聚乙烯微粒對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的毒性效應(yīng)

摘要：為查明養(yǎng)殖環(huán)境中微塑料（MPs）對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的生態(tài)毒性效應(yīng)，利用宏基因組測(cè)序技術(shù)探究聚乙烯微粒（PE-MPs）對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的毒性效應(yīng)。結(jié)果表明：隨PE-MPs的污染濃度增加，養(yǎng)殖水體總氮濃度逐漸上升，而pH值和鹽度逐漸降低。凡納濱對(duì)蝦腸道菌群以細(xì)菌（99.98%）為主，還有少量噬菌體和真菌。PE-MPs污染顯著改變了凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的組成和群落結(jié)構(gòu)特征；Donghicolaeburneusa 等8個(gè)菌株均可作為聚乙烯污染凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的生物標(biāo)記物。凡納濱對(duì)蝦腸道菌群功能通路中代謝作用占比最高（gt;75%），PE-MPs污染造成凡納濱對(duì)蝦腸道菌群功能通路的顯著改變，其中氨基酸代謝等5個(gè)通路的相對(duì)豐度顯著上升，萜類和酮類化合物代謝通路的相對(duì)豐度顯著下降。

關(guān)鍵詞：聚乙烯；微塑料；凡納濱對(duì)蝦；腸道菌群；毒性效應(yīng)

中圖分類號(hào)：X171.5；X52 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1672-2043（2025）03-0849-10 doi：10.11654/jaes.2025-0054

近年來對(duì)蝦養(yǎng)殖在全球范圍內(nèi)迅速發(fā)展，為人類提供了優(yōu)質(zhì)的食物資源，但養(yǎng)殖環(huán)境污染與疾病頻發(fā)，使對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)屢受重創(chuàng)。凡納濱對(duì)蝦（Litopenae?us vannamei，俗稱南美白對(duì)蝦）是我國(guó)以及世界最主要的養(yǎng)殖蝦類[1-2]。在我國(guó)由于水體污染引起的凡納濱對(duì)蝦死亡和嚴(yán)重減產(chǎn)常見報(bào)道[3]。在養(yǎng)殖水體普遍受污染的情況下，研究養(yǎng)殖環(huán)境中污染物對(duì)凡納濱對(duì)蝦的毒性效應(yīng)及其對(duì)環(huán)境因子的影響，是確保其健康養(yǎng)殖的重要手段。目前已開展水體氨氮和亞硝酸鹽[4-5]、多環(huán)芳烴[6]、抗生素[7]和硫化物[8]等污染物對(duì)凡納濱對(duì)蝦的毒性效應(yīng)和作用機(jī)制研究。已有研究表明，微塑料（MPs）會(huì)對(duì)水生動(dòng)物造成損傷[9]，特別是會(huì)導(dǎo)致腸道微生物紊亂[10]。MPs在水體環(huán)境及水產(chǎn)品中普遍被檢出，如水產(chǎn)養(yǎng)殖水域中魚體內(nèi)消化道、鰓中MPs的累積豐度最高[11]，紅樹林海水養(yǎng)殖中南美白對(duì)蝦體內(nèi)檢出各種形狀、尺寸和顏色的MPs[12]。但養(yǎng)殖環(huán)境中MPs對(duì)凡納濱對(duì)蝦的毒性效應(yīng)及機(jī)制研究卻鮮見報(bào)道。因此，以養(yǎng)殖環(huán)境中的凡納濱對(duì)蝦為研究對(duì)象，系統(tǒng)開展MPs對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的毒性效應(yīng)顯得十分必要。腸道是對(duì)蝦體內(nèi)最重要的消化吸收器官，腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)和功能在對(duì)蝦生長(zhǎng)中具有重要作用[13]，與對(duì)蝦營(yíng)養(yǎng)代謝、能量平衡、免疫防御和胃腸道發(fā)育等生理過程緊密相關(guān)，對(duì)蝦腸道及其菌群的穩(wěn)定與否直接反映對(duì)蝦的健康狀況[14-18]。本研究擬以主要成分為聚乙烯（PE）的水產(chǎn)養(yǎng)殖用防滲土工膜微粒為污染物，系統(tǒng)探究PE-MPs對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的毒性效應(yīng)，闡明凡納濱對(duì)蝦攝食PE-MPs后對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境因子的變化、腸道菌群的組成與群落結(jié)構(gòu)、功能基因、代謝的影響，進(jìn)一步闡明其毒性作用機(jī)制。研究結(jié)果可為構(gòu)建MPs對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的毒理學(xué)評(píng)估和效應(yīng)評(píng)價(jià)體系提供科學(xué)參考和理論依據(jù)，以保障水產(chǎn)品養(yǎng)殖科學(xué)發(fā)展、水產(chǎn)品質(zhì)量安全和人體健康。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究選用凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖常用的土工膜（聚乙烯）經(jīng)粉碎、老化、消毒后的微塑料（PE-MPs）作為污染物。前期針對(duì)汕尾地區(qū)高位池養(yǎng)殖場(chǎng)的水樣檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PE-MPs濃度范圍為0.039～0.093 mg·L-1，故設(shè)置含有低濃度（0.05 mg·L-1，T1）和高濃度（0.1 mg·L-1，T2）PE-MPs 的飼料進(jìn)行凡納濱對(duì)蝦的室內(nèi)養(yǎng)殖試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)置不含PE-MPs的飼料為空白對(duì)照（T0），每組3個(gè)重復(fù)，分別記為A、B、C。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 凡納濱對(duì)蝦的養(yǎng)殖

選擇生長(zhǎng)一致的凡納濱對(duì)蝦幼蝦[體長(zhǎng)（8.0±0.3）cm，體質(zhì)量（5±0.5）g]暫養(yǎng)一周，隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組（T0）、低濃度處理組（T1）和高濃度處理組（T2），每組3個(gè)平行，每個(gè)平行組玻璃缸中放入100尾凡納濱對(duì)蝦（容積0.4 m3，按照250條·m-3投放）。在試驗(yàn)過程中，每天吸污并過600 目篩網(wǎng)，過濾水再加回水族箱中。定時(shí)補(bǔ)充蒸發(fā)損失的水分。每3 d測(cè)定一次氨氮、亞硝氮、pH、水溫及鹽度，確保水體符合凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水質(zhì)要求。試驗(yàn)進(jìn)行30 d，試驗(yàn)期間按照對(duì)蝦生長(zhǎng)狀況調(diào)整投喂量，對(duì)蝦養(yǎng)殖過程管理參考《南美白對(duì)蝦健康養(yǎng)殖技術(shù)》[19]和《南美白對(duì)蝦高效養(yǎng)殖與疾病防治技術(shù)》[20]。

1.2.2 PE-MPs的制備

將凡納濱對(duì)蝦高位養(yǎng)殖池常用防滲土工膜（聚乙烯，厚度為0.5 mm）粉碎、過篩，即獲得PE-MPs。采用熒光倒置顯微鏡（Nikon，Ts2R）對(duì)制備的PE-MPs進(jìn)行觀察，可見其粒徑為10～200 μm（圖1）。將PEMPs充分浸泡于10% H2O2溶液中振蕩2 h，重復(fù)3次；用無菌超純水反復(fù)沖洗3次，然后充分浸泡于75% 酒精溶液中振蕩2 h，重復(fù)3次，用無菌超純水反復(fù)沖洗3次，最后置于無菌操作臺(tái)上紫外照射5 h，即得無菌PE-MPs。

1.2.3 養(yǎng)殖飼料制備

試驗(yàn)飼料采用商業(yè)飼料（由深圳市澳華集團(tuán)股份有限公司贈(zèng)送，經(jīng)檢測(cè)，無PE-MPs 殘留），主要營(yíng)養(yǎng)成分為：粗蛋白質(zhì)42.0%，粗脂肪6.0%，粗纖維5.0%，粗灰分18.0%，總磷2.0%，賴氨酸2.4%，水分12%等。按添加量為0（對(duì)照組，T0）、0.05 mg·kg-1（T1）和0.1 mg·kg-1（T2）分別添加PE-MPs至飼料中攪拌混勻，待用。

1.2.4 試驗(yàn)使用主要儀器設(shè)備

試驗(yàn)使用主要儀器詳見表1。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水質(zhì)參數(shù)測(cè)定

采用哈希DR3900 多功能水質(zhì)分析系統(tǒng)，參照《水質(zhì)分析實(shí)用手冊(cè)（第二冊(cè)）》[ 21]，對(duì)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，詳細(xì)參數(shù)及方法包括：pH值（USEPA電極法）、鹽度（USEPA 直接測(cè)試法）、溶解氧（LOD 電極，直接法）、硝酸鹽（鉻變酸法，方法10020）、氨氮（水楊酸法，方法8155）、總氮（過硫酸鹽氧化法，方法10072）。

1.3.2 對(duì)蝦腸道內(nèi)容物采集

試驗(yàn)結(jié)束后，捕撈所有對(duì)蝦，在冰上無菌條件下提取中腸腸道內(nèi)容物于無菌試管，所有內(nèi)容物分為兩部分，一部分置于4 ℃冰箱保存，并盡快測(cè)定其蛋白質(zhì)和脂肪含量；另一部分迅速置于-80 ℃冰箱中，用于總DNA提取。

1.3.3 腸道內(nèi)容物蛋白質(zhì)和脂肪含量的檢測(cè)

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參照《飼料中粗蛋白的測(cè)定凱氏定氮法》（GB/T 6432—2018）；脂肪含量的檢測(cè)操作按《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》（GB5009.6—2016）進(jìn)行。

1.3.4 樣本DNA提取

根據(jù)E.Z.N.A.? soil試劑盒說明書進(jìn)行總DNA抽提，采用NanoDrop2000檢測(cè)DNA濃度和純度。

1.3.5 宏基因組測(cè)序及生物信息學(xué)分析

檢測(cè)合格DNA樣品送深圳微科盟科技集團(tuán)有限公司，于Illumina Novaseq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，策略是PE150。對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控及宿主過濾，得到有效數(shù)據(jù)。分析中將使用Cutadapt徹底清除原始數(shù)據(jù)中的Illumina 接頭序列，再用PrinSEQ 去除低質(zhì)量的序列片段和個(gè)別序列。使用FastQC來檢測(cè)質(zhì)控的合理性和效果。質(zhì)控處理后的數(shù)據(jù)通過bow?tie2比對(duì)到宿主的基因組，沒有比對(duì)到的序列被保留下來做后續(xù)分析。使用Kraken2 和自建的微生物數(shù)據(jù)庫[從Kraken官網(wǎng)下載各個(gè)微生物數(shù)據(jù)庫（細(xì)菌、真菌、古菌、病毒），合并后再加入哥倫比亞大學(xué)實(shí)驗(yàn)室研究中新發(fā)現(xiàn)的一些細(xì)菌基因組數(shù)據(jù)]鑒別樣本中所含有的物種，再用Bracken對(duì)樣本中物種的實(shí)際相對(duì)豐度進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用HUMAnN2 軟件（基于DIA?MOND），將各個(gè)樣本的合格的reads 比對(duì)到數(shù)據(jù)庫（UniRef90），根據(jù)UniRef90 ID 和各個(gè)數(shù)據(jù)庫的對(duì)應(yīng)關(guān)系，得到各個(gè)功能數(shù)據(jù)庫的注釋信息和相對(duì)豐度表。基于物種豐度表和功能豐度表，進(jìn)行PCoA降維分析（僅物種）的聚類分析；進(jìn)行LEfSe biomarker挖掘分析以及代謝通路比較分析，挖掘樣品之間的物種組成和功能組成差異[10]。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010處理數(shù)據(jù)，并用SPSS 20.0軟件對(duì)水質(zhì)參數(shù)和腸道內(nèi)容物的脂肪、蛋白質(zhì)含量等理化因子，以及微生物菌群的相對(duì)豐度、功能通路豐度等數(shù)據(jù)分別進(jìn)行單因素方差分析，差異性以Plt;0.05表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PE-MPs對(duì)養(yǎng)殖水體和凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)容物的影響

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)養(yǎng)殖水體的理化因子（總氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、鹽度、溶解氧和pH值）以及凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)容物的脂肪和蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了測(cè)定。PE-MPs 暴露會(huì)顯著影響?zhàn)B殖水體中的總氮、銨態(tài)氮、pH值和鹽度（表2）。其中，養(yǎng)殖水體總氮的濃度隨PE-MPs 污染濃度的增加而逐漸上升，特別是當(dāng)PE-MPs濃度達(dá)到0.1 mg·kg-1時(shí)，養(yǎng)殖水體的總氮濃度顯著上升（Plt;0.05）。該結(jié)果表明，高濃度PE-MPs污染會(huì)顯著增加水體中總氮的積累。養(yǎng)殖水體中pH值和鹽度則隨著PE-MPs的污染濃度增加而逐漸降低，特別是在T2中其數(shù)值顯著低于T0（Plt;0.05）。此結(jié)果表明，高濃度PE-MPs污染可對(duì)養(yǎng)殖水體中鹽度和pH值的平衡產(chǎn)生不利影響。此外，凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)容物中脂肪和蛋白質(zhì)的含量分析結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)的濃度在T0、T1和T2三者間無顯著性差異，表明PE-MPs 暴露對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道對(duì)蛋白質(zhì)消化吸收無顯著影響。而T1中的脂肪含量（[ 163.33±11.55）μg·kg-1]顯著高于 T0（[ 110.00±10.00）μg·kg-1]和 T2（[ 100.00±36.06）μg·kg-1]，表明PE-MPs低污染會(huì)顯著增加凡納濱對(duì)蝦腸道中脂肪的儲(chǔ)藏（Plt;0.05）。

2.2 PE-MPs污染對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群組成的影響

利用Kraken2 對(duì)所有樣品的全部的有效序列進(jìn)行注釋分類，用Bracken估算宏基因組樣本的物種水平或?qū)偌?jí)豐度。基于Bracken結(jié)果的絕對(duì)豐度及注釋信息，對(duì)每個(gè)樣品在一共7 個(gè)分類水平界、門、綱、目、科、屬、種上的序列數(shù)目占總序列數(shù)的比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明各樣品的菌群均能被注釋到種水平，樣本的注釋效果較好。經(jīng)過分析和統(tǒng)計(jì)，所有樣品中檢測(cè)到的物種數(shù)量如表3所示，包括古菌（34個(gè)）、細(xì)菌（53 922 437個(gè)）、噬菌體（4 055個(gè)）、植物和真菌（2 614個(gè)）、病毒（143個(gè)）。以細(xì)菌（99.98%）、噬菌體（0.007 5%）和真菌（0.004 8%）為主，病毒僅在PEMPs低濃度污染時(shí)有少量檢出。

菌種組成可以直觀反映不同處理下凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的基本特征。在門水平上，各處理的腸道菌群組成基本相同，共包括16個(gè)門（圖2）。Proteobacte?ria門和Bacteroidetes門是相對(duì)豐度最高的2個(gè)門，在不同處理中這兩個(gè)門的相對(duì)豐度存在顯著差異。其中Proteobacteria門的相對(duì)豐度在不同處理中大小為：T1（91.13% ± 0.17%） gt;T0（87.96% ± 1.69%） gt;T2（82.89%±0.66%）（Plt;0.05）；而Bacteroidetes門在不同處理中相對(duì)豐度大小的順序與Proteobacteria門截然相反，為：T1（6.48%±0.24%）

在屬水平上，共發(fā)現(xiàn)272個(gè)屬。選擇相對(duì)豐度較高的20 個(gè)屬進(jìn)行顯著性差異分析（圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)PE-MPs污染處理組（T1、T2）中Ruegeria 屬、Epibacte?rium 屬和Mesoflavibacter 屬的相對(duì)豐度顯著低于空白對(duì)照組（T0），該結(jié)果表明PE-MPs的污染會(huì)顯著下調(diào)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群中Ruegeria 屬、Epibacterium 屬和Mesoflavibacter 屬的相對(duì)豐度（Plt;0.05），從而抑制該類菌屬的生物活性；相反地，PE-MPs 污染會(huì)提高Leis?ingera 屬和Yangia 屬的相對(duì)豐度，在PE-MPs高濃度污染下顯著提升（Plt;0.05），表明PE-MPs 污染脅迫下，凡納濱對(duì)蝦腸道菌群中Leisingera 屬和Yangia 屬的相對(duì)豐度會(huì)提升，從而提高抗脅迫能力。值得注意的是Ruegeria 屬的相對(duì)豐度隨著PE-MPs污染濃度的增加，其相對(duì)豐度呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)（Plt;0.05）；相反地，Mameliella 屬的相對(duì)豐度隨著PE-MPs 污染濃度的增加呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)（Plt;0.05）。此外，T2處理下作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要的病原菌Vibrio 屬的相對(duì)豐度僅為T0處理下的16%（Plt;0.05），表明PE-MPs高濃度污染可能會(huì)顯著降低某些病原菌的豐度，從而降低發(fā)病的可能性。

在種水平上，共發(fā)現(xiàn)527個(gè)種。挑選相對(duì)豐度較高的20個(gè)菌進(jìn)行顯著性差異分析（圖4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：T2 中Leisingera daeponensis、Rubinisphaera brasiliensis、Salipiger bermudensis、Yangia pacifica 和Pseudooceanic?ola nitratireducens 的相對(duì)豐度均顯著高于T0和T1（Plt;0.05）；其中Pseudooceanicola nitratireducens 的相對(duì)豐度呈現(xiàn)隨污染濃度上升而顯著增加的現(xiàn)象（Plt;0.05），表明PE-MPs污染有利于這些菌的增殖。相反地，T2中Maribacter cobaltidurans、Marinibacterium profundi?maris、Pseudoalteromonas spongiae、Tenacibaculum me?sophilum、Epibacterium mobile、Vibrio parahaemolyticus和Ruegeria sp. AD91A 的相對(duì)豐度顯著低于T0（Plt;0.05），同時(shí)T1 中Epibacterium mobile、Vibrio parahae?molyticus 和Ruegeria sp. AD91A的相對(duì)豐度顯著低于T0（Plt;0.05），且Ruegeria sp. AD91A 的相對(duì)豐度呈現(xiàn)隨污染濃度上升而遞減的現(xiàn)象（Plt;0.05），表明PEMPs污染會(huì)顯著抑制這些菌的增殖。

2.3 PE-MPs污染對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群多樣性的影響

基于Bray Curtis距離對(duì)各處理菌群進(jìn)行PCoA分析，并選取貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合進(jìn)行作圖展示，如圖5 所示，第一軸解釋了61.4%，第二軸解釋了30.2%；T0、T1 和T2 三者之間的距離均較遠(yuǎn)，表明不同PE-MPs 污染濃度下凡納濱對(duì)蝦腸道菌群組成結(jié)構(gòu)存在明顯差異。

2.4 PE-MPs污染對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群豐度差異顯著物種的影響

在各處理凡納濱對(duì)蝦腸道菌群中發(fā)現(xiàn)共有物種537個(gè)，如圖6所示，T0、T1和T2特有的物種數(shù)目分別為64個(gè)（包括細(xì)菌62個(gè)、真菌1個(gè)和病毒1個(gè)）、44個(gè)（包括細(xì)菌41個(gè)、真菌1個(gè)和噬菌體2個(gè)）和62個(gè)（包括細(xì)菌61個(gè)和噬菌體1個(gè)）。

LEfSe分析常用于尋找不同處理下腸道菌群在各分類水平上豐度差異顯著的物種，為了進(jìn)一步探索不同濃度PE-MPs污染下凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的差異，將線性判別分析（LDA）閾值設(shè)為4，共篩選出24個(gè)差異顯著（Plt;0.05）菌種（候選生物標(biāo)記物）。如圖7所示，T0的差異特征菌在屬和種水平上分別找到包括Ruegeria 屬、Ruegeria sp_AD91A 和Vibrio parahaemo?lyticus 等3個(gè)；T1中的差異特征菌包括Proteobacteria門、Donghicola 屬、Phaeobacter 屬、Thalassococcus 屬、Donghicola eburneus、Phaeobacter italicus 和Thalasso?coccus sp_SH_1等7個(gè)；T2中的差異特征菌在門、綱、目、科、屬和種水平均有發(fā)現(xiàn)，包括Bacteroidetes門和Planctomycetes 門、Flavobacteriia 綱和Planctomycetia綱、Flavobacteriales 目、Flavobacteriaceae 科、Plancto?mycetaceae科、Leisingera 屬、Mameliella 屬、Xanthoma?rina 屬、Leisingera daeponensis、Mameliella alba、Xan?thomarina gelatinilytica 和Yangia pacifica 等14個(gè)。

2.5 PE-MPs污染下凡納濱對(duì)蝦腸道菌群KEGG數(shù)據(jù)庫功能注釋及富集分析

從Unigenes 注釋結(jié)果出發(fā)，如圖8 所示，凡納濱對(duì)蝦腸道菌群被注釋到氨基酸代謝、碳水化合物代謝、輔酶因子和維生素代謝、脂類代謝、全局和概述圖、其他氨基酸代謝、能量代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成、外源物質(zhì)的生物代謝和降解、轉(zhuǎn)化、萜類和酮類代謝等11個(gè)通路（相對(duì)豐度占比gt;3%）。此外，在Level 1水平上注釋到新陳代謝類通路的基因最多（gt;75%），提示凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)的菌群主要與能量獲取相關(guān)。功能通路的相對(duì)豐度差異分析顯示，PEMPs污染下氨基酸代謝、碳水化合物代謝、全局和概述圖、能量代謝、外源物質(zhì)的生物代謝和降解等5個(gè)通路的相對(duì)豐度顯著增加，而萜類和酮類代謝的相對(duì)豐度顯著下降。在KEGG Level 2水平上，對(duì)不同處理組間功能差異進(jìn)行LEfSe分析（LDAgt;2，Plt;0.05），如圖9所示，T0的特征功能通路包括：免疫系統(tǒng)，真核生物細(xì)胞的群落，折疊、排序和降解，抗腫瘤藥物的抗性，多糖的生物合成和代謝，復(fù)制與修復(fù)等6個(gè)；T1的特征功能通路為：血液循環(huán)系統(tǒng)、能量代謝、脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝等4個(gè)；T2的特征功能通路則是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性。結(jié)果表明PE-MPs的暴露污染會(huì)顯著改變凡納濱對(duì)蝦腸道菌群功能通路的組成。

3 討論

3.1 PE-MPs對(duì)理化因子的影響

PE-MPs污染后，養(yǎng)殖水體中的總氮濃度隨PEMPs的濃度增加而逐漸上升，表明PE-MPs污染會(huì)提升養(yǎng)殖水體的總氮濃度，但養(yǎng)殖水體中硝態(tài)氮濃度無顯著變化，這可能與PE-MPs不利于硝化菌的生長(zhǎng)有關(guān)。據(jù)報(bào)道，MPs對(duì)細(xì)菌生物學(xué)過程有毒性作用，能夠抑制硝化細(xì)菌（例如氨氧化細(xì)菌和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌）的活性[22-23]。因此，PE-MPs可能通過抑制氨和亞硝酸鹽向硝酸鹽的氧化而造成亞硝酸鹽的積累。有研究證實(shí)，亞硝酸鹽和MPs聯(lián)合毒性可引起凡納濱對(duì)蝦的鰓組織的結(jié)構(gòu)損傷和代謝功能障礙[24]；非靶向代謝組學(xué)研究顯示，兩者共存可嚴(yán)重干擾調(diào)控細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝與合成的PPAR信號(hào)通路，從而改變凡納濱對(duì)蝦的脂質(zhì)代謝模式[9]，這也在一定程度上解釋了腸道內(nèi)容物中脂肪的含量變化。

養(yǎng)殖水體的pH值和鹽度呈現(xiàn)隨著PE-MPs污染濃度的增加而逐漸降低的趨勢(shì)，表明PE-MPs污染可引起養(yǎng)殖水體酸化和鹽度失衡，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。據(jù)報(bào)道，在酸化條件下，MPs 對(duì)厚殼貽貝（Mytilus coruscus）消化性能和免疫力的損害增強(qiáng)[25]。水體鹽度是海洋動(dòng)物一系列生理過程的重要控制因素，包括攝食、代謝和滲透壓調(diào)節(jié)。研究表明，MPs在低鹽度情況下抑制了海洋動(dòng)物的攝食量和呼吸速率，導(dǎo)致其氨排泄率增加并進(jìn)入應(yīng)激狀態(tài)[26]。可見，PEMPs污染引起的養(yǎng)殖水體酸化和鹽度降低，可能會(huì)進(jìn)一步增加PE-MPs對(duì)凡納濱對(duì)蝦的毒性。

3.2 PE-MPs對(duì)菌群組成的影響

對(duì)各處理菌群的組成特征進(jìn)行分析，共獲得16個(gè)門、18個(gè)綱、38個(gè)目、77個(gè)科、272個(gè)屬和527個(gè)種，表明對(duì)蝦腸道菌群組成結(jié)構(gòu)較為豐富[27-30]；各處理菌群PCoA 分析結(jié)果顯示，不同濃度PE-MPs污染下腸道菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異（圖5），表明PE-MPs污染顯著改變凡納濱對(duì)蝦腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)。有報(bào)道顯示聚苯乙烯微球在對(duì)蝦腸道的蓄積引起其腸道菌群多樣性的變化，從而對(duì)腸道健康產(chǎn)生毒性作用，特別是一些潛在的病原菌的豐度改變[9]，這可能與MPs表面能夠定殖微生物并形成塑料際生物膜，從而改變MPs周圍環(huán)境的菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)[31-32]。

共有物種和特有物種的分析結(jié)果（圖6）顯示：各處理菌群中共有（核心）物種占比達(dá)到75.95%（537個(gè)），T0、T1和T2各處理特有的物種占比僅為總物種數(shù)量的9.05%（64個(gè)）、6.22%（44個(gè)）和8.77%（62個(gè)），表明PE-MPs污染會(huì)導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的特有物種產(chǎn)生變化，但特有物種數(shù)量的變化幅度較低。特征微生物差異分析結(jié)果顯示（圖7），隨著PE-MPs污染濃度的增加，凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的特征微生物組成和數(shù)量也發(fā)生變化，表明PE-MPs的污染會(huì)顯著改變凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的特征微生物。Mameliel?la alba、Pseudomonas aeruginosa 和Klebsiella pneumoni?ae 等已被報(bào)道為水生生物和人類致病菌[33-35]，PEMPs污染下這些菌的相對(duì)豐度顯著上升，表明PEMPs污染會(huì)顯著提高凡納濱對(duì)蝦腸道的致病風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，塑料中的主要毒性化合物鄰苯二甲酸酯的降解菌Salipiger profundus[36]的相對(duì)豐度隨著PE-MPs污染而逐步下降，存在增加塑料制品在凡納濱對(duì)蝦腸道蓄積化學(xué)毒性的可能；此外，Sulfitobacter sp.SK025、Pseu?dophaeobacter arcticus、Muricauda lutaonensis、Cribri?habitans marinu 和Planktotalea frisia 等來自海水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)和浮游藻類共生菌菌株[37-41]的相對(duì)豐度也顯著下降。在生物合成和代謝菌方面，相關(guān)報(bào)道顯示Maribacter cobaltidurans 能夠產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)玉米黃素[42]，Marinibacterium profundimaris 可產(chǎn)生具有抗氧化和紫外輻射功能的二甲基磺酸丙酯[43]，Pseudoal?teromonas spongiae 可以降解和利用海藻酸鹽[44]，Epi?bacterium mobile 具有較強(qiáng)的生物鈣化活性[45]，Ruege?ria sp. AD91A具有較強(qiáng)的氨基酸代謝和硫代硫酸鹽氧化能力[46]，而這些菌的相對(duì)豐度在高污染濃度下呈現(xiàn)顯著的下降（Plt;0.05），表明PE-MPs的暴露顯著抑制了凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的生物代謝活性。

3.3 PE-MPs對(duì)菌群代謝功能通路的影響

KEGG數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果（圖8）發(fā)現(xiàn)各處理中相對(duì)豐度較高（gt;3%）的11個(gè)功能通路中，有8個(gè)是與代謝作用相關(guān)的，在T0、T1 和T2 中的占比分別達(dá)到61.74%、62.54%和62.06%，具體包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝、輔酶因子和維生素代謝、類脂質(zhì)代謝、其他氨基酸代謝、能量代謝、外源性物質(zhì)的生物降解、代謝和轉(zhuǎn)化、萜類化合物和酮類化合物代謝，表明凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的代謝功能最為活躍[29]，這為后續(xù)對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群功能的深度解析提供了思路。在不同濃度PE-MPs污染下，凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的特征功能通路存在顯著變化（圖9）；同時(shí)，功能通路的相對(duì)豐度差異分析顯示，PE-MPs污染下萜類和酮類代謝的相對(duì)豐度顯著下降，表明PE-MPs的暴露顯著抑制了凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的萜類和酮類代謝的活性，這可能是由于PE-MPs抑制了凡納濱對(duì)蝦腸道生物代謝活性菌株的相對(duì)豐度，如：可合成代謝萜類的玉米黃素的Maribacter cobaltidurans[42]、可以降解和利用海藻酸鹽的Pseudoalteromonas spongiae[44]、具有較強(qiáng)的氨基酸代謝和硫代硫酸鹽氧化能力的Ruege?ria sp. AD91A[46]相對(duì)豐度均顯著下降，從而抑制凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的生物活性功能，對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群產(chǎn)生毒性效應(yīng)，最終影響凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)[2，28]，這與聚乙烯微球?qū)Ψ布{濱對(duì)蝦腸道菌群的毒性效應(yīng)的研究結(jié)果基本一致[9]。

4 結(jié)論

（1）PE-MPs污染導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中總氮含量顯著提高，pH值和鹽度顯著下降。

（2）PE-MPs污染顯著改變凡納濱對(duì)蝦腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)、特有物種和特征微生物種類和數(shù)量，以及生物活性、水生生物和人類致病菌的相對(duì)豐度；Dong?hicola eburneus、Phaeobacter italicus、Thalassococcus sp.SH. 1、Leisingera daeponensis、Mameliella alba、Xantho?marina gelatinilytica 和Yangia pacifica 等菌株可作為凡納濱對(duì)蝦腸道被聚乙烯污染時(shí)的候選生物標(biāo)記物。

（3）凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的代謝功能最為活躍，PE-MPs暴露以及污染濃度的上升，導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的代謝通路組成和特征發(fā)生了顯著變化，顯著抑制了萜類和聚酮類化合物的代謝功能通路的活性。

參考文獻(xiàn)：

[1] RITVO G， SAMOCHA T M， LAWRENCE A L， et al. Growth of

Penaeus vannamei on soils from various Texas shrimp farms， under

laboratory conditions[J]. Aquaculture， 1998， 163（1/2）：101-110.

[2] ZHANG M L， SUN Y H， CHEN K， et al. Characterization of the

intestinal microbiota in Pacific white shrimp， Litopenaeus vannamei，

fed diets with different lipid sources[J]. Aquaculture， 2014， 434：449-

455.

[3] XIONG J B， ZHU J L， ZHANG D M. The application of bacterial

indicator phylotypes to predict shrimp health status[J]. Applied

Microbiology and Biotechnology， 2014， 98（19）：8291-8299.

[4] LIU H Y， ZHANG X J， TAN B P， et al. Effect of dietary potassium on

growth， nitrogen metabolism， osmoregulation and immunity of Pacific

white shrimp（Litopenaeus vannamei）reared in low salinity seawater[J].

Journal of Ocean University of China， 2014， 13（2）：311-320.

[5] WANG Y， LI Z， LI J， et al. Effects of dietary chlorogenic acid on

growth performance， antioxidant capacity of white shrimp Litopenaeus

vannamei under normal condition and combined stress of low-salinity

and nitrite[J]. Fish amp; Shellfish Immunology， 2015， 43（2）：337-345.

[6] REN X Y， PAN L Q， WANG L. Metabolic enzyme activities，

metabolism-related genes expression and bioaccumulation in juvenile

white shrimp Litopenaeus vannamei exposed to benzo[a] Pyrene[J].

Ecotoxicology and Environmental Safety， 2014， 104：79-86.

[7] REN X Y， PAN L Q， WANG L. Effect of florfenicol on selected

parameters of immune and antioxidant systems， and damage indexes of

juvenile Litopenaeus vannamei following oral administration[J].

Aquaculture， 2014， 432：106-113.

[8] SUO Y T， LI E C， LI T Y， et al. Response of gut health and microbiota

to sulfide exposure in Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei[J].

Fish amp; Shellfish Immunology， 2017， 63：87-96.

[9] XING Y F， ZHU X Y， HUANG J H， et al. Toxic effects of microplastics

and nitrite exposure on intestinal histology， digestion， immunity， and

microbial community of shrimp Litopenaeus vannamei[J]. Marine

Pollution Bulletin， 2024， 200：116077.

[10] GU H X， WANG S X， WANG X H， et al. Nanoplastics impair the

intestinal health of the juvenile large yellow croaker Larimichthys

crocea[J]. Journal of Hazardous Materials， 2020， 397：122773.

[11]侯梅芳， 岳凝， 王恩鴻， 等. 微塑料在水產(chǎn)養(yǎng)殖水域中的分布及在

魚體內(nèi)的富集和毒性效應(yīng)[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 1-18[2025-01-

22]. https：//link.cnki.net/urlid/12.1347.S.20250121.1519.002. HOU

M F， YUE N， WANG E H， et al. Microplastics in aquaculture：

distribution， bioaccumulation， and effects on fish[J]. Journal of Agro-

Environment Science， 1-18[2025-01-22]. https：//link.cnki.net/urlid/

12.1347.S.20250121.1519.002.

[12] 陳斌， 宋丹碩， 李昊慧， 等. 紅樹林海水養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦微塑料賦

存特征、來源和影響因素[J]. 環(huán)境保護(hù)科學(xué)， 2023， 49（3）：49-56.

CHEN B， SONG D S， LI H H， et al. Occurrence characteristics，

sources and influencing factors of microplastics in Penaeus vannamei

from mangrove wetland[J]. Environmental Protection Science， 2023， 49

（3）：49-56.

[13] XIONG J B， ZHU J Y， DAI W F， et al. Integrating gut microbiota

immaturity and disease-discriminatory taxa to diagnose the initiation

and severity of shrimp disease[J]. Environmental Microbiology， 2017，

19（4）：1490-1501.

[14] 張家松， 段亞飛， 張真真， 等. 對(duì)蝦腸道微生物菌群的研究進(jìn)展[J].

南方水產(chǎn)科學(xué)， 2015， 11（6）：114-119. ZHANG J S， DUAN Y F，

ZHANG Z Z， et al. Research progress of intestinal microbial flora in

shrimp[J]. South China Fisheries Science， 2015， 11（6）：114-119.

[15] HUANG Z B， LI X Y， WANG L P， et al. Changes in the intestinal

bacterial community during the growth of white shrimp， Litopenaeus

vannamei[J]. Aquaculture Research， 2016， 47（6）：1737-1746.

[16] GAO S， PAN L Q， HUANG F， et al. Metagenomic insights into the

structure and function of intestinal microbiota of the farmed Pacific

white shrimp（Litopenaeus vannamei）[J]. Aquaculture， 2019， 499：

109-118.

[17] ZENG S Z， HUANG Z J， HOU D W， et al. Composition， diversity and

function of intestinal microbiota in Pacific white shrimp（Litopenaeus

vannamei）at different culture stages[J]. PeerJ， 2017， 5：e3986.

[18] CARDONA E， GUEGUEN Y， MAGRé K， et al. Bacterial community

characterization of water and intestine of the shrimp Litopenaeus

stylirostris in a biofloc system[J]. BMC Microbiology， 2016， 16（1）：

157.

[19] 宋盛憲， 李色東， 陳丹. 南美白對(duì)蝦健康養(yǎng)殖技術(shù)[M]. 2版. 北京：

化學(xué)工業(yè)出版社， 2013：73-96. SONG S X， LI S D， CHEN D.

Healthy culture technology of Penaeus vannamei[M]. 2nd Edition.

Beijing：Chemical Industry Press， 2013：73-96.

[20] 曹煜成， 文國(guó)樑， 李卓佳， 等. 南美白對(duì)蝦高效養(yǎng)殖與疾病防治技

術(shù)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社， 2014：26-35. CAO Y C， WEN G L，

LI Z J. Technologies of efficient aquaculture and disease prevention

for Pacific white shrimp[M]. Beijing：Chemical Industry Press， 2014：

26-35.

[21] 哈希公司編譯. 水質(zhì)分析實(shí)用手冊(cè)[M]. 2版. 北京：化學(xué)工業(yè)出版

社， 2016：239-305. HACH. Water quality analysis handbook[M].

2nd Edition. Beijing：Chemical Industry Press， 2016：239-305.

[22] MENG L J， HU X， WEN B， et al. Microplastics inhibit biofloc

formation and alter microbial community composition and nitrogen

transformation function in aquaculture[J]. Science of the Total

Environment， 2023， 866：161362.

[23] WEI W， HUANG Q S， SUN J， et al. Polyvinyl chloride microplastics

affect methane production from the anaerobic digestion of waste

activated sludge through leaching toxic bisphenol-A[J]. Environmental

Science amp; Technology， 2019， 53（5）：2509-2517.

[24] LI Z S， MA S， SHAN H W， et al. Responses of hemocyanin and

energy metabolism to acute nitrite stress in juveniles of the shrimp

Litopenaeus vannamei[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，

2019， 186：109753.

[25] WANG X H， HUANG W， WEI S S， et al. Microplastics impair

digestive performance but show little effects on antioxidant activity in

mussels under low pH conditions[J]. Environmental Pollution， 2020，

258：113691.

[26] SUI Y M， XUE Z Y， CHEN S H， et al. Investigation of physiological

energetic response of the thick shell mussel， Mytilus coruscus， to

microplastics and low salinity：potential countermeasures to multienvironmental

changes[J]. Aquaculture， 2023， 569：739382.

[27] DUAN Y F， XIONG D L， WANG Y， et al. Toxicological effects of

microplastics in Litopenaeus vannamei as indicated by an integrated

microbiome， proteomic and metabolomic approach[J]. Science of the

Total Environment， 2021， 761：143311.

[28] 趙月季， 郭海朋， 張德民. 不同養(yǎng)殖模式對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道微生物

群落的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)， 2021， 45（2）：221-234. ZHAO Y J，

GUO H P， ZHANG D M. Effects of different culture patterns on the

intestinal microbiota of Litopenaeus vannamei[J]. Journal of Fisheries

of China， 2021， 45（2）：221-234.

[29] LE L A， NGUYEN-HOANG T P， HUYNH V P， et al. Microbiome

dataset analysis from a shrimp pond in Ninh Thuan， Vietnam using

shotgun metagenomics[J]. Data in Brief， 2020， 31：105731.

[30] AMARAL-ZETTLER L A， ZETTLER E R， MINCER T J. Ecology of

the plastisphere[J]. Nature Reviews Microbiology， 2020， 18（3）：139-

151.

[31] ZETTLER E R， MINCER T J， AMARAL-ZETTLER L A. Life in the

\"plastisphere\"：microbial communities on plastic marine debris[J].

Environmental Science amp; Technology， 2013， 47（13）：7137-7146.

[32] BRAR A K， BERGMANN D， et al. Culture-based analysis of‘Cave

Silver’biofilms on Rocks in the former Homestake mine in south

Dakota， USA[J]. International Journal of Speleology， 2019， 48（2）：

145-154.

[33] REN C Z， GAO H M， DAI J， et al. Taxonomic and bioactivity

characterizations of Mameliella alba strain LZ-28 isolated from

highly toxic marine dinoflagellate Alexandrium catenella LZT09[J].

Marine Drugs， 2022， 20（5）：321.

[34] REYNOLDS D， KOLLEF M. The epidemiology and pathogenesis and

treatment of Pseudomonas aeruginosa infections：an update[J]. Drugs，

2021， 81（18）：2117-2131.

[35] ABBAS R， CHAKKOUR M， ZEIN EL DINE H， et al. General

overview of Klebsiella pneumonia：epidemiology and the role of

siderophores in its pathogenicity[J]. Biology， 2024， 13（2）：78.

[36] LIU Y， LUO T Y， LIN Q， et al. Draft genome sequence of Salipiger sp.

strain D13， a phthalate ester-degrading bacterium isolated from deepsea

sediments[J]. Microbiology Resource Announcements， 2020， 9

（17）：e00181-19.

[37] 黃雪敏， 溫崇慶， 梁華芳， 等. 健康和發(fā)病凡納濱對(duì)蝦糠蝦期育苗

池水體的菌群結(jié)構(gòu)比較[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)， 2018， 38（4）：27-

34. HUANG X M， WEN C Q， LIANG H F， et al. Comparison of

bacterial community structure in larval rearing water between healthy

and diseased Litopenaeus vannamei mysis[J]. Journal of Guangdong

Ocean University， 2018， 38（4）：27-34.

[38] ZHANG D C， LI H R， XIN Y H， et al. Phaeobacter arcticus sp. nov. ， a

psychrophilic bacterium isolated from the Arctic[J]. International

Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2008， 58（Pt 6）：

1384-1387.

[39] HAMEED A， ARUN A B， HO H P， et al. Supercritical carbon dioxide

micronization of Zeaxanthin from moderately thermophilic bacteria

Muricauda lutaonensis CC-HSB-11T[J]. Journal of Agricultural and

Food Chemistry， 2011， 59（8）：4119-4124.

[40] CHEN Z， LIU Y， LIU L Z， et al. Cribrihabitans marinus gen. nov. ， sp.

nov.， isolated from a biological filter in a marine recirculating

aquaculture system[J]. International Journal of Systematic and

Evolutionary Microbiology， 2014， 64（Pt 4）：1257-1263.

[41] HAHNKE S， SPERLING M， LANGER T， et al. Distinct seasonal

growth patterns of the bacterium Planktotalea frisia in the North Sea

and specific interaction with phytoplankton algae[J]. FEMS

Microbiology Ecology， 2013， 86（2）：185-199.

[42] CHEN Y R， XIE J M， YANG M， et al. Marine Flavobacteriaceae

produce Zeaxanthin via the mevalonate pathway[J]. Marine Life

Science amp; Technology， 2025， 7（1）：132-143.

[43] SHAW D K， SEKAR J， RAMALINGAM P V. Recent insights into

oceanic dimethylsulfoniopropionate biosynthesis and catabolism[J].

Environmental Microbiology， 2022， 24（6）：2669-2700.

[44] XU F， CHA Q Q， ZHANG Y Z， et al. Degradation and utilization of

alginate by marine Pseudoalteromonas：a review[J]. Applied and

Environmental Microbiology， 2021， 87（17）：e0036821.

[45] VINCENT J， COLIN B， LANNELUC I， et al. New biocalcifying

marine bacterial strains isolated from calcareous deposits and

immediate surroundings[J]. Microorganisms， 2021， 10（1）：76.

[46] SU X Y， CUI H， ZHANG W P. Copiotrophy in a marine-biofilmderived

Roseobacteraceae bacterium can be supported by amino acid

metabolism and thiosulfate oxidation[J]. International Journal of

Molecular Sciences， 2023， 24（10）：8617.

（責(zé)任編輯：宋瀟）