tPA基因甲基化/去甲基化在丙泊酚保護抑郁大鼠電休克后學習記憶功能中的作用

張帆 朱賢林

[摘要] 目的 探討丙泊酚改善抑郁大鼠電休克治療（ECT）后學習記憶功能的組織型纖溶酶原激活物（tPA）基因甲基化/去甲基化調控機制。 方法 成年雄性SD大鼠72只，隨機取18只作為對照組（C組），剩余54只大鼠進行抑郁造模后隨機分為D組、E組、F組，每組18只。C組不予實驗處理;D組腹腔注射生理鹽水+偽ECT;E組腹腔注射生理鹽水+ECT;F組腹腔注射丙泊酚+ECT。采用糖水偏好百分比（SPP）、逃避潛伏期（EL）及空間探索時間（SET）檢測大鼠抑郁行為及學習功能;逆轉錄PCR檢測海馬tPA、DNA甲基轉移酶（DNMT）1、DNMT3a、DNMT3b及10～11易位（TET）1mRNA水平;Western blot檢測海馬tPA及DNMT1的表達;MeDIP-qPCR檢測tPA甲基化率。 結果 ECT處理后，與D組比較，E、F組SPP上升，E組EL延長、SET縮短，海馬CA1區tPA mRNA及蛋白表達下降，DNMT1 mRNA及蛋白表達增加，tPA甲基化率增加，差異有統計學意義（均P < 0.05）;與E組比較，F組EL縮短、SET延長，海馬CA1區tPA mRNA及蛋白表達增加，DNMT1 mRNA及蛋白表達下降，tPA甲基化率降低（均P < 0.05）;各組DNMT3a、DNMT3b及TET1 mRNA的表達差異無統計學意義（均P > 0.05）。 結論 丙泊酚能夠有效減輕ECT誘導的學習記憶損傷，其機制可能與下調海馬CA1區DNMT1表達減輕tPA的甲基化水平，增加tPA mRNA及蛋白表達水平有關。

[關鍵詞] 丙泊酚;電休克;組織型纖溶酶原激活物;表觀遺傳學;學習記憶功能

[中圖分類號] R749.054? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）08（a）-00

11-06

[Abstract] Objective To investigate the protective effect of Propofol on learning and memory function in depressive rats after electroshock therapy （ECT） by regulating tissue plasminogen activator （tPA） gene methylation/demethylation. Methods Seventy-two adult male SD rats were used in this study and eighteen rats were randomly selected as the control group （group C）. The remaining fifty-four rats were randomly divided into group D， group E and group F after depressive modeling， with 18 rats in each group. Group C was not given experimental treatment; group D was intraperitoneally injected with normal saline + pseudo-ECT; group E was intraperitoneally injected with normal saline + ECT; group F was intraperitoneally injected with Propofol + ECT. Depressive behavior and learning function of rats were measured by sucrose preference percentage （SPP）， escape latency （EL） and space exploration time （SET）. The mRNA levels of hippocampus tPA， DNA methyltransferase （DNMT） 1， DNMT3a， DNMT3b and ten-elevan translocation （TET） 1 were detected by reverse transcription PCR. The expressions of tPA and DNMT1 in hippocampus were detected by Western blot. MeDIP-qPCR was used to detect tPA methylation rate. After ECT treatment， compared with group D， SPP increased in Group E and F， EL prolonged and SET shortened in group E， tPA mRNA and protein expression in hippocampal CA1 area decreased， DNMT1 mRNA and protein expression increased， and tPA methylation rate increased， with statistically significant differences （all P < 0.05）. Compared with group E， in group F， EL shortened and SET prolonged， tPA mRNA and protein expression in hippocampal CA1 area increased， DNMT1 mRNA and protein expression decreased， and tPA methylation rate decreased （all P < 0.05）. There was no significant difference in mRNA expression of DNMT3a， DNMT3b and TET1 in each group （all P > 0.05）. Conclusion Propofol can effectively reduce ECT-induced learning and memory impairment in depressive rats. The mechanism may be related to the downregulate the expression of DNMT1 in the hippocampal CA1 region to reduce the methylation level of the tPA gene resulting in increase the expression level of tPA mRNA and protein.

[Key words] Propofol; Electroshock; Tissue plasminogen activator; Epigenetics; Learning and memory function

電休克治療（electroconvulsive therapy，ECT）是治療抑郁癥起效最快的方法，但存在學習記憶功能損害等副作用[1-3]。本課題組前期研究[4]發現，丙泊酚麻醉下行ECT可以明顯減輕抑郁大鼠的學習記憶功能損害，且與調節海馬內組織型纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）相關，然而該研究卻未能揭示丙泊酚在此過程中對tPA基因表達的調節機制以及海馬CA3及DG區是否也參與其中。研究[5]顯示，表觀遺傳修飾等在基因的轉錄中發揮了重要的作用，主要包括DNA甲基化/去甲基化等。DNA的甲基化由DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化完成，DNA在DNMTs的作用下使其CpG二核苷酸5′端的胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC），導致轉錄活性下降[6]。真核細胞主要表達3類DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b，其中DNMT2作用尚不清楚[7]。研究[8]顯示，5-mC的水平是由DNA甲基化和去甲基化共同決定，DNA中5-mC可在10～11易位（ten-eleven translocation，TET）蛋白家族的羥基化作用下進一步修飾為5-羥甲基胞嘧啶，誘發DNA去甲基化改變，且TET蛋白家族的TET1在腦部的表達水平較高。

本研究擬明確丙泊酚是否可能通過調節海馬各分區DNMT1、DNMT3a、DNMT3b及TET1的表達，進而影響tPA mRNA的水平參與抑郁大鼠ECT后學習記憶功能的變化，以期為臨床應用丙泊酚保護抑郁患者ECT后學習記憶功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及建模

2～3月齡健康SD大鼠72只，雄性，SPF級，體重180～250 g。由重慶醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（渝）2018-0008，實驗動物合格證號：0017476。本研究已通過四川省簡陽市人民醫院科學倫理委員會批準。動物飼養于動物實驗研究中心，SPF飼養環境：室溫22℃，相對濕度65%，單籠飼養。隨機獲取54只大鼠采用慢性不可預見性應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）建立抑郁模型[4]。大鼠每天隨機給予1種刺激：明暗顛倒24 h，4℃冰水游泳5 min，45℃熱水游泳5 min，禁飲24 h，禁食24 h，夾尾1 min，水平搖晃鼠籠10 min，潮濕墊料24 h，45°鼠籠傾斜24 h。2 d不連續使用同種刺激，連續28 d。CUMS處理后，通過行為學方法評估大鼠抑郁狀態，所有大鼠均成功建模。

1.2 動物分組及處理方法

將剩余18只SD大鼠列為對照組（C組）;取建模成功的抑郁大鼠隨機分為抑郁組（D組）、ECT組（E組）、ECT+丙泊酚組（F組），每組18只。C組不予實驗處理;D組腹腔注射8 mL/kg生理鹽水后行偽ECT處理，即兩耳夾電極但不予通電;E組腹腔注射生理鹽水8 mL/kg后行ECT（Niviqure-SA型，印度Niviqure公司）處理，電極放置方法與偽ECT一致，輸出電量約120 mC，以引發大鼠強直—陣攣抽搐作為ECT誘發成功標準[4]。F組腹腔注射丙泊酚注射液80 mg/kg（批號：NG149，意大利AstraZeneca公司）后行ECT處理，方法同E組。實驗處理1次/d，連續7 d。ECT處理期間，E組和F組大鼠吸入50% O2，維持其正常呼吸功能。

1.3 大鼠行為學檢測

1.3.1 糖水偏好實驗? 以糖水偏愛百分比（sucrose preference percentage，SPP）作為衡量指標。實驗前，訓練動物適應含糖飲水，每籠放置兩個水瓶。第一個24 h，兩瓶均裝有1%蔗糖水;隨后的24 h，一瓶裝1%蔗糖水，另一瓶裝純水。24 h禁食禁水后進行糖水偏好實驗：同時給予每只大鼠事先定量好的兩瓶水：一瓶1%蔗糖水，一瓶純水，24 h后取走兩瓶并稱重，計算大鼠總液體消耗、糖水消耗及SPP。SPP=（糖水消耗/總液體消耗）×100%[4]。

1.3.2 Morris水迷宮實驗? 建模前后及實驗處理后，各進行1次Morris水迷宮實驗。水箱分為SE、SW、NW、NE 4個象限。第1～5天進行逃避潛伏期（escape latency，EL）實驗：將NE象限設置為目標象限，每只大鼠隨機選定1個入水象限，然后按照逆時針方向依次從各象限入水，從入水開始計時，到登上平臺為止，記錄為EL;若大鼠60 s內未上平臺，將其引上平臺，并計EL為60 s。取第3～5天的平均值作為EL最終成績。大鼠第6天進行空間探索實驗：撤除目標象限中的平臺，讓大鼠從目標象限的對側象限入水，記錄大鼠60 s時間內在目標象限的停留時間為空間探索時間（space exploration time，SET）[4]。

1.4 逆轉錄PCR（Rt-PCR）分析

每組取6只大鼠分離海馬并提取RNA。根據基因庫tPA、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、TET1及GAPDH的序列，設計tPA的上游引物為5′-AGAGAGGTTTC-CACCCCATC-3′，下游引物為5′-CTGTCCAGTCAG-GGAGCTGT-3′;DNMT1的上游引物為5′- CAGAT-GTTCCATGCACACT -3′，下游引物為5′- TGTGGATG-TAGGAAAGTTGCA-3′;DNMT3a的上游引物為5′-AGGGACATGGGGGCAAACT-3′，下游引物為5′-GC-AAGAAACAAAAACCCAAAC-3′;DNMT3b的上游引物為5′-GGACTACTTTGCATGTGAATA-3′，下游引物為5′-GCTGTTGTTTTGGTATCTTAG-3′;TET1的上游引物為5′-TGGCCAGAAGGGAAAAGCAA-3′，下游引物為5′-TAATCACCCACTTGGCGACC-3′;GAPDH的上游引物為5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGA-3′，下游引物為5′-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。將逆轉錄產物進行擴增，擴增條件：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，47℃延伸30 s，31個循環后72℃補充延伸3 min。取等量擴增產物電泳，使用凝膠發光圖像分析系統顯影，目的mRNA與GAPDH mRNA比值即為目的mRNA相對表達水平。

1.5 Western blot分析

每組取6只大鼠分離海馬并提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白與上樣緩沖液混合，100℃煮沸5 min，樣品經電泳后電轉至PVDF膜上，膜經BSA 37℃封閉1 h后與相應一抗[大鼠抗tPA抗體（Abcam，ab157469）、大鼠抗DNMT1抗體（Abcam，ab188453）及大鼠抗GAPDH抗體（上海碧云天生物技術研究所，AF0006）]結合，4℃孵育過夜。沖洗后滴加辣根過氧化酶標記的二抗37℃溫孵2 h，漂洗后采用ECL法顯色，以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達水平。

1.6 MeDIP-定量聚合酶鏈反應

各組采用Qiagen基因組DNA提取試劑盒提取6只大鼠海馬DNA并檢測其純度及完整性;采用超聲儀對DNA進行隨機片段化（400～500 bp），并取5 μL于2%瓊脂糖凝膠電泳;加熱變性后將單鏈DNA樣品分成兩份，其中一份作為IP加入抗5-mC抗體，另一份作為input抗體。使用免疫磁珠分離上述樣品中甲基化DNA片段的抗體復合物，通過酚氯仿抽提和乙醇沉淀法純化免疫共沉淀的甲基化DNA片段（MeDIP）并檢測DNA濃度。qPCR在熒光定量PCR 儀（ABI，StepOnePlus）上進行，分別記錄Ct值，用Ctinput和CtMeDIP表示。tPA的甲基化率=2 （Ctinput-CtMeDIP）×100%。

1.7 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量資料符合正態分布以均數±標準差（x±s）表示，并行方差齊性檢驗。部分行為學數據采用重復測量數據的方差分析，其余數據采用單因素方差分析且兩兩比較采用LSD-t法。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠CUMS建模前后及ECT處理后SPP和Morris水迷宮結果比較

CUMS建模前，各組大鼠SPP比較，差異無統計學意義（P > 0.05）;CUMS建模后，與C組比較，D組、E組及F組SPP下降，EL明顯延長、SET明顯縮短，差異有統計學意義（P < 0.05）;ECT處理后，與D組比較，E組、F組SPP明顯升高、EL明顯延長、SET明顯縮短，差異有統計學意義（P < 0.05）;與C組比較，D組及F組SPP下降，且D組、E組及F組EL明顯延長、SET明顯縮短，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 海馬各分區tPA、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b及TET1 mRNA表達情況

各組大鼠海馬CA1區tPA及DNMT1 mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（P < 0.05）;CA3區及DG區tPA及DNMT1 mRNA表達水平比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。與C組比較，D組、E組和F組tPA mRNA表達水平降低，DNMT1 mRNA表達水平升高，差異有統計學意義（P < 0.05）;與D組比較，E組和F組tPA mRNA表達水平降低，DNMT1 mRNA表達水平升高，差異有統計學意義（P < 0.05）;與E組比較，F組tPA mRNA表達水平升高，DNMT1 mRNA表達水平降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。各組大鼠海馬各區DNMT3a、DNMT3b及TET1 mRNA表達水平比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠海馬CA1區tPA及DNMT1蛋白相對表達水平及tPA啟動子區甲基化率比較

各組大鼠海馬CA1區tPA及DNMT1的蛋白相對表達水平及tPA啟動子區甲基化率比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。與C組比較，D 組、E組和F組tPA蛋白相對表達水平降低，DNMT1蛋白相對表達水平及tPA啟動子區甲基化率升高，差異有統計學意義（P < 0.05）;與D組比較，E組和F組tPA蛋白相對表達水平降低，DNMT1蛋白相對表達水平及tPA啟動子區甲基化率升高，差異有統計學意義（P < 0.05）;與E組比較，F組tPA蛋白相對表達水平升高，DNMT1蛋白相對表達水平及tPA啟動子區甲基化率降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖1，表3。

3 討論

本研究結果發現，抑郁造模降低了大鼠的SPP，增加其EL，縮短SET，大鼠表現出抑郁行為和學習記憶功能的下降。盡管ECT處理能夠提高抑郁大鼠的SPP，改善其抑郁樣行為，但同時增加了大鼠的EL及縮短了SET，大鼠表現出學習記憶功能的損傷。然而，丙泊酚預處理有效改善ECT后抑郁大鼠的學習記憶功能。

本課題組前期研究顯示，海馬內tPA的表達變化是調節抑郁大鼠ECT后學習記憶功能改變的重要原因[4]。本研究結果進一步明確，抑郁大鼠ECT后學習記憶功能的損傷僅與海馬CA1區tPA基因及蛋白的表達下調相關，丙泊酚預處理能夠減少抑郁大鼠海馬CA1區tPA基因及蛋白的表達下調，改善抑郁大鼠的學習記憶功能。這一結果與之前研究中電生理實驗的結果相符，提示海馬CA1區是調節抑郁大鼠ECT后學習記憶功能的關鍵區域。真核生物基因的表達受到多種遺傳因素的共同調控[9-12]。近年來，有關于DNA啟動子區域甲基化及去甲基化的表觀遺傳學修飾機制是諸多學者關注的重點[13-15]。新近的研究顯示，DNA甲基化是長期記憶形成和維持的分子機制之一，可通過影響突觸相關蛋白的表達來調控突觸可塑性和學習記憶[16-17]。Levenson等[18]通過使用DNMTs抑制劑干預離體小鼠海馬的腦片后發現， 記憶促進相關基因啟動子區域甲基化減少，海馬腦片長時程記憶減弱，提示DNA甲基化參與了中樞神經系統突觸可塑性。Miller等[19]也發現，大鼠在條件性恐懼記憶形成過程中，海馬區蛋白磷酸酶1 基因甲基化水平增高，應用DNMTs抑制劑可以逆轉其甲基化，阻礙了恐懼記憶的形成。研究顯示DNA甲基化也能夠影響到神經細胞tPA 的表達水平。體外實驗證實，乙醇孵育能夠下調星形膠質細胞內tPA mRNA及蛋白質的表達，而加入DNMT抑制劑后能夠明顯的增加該細胞內tPA的表達[20]。對于去甲基化酶TET1的研究則顯示，TET1 基因敲除小鼠海馬區神經元生成障礙伴學習記憶能力損傷，同時與前體細胞分化相關的基因表現為高甲基化和表達下調，提示TET1與神經元前體細胞的分化以及學習記憶等認知功能密切相關[21]。為了進一步明確丙泊酚對接受ECT的抑郁大鼠海馬tPA基因甲基化的影響，本實驗觀察了海馬各區甲基化酶及去甲基化酶的表達變化，結果顯示海馬CA1區DNMT1的表達變化可能與接受不同處理抑郁大鼠的學習記憶功能變化相關。此外，本研究結果同時發現海馬各分區DNMT3a、DNMT3b及TET1并未參與抑郁大鼠學習記憶功能的變化，提示海馬CA1區的DNMT1的改變可能是影響tPA基因表達的核心因素。鑒于DNA的甲基化酶及去甲基化酶均為非特異性酶，可作用于多種基因，本研究進一步驗證了tPA啟動子區域的甲基化狀態。本研究結果顯示，與海馬CA1區的DNMT1表達變化趨勢相符，抑郁能夠增加海馬CA1區tPA啟動子區域的甲基化水平，ECT則進一步增加了tPA的甲基化，丙泊酚能夠減輕ECT引起的tPA甲基化改變，推測丙泊酚可以通過減少海馬CA1區DNMT1的表達，抑制tPA啟動子區域的甲基化水平，進而增加tPA蛋白及mRNA的表達水平，在ECT的治療過程中發揮學習記憶功能的保護作用。

鑒于DNMT抑制劑作用的廣譜性，因此本研究無法使用DNMT抑制劑特異性下調DNMT1的表達，進一步驗證tPA的表達變化對大鼠學習記憶功能的影響，這可能是本研究的主要不足之處[22-23]。此外，表觀遺傳學機制尚涉及組蛋白的乙?；?去乙?；龋@些機制是否參與了丙泊酚對抑郁大鼠電休克處理的學習記憶保護作用尚不明確，后續需進一步深入研究[24-25]。

綜上所述，丙泊酚能夠有效減輕抑郁大鼠ETC后的學習記憶損傷，其機制可能與下調海馬CA1區DNMT1表達減輕tPA啟動區域的甲基化水平，增加tPA mRNA及蛋白表達水平有關。

[參考文獻]

[1]? Akambadiyar R，Bhat PS，Prakash J. Study of memory changes after electroconvulsive therapy [J]. Ind Psychiatry J，2018，27（2）：201-205.

[2]? Luccarelli J，McCoy TH Jr，Seiner SJ，et al. Maintenance ECT is associated with sustained improvement in depression symptoms without adverse cognitive effects in a retrospective cohort of 100 patients each receiving 50 or more ECT treatments [J]. J Affect Disord，2020，271：109-114.

[3]? Kronsell A，Nordenskj？觟ld A，Tiger M. Less memory complaints with reduced stimulus dose during electroconvulsive therapy for depression [J]. J Affect Disord，2019，259：296-301.

[4]? Zhang F，Luo J，Min S，et al. Propofol alleviates electroconvulsive shock-induced memory impairment by modulating proBDNF/mBDNF ratio in depressive rats [J]. Brain Res，2016，1642：43-50.

[5]? Ginno PA，Gaidatzis D，Feldmann A，et al. A genome-scale map of DNA methylation turnover identifies site-specific dependencies of DNMT and TET activity [J]. Nat Commun，2020，11（1）：2680.

[6]? Wang X，Bhandari RK. DNA methylation dynamics during epigenetic reprogramming of medaka embryo [J]. Epigenetics，2019，14（6）：611-622.

[7]? Day JJ，Sweatt JD. DNA methylation and memory formation [J]. Nat Neurosci，2010，13（11）：1319-1323.

[8]? Sun Z，Xu X，He J，et al. EGR1 recruits TET1 to shape the brain methylome during development and upon neuronal activity [J]. Nat Commun，2019，10（1）：3892.

[9]? Gayon J. From Mendel to epigenetics：History of genetics [J]. C R Biol，2016，339（7/8）：225-230.

[10]? Lander ES，Baylis F，Zhang F，et al. Adopt a moratorium on heritable genome editing [J]. Nature，2019，567（7747）：165-168.

[11]? Liu X，Li YI，Pritchard JK. Trans Effects on Gene Expression Can Drive Omnigenic Inheritance [J]. Cell，2019， 177（4）：1022-1034.

[12]? Macintosh KL. Heritable Genome Editing and the Downsides of a Global Moratorium [J]. CRISPR J，2019，2（5）：272-279.

[13]? Anier K，Urb M，Kipper K，et al. Cocaine-induced epigenetic DNA modification in mouse addiction-specific and non-specific tissues [J]. Neuropharmacology，2018， 139：13-25.

[14]? Skiles WM，Kester A，Pryor JH，et al. Oxygen-induced alterations in the expression of chromatin modifying enzymes and the transcriptional regulation of imprinted genes [J]. Gene Expr Patterns，2018，28：1-11.

[15]? Ryu YS，Kang KA，Piao MJ，et al. Particulate matter-induced senescence of skin keratinocytes involves oxidative stress-dependent epigenetic modifications [J]. Exp Mol Med，2019，51（9）：1-14.

[16]? Kumar R，Jain V，Kushwah N，et al. Role of DNA Methylation in Hypobaric Hypoxia-Induced Neurodegeneration and Spatial Memory Impairment [J]. Ann Neurosci，2018， 25（4）：191-200.

[17]? Dai YJ，Wu DC，Feng B，et al. Prolonged febrile seizures induce inheritable memory deficits in rats through DNA methylation [J]. CNS Neurosci Ther，2019，25（5）：601-611.

[18]? Levenson JM，Roth TL，Lubin FD，et al. Evidence that DNA （cytosine-5） methyltransferase regulates synaptic plasticity in the hippocampus [J]. J Biol Chem，2006，281（23）：15763-15773.

[19]? Miller CA，Sweatt JD. Covalent modification of DNA regulates memory formation [J]. Neuron，2007，53（6）：857-869.

[20]? Olsson M，Hultman K，Dunoyer-Geindre S，et al. Epigenetic Regulation of Tissue-Type Plasminogen Activator in Human Brain Tissue and Brain-Derived Cells [J]. Gene Regul Syst Bio，2016，10：9-13.

[21]? Zhang RR，Cui QY，Murai K，et al. Tet1 regulates adult hippocampal neurogenesis and cognition [J]. Cell Stem Cell，2013，13（2）：237-245.

[22]? Stenzig J，Schneeberger Y，L？觟ser A，et al. Pharmacological inhibition of DNA methylation attenuates pressure overload-induced cardiac hypertrophy in rats [J]. J Mol Cell Cardiol，2018，120：53-63.

[23]? Wang L，Lee JY，Gao L，et al. A DNA aptamer for binding and inhibition of DNA methyltransferase 1 [J]. Nucleic Acids Res，2019，47（22）：11527-11537.

[24]? Grabiec AM，Potempa J. Epigenetic regulation in bacterial infections： targeting histone deacetylases [J]. Crit Rev Microbiol，2018，44（3）：336-350.

[25]? Li W，Sun Z. Mechanism of Action for HDAC Inhibitors-Insights from Omics Approaches [J]. Int J Mol Sci，2019， 20（7）：1616.

（收稿日期：2020-04-14）