傷" "光鏡下觀察H-E染色的大鼠肺組織切片，如圖1A所示，Control組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯異常。ARDS組可見肺泡結(jié)構(gòu)受損紊亂，有大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔增寬，肺間質(zhì)水腫。同時，ARDS組大鼠肺濕干重比（圖1B）和肺組織損傷病理評分（圖1C）顯著上升（Plt;0.05）。與ARDS組相比，給予人參皂苷Rg1灌胃處理的大鼠（ARDS+Rg1組）肺組織病理異常顯著減輕（圖1A），受損肺組織結(jié)構(gòu)有所修復(fù)，肺泡相對完整，肺濕干重比（圖1B）和損傷病理評分（圖1C）下降明顯（Plt;0.05）。

2.2" "人參皂苷Rg1能夠減輕膿毒癥大鼠肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)" "如圖2所示，與Control組相比，ARDS組大鼠肺組織內(nèi)MDA含量和MPO活性顯著升高（Plt;0.05），SOD活性顯著減低（Plt;0.05）。給予人參皂苷Rg1處理后，大鼠肺組織內(nèi)MDA含量和MPO活性降低（Plt;0.05），SOD活性提高（Plt;0.05）。

2.3" "人參皂苷Rg1能夠減輕膿毒癥大鼠肺組織內(nèi)炎癥反應(yīng)" "各組大鼠肺組織炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-2的表達水平的檢測結(jié)果顯示：ARDS組大鼠肺組織內(nèi)上述炎癥因子的表達水平異常增加，顯著高于Control組（Plt;0.05）。與ARDS組相比，ARDS+Rg1組大鼠肺組織中上述炎癥因子的表達水平顯著降低（Plt;0.05），見圖3。

2.4" "人參皂苷Rg1對膿毒癥大鼠肺組織MAPK和NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白p-p38和p-p65表達水平的影響" "大鼠肺組織中MAPK和NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白p-p38和p-p65的表達水平，見圖4。與Control組相比，ARDS組大鼠肺組織p-p38和p-p65的表達水平顯著上調(diào)（Plt;0.05）。與ARDS組相比，ARDS+Rg1組大鼠肺組織p-p38和p-p65的表達顯著下調(diào)（Plt;0.05）。人參皂苷Rg1能夠抑制膿毒癥ARDS大鼠肺組織內(nèi)MAPK和NF-κB信號通路的激活。

3" "討" " nbsp; 論

肺損傷是急危重癥患者面臨的嚴重并發(fā)癥之一，多由肺炎、膿毒癥、嚴重創(chuàng)傷燒傷和休克等因素引起。其中，大部分患者由膿毒癥引起，導(dǎo)致肺水腫和呼吸功能衰竭，嚴重者進展為ARDS，發(fā)病率和死亡率均較高[8]。因此，膿毒癥相關(guān)ARDS給膿毒癥患者的救治帶來巨大挑戰(zhàn)。由于ARDS的發(fā)生發(fā)展機制還不明確，可能涉及炎癥風暴、氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡、免疫調(diào)節(jié)、內(nèi)皮細胞壞死等復(fù)雜的病理生理學(xué)變化，尚無有效的治療藥物[9-10]。一系列小分子藥物、免疫功能調(diào)節(jié)藥物等被報道用于ARDS的干預(yù)，其臨床應(yīng)用價值有待探討。已有大量研究[11-13]表明中藥及其活性成分在ARDS的治療方面可能具有優(yōu)勢。如血必凈對膿毒癥具有一定的治療作用[11]、黃芪甲苷可通過上調(diào)自噬減輕細胞氧化應(yīng)激損傷[12]、化橘紅及其主要化學(xué)成分具有抗炎、抗纖維化和器官保護等多方面的藥理活性[13]。近年來，人參皂苷Rg1在多種疾病研究中表現(xiàn)出較好的治療價值，包括抑制心肌損傷和炎癥反應(yīng)等[14]。但在ARDS的干預(yù)和相關(guān)機制研究方面還需要進一步探索。

本研究采用經(jīng)典的CLP法成功建立大鼠膿毒癥ARDS模型，通過對大鼠肺組織進行組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：膿毒癥相關(guān)ARDS發(fā)生時，大鼠肺組織水腫，濕干重比顯著增加，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔中大量炎性細胞浸潤并伴有出血，肺泡間隔增厚，肺組織損傷病理評分明顯增加。給予人參皂苷Rg1處理的大鼠肺水腫程度以及上述肺損傷的組織病理學(xué)改變明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)得到一定程度修復(fù)，證實人參皂苷Rg1對膿毒癥大鼠肺組織有一定的保護作用。ARDS發(fā)生時，氧自由基大量產(chǎn)生，氧化應(yīng)激反應(yīng)是造成肺組織損傷的重要原因之一。本研究中，ARDS組大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)標志分子MDA含量和MPO活性的升高以及SOD活性的下降，表明氧化/抗氧化失衡參與膿毒癥ARDS的發(fā)生發(fā)展過程。給予人參皂苷Rg1干預(yù)后，大鼠肺組織內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)水平得到抑制，相應(yīng)的標志分子異常情況得一定程度的改善，有利于抗氧化能力的提高和氧自由基的清除，從而減輕肺組織損傷程度。陳羨人等[15]研究也發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1能夠抑制糖尿病大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解肝損傷。

炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大、促炎與抗炎因子的表達失調(diào)也是造成膿毒癥ARDS及其進展的重要原因之一。通過檢測大鼠肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-2的表達情況，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1能夠顯著降低ARDS大鼠肺組織炎癥因子的表達，表現(xiàn)出較強的抗炎能力。已有研究[16-17]表明：MAPK和NF-κB信號的激活與膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中的炎癥反應(yīng)、細胞凋亡以及免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。通過分析各組大鼠肺組織中MAPK通路關(guān)鍵蛋白p-p38和NF-κB通路關(guān)鍵蛋白p-p65的表達水平，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1能夠抑制MAPK和NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白p-p38和p-p65的表達，提示人參皂苷Rg1可能通過抑制上述信號通路的激活從而減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對肺組織的保護作用。

綜上所述，人參皂苷Rg1能夠減輕膿毒癥造成的肺組織損傷，抑制氧化應(yīng)激、減輕炎癥反應(yīng)，促進肺組織修復(fù)，從而發(fā)揮對膿毒癥ARDS大鼠的保護作用。其相關(guān)機制可能是Rg1抑制MAPK和NF-κB信號通路的激活。

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[收稿日期] 2023-11-03