全波段無光學濾波顯微鏡的研究

摘要：傳統顯微鏡在生物成像中廣泛采用熒光成像技術，該技術在基礎科學和臨床研究中具有重要意義。然而，傳統熒光檢測系統通常依賴光譜濾波器來分離熒光信號和激發光，這導致檢測速度和靈敏度下降，同時限制了可檢測的熒光范圍，增加了系統的光學復雜性。為解決這一問題，展示了兩種全波段無濾波顯微成像技術。第一種技術利用超快超連續白光源，無需光譜濾波即可激發熒光，通過時間分辨探測器在時間域中排除激發光，從而提高了檢測速度和靈敏度。第二種技術利用熒光發射的偏振性和相干性，采用線偏振照明和交叉分析器，增強了熒光和散射光之間的對比度，實現了在450～680 nm 光譜范圍內的熒光成像。這兩種全波段無濾波顯微成像技術簡化了光學配置，為生物成像領域的應用提供了高效、靈敏的解決方案。

關鍵詞：熒光成像；光學濾波；全波段熒光

中圖分類號：TH 742 文獻標志碼：A

引 言

傳統顯微鏡在生物成像中廣泛地使用熒光顯微成像技術，如細胞表型檢測、組織切片檢測[1]，其中，多波段熒光三維成像通常需要與共焦、多光子或光學切片顯微鏡等方法結合使用[2]，以獲取更全面的細胞或組織信息。由于激發熒光素的激發光光強往往比熒光素的發射熒光光強大幾個數量級，所以需要將充當背景噪聲的激發熒光與所需信號的發射熒光分離之后，才可得到理想的熒光圖像。傳統方法通過組裝熒光濾波通道來實現兩者的分離，熒光濾波通道通常由一個激發濾光片、一個發射濾光片以及一個相應波段的二向色鏡組成，激發濾光片用以篩除生物樣品散射的激發光，發射濾光片允許樣品的發射熒光抵達到探測器。

然而，每種特定的染料只在相對狹窄的光譜范圍內被激發，單一的激發波長只能激發有限數量的熒光物質，故傳統顯微鏡無法實現在單個圖像中獲得樣品的全部激發/發射光譜。同時，若熒光物質的斯托克斯位移沒有足夠大時，激發帶和發射帶存在重疊區域，即使使用帶寬極小的濾波器篩選掉全部的散射激發光，也會不可避免地損失一些發射熒光信號。傳統的熒光檢測系統的問題不僅會降低檢測的速度和靈敏度，還會限制可檢測熒光標記的選擇。此外，對于使用多個激發和發射光譜的多色標記染色生物樣品，通常需要多波段同時熒光成像。同時檢測多色生物標記能夠監測復雜生物系統中的不同生理過程和生物細胞功能。為滿足多色熒光檢測的需求，傳統的系統已經擴展到具有多個激發?發射光譜的熒光濾波通道的熒光濾波輪盤，通過切換輪盤中的濾波通道實現多色熒光檢測。但是，這種輪盤中的光學配置較為復雜，為更新與改進帶來了困難，并且機械切換輪盤耗時較長，不利于同時成像。

因此，本文展示了兩種全波段無濾波顯微鏡。其一，使用由非線性光子晶體光纖與飛秒激光相結合生成的單一超連續光源充當激發光光源同時激發各色熒光團，這種超連續白光為一種寬譜光。然后，條紋相機根據激發光與發射光在時間域上的差異，濾除散射激發光。其二，由于熒光發射通常表現出較大的偏振各向異性，而散射的激發光則保留偏振狀態，故使用線偏振照明和光束遮擋器，提高熒光和散射光之間的對比度。本文展示的兩種方案無需多個帶通濾波器和二向色鏡，從而簡化了光學配置。

1 基于條紋相機裝置模型分析

1.1 基于條紋相機超窄時間窗的無濾波顯微鏡

圖1 展示了利用超快脈沖激光器（Coherent，Mira 900）產生的超連續白光作為激發光源，在800 nm 波長和76 MHz 的重復頻率下，將70 mW的50 fs 脈沖耦合到一根長度為1 m 的非線性光子晶體光纖，光纖零色散波長為750 nm。非線性相互作用包括自相位調制、自陡峭化、受激拉曼散射和四波混頻[3-5]，其中自相位調制導致頻率擴展，形成光譜的寬帶；自陡峭化是指高強度光在介質中傳播時傳播速度更快，光波包的前沿會更陡峭；受激拉曼散射會使光譜紅移，進一步增加了光的頻率范圍；四波混頻即不同頻率的光波在非線性介質中相互作用，產生新的頻率成分，導致了頻率的組合和擴展，形成更寬的頻譜。這些非線性效應相互作用，共同導致了光譜的寬帶，產生一個寬的亞皮秒連續體，延伸到460 nm。如圖2 所示，雖然光譜圖顯示出一些結構上的變化：在400～500 nm 范圍內，光譜強度較低，并且呈現出一種散亂的模式，但整體上光譜是連續的；在500～600 nm 范圍內，光譜強度開始增加，并在600～700 nm 之間達到一個峰值；在700～800 nm 范圍內，光譜強度減小，并在800～900 nm 之間再次達到一個較高的峰值。因此，該光源可以激發任何在460 nm 到近紅外波段吸收的熒光物質。在460 ～780 nm 之間的平均光譜密度為130 μW/nm，能夠實現熒光的高效激發。超連續光源的高重復率能夠實現同步檢測來探測微弱信號，并監測快速變化的熒光信號，例如流式細胞儀中的信號。

將超連續白光聚焦到一個樣品比色皿中，其中包含不同染料的混合物，如圖1 所示。使用一個無色差透鏡收集樣品出射光，另一個無色差透鏡將信號聚焦至分光儀中。其中樣品出射光包含激發雜散光與熒光，而后經由分光儀輸出包含熒光和激發雜散光的兩個重疊光譜。由于激發雜散光和熒光在光譜上是重疊的，因此有必要使用時間分辨探測器在時域中分離這兩個信號。該研究中使用的全光譜的超連續白光與已有的研究[6-8]有明顯不同，以前的研究中往往采用窄帶通濾波器從超連續譜中選擇特定波長范圍進行熒光激發。熒光檢測采用了與傳統方法相同的方法，使用發射濾波器來濾除激發雜散光，只允許熒光信號通過。相比之下，該方法在不進行光譜濾波的情況下使用全波段超連續白光，可實現單次激發寬波長范圍內的多種染料。

對于采用的時間分辨探測器有以下關鍵要求：第一，具有足夠的時間分辨率，在時間域上分辨散射的激發光和熒光。該方案無需考慮激發光的波段，只需考慮熒光和激發光的壽命，從而使散射的激發光不被探測器探測到。第二，探測器需具有非常高的對比度，確保即使在散射的激發光可能很強的情況下（例如在組織或細胞培養中），也能探測到較弱的熒光信號。第三，使用陣列探測器，在光譜上區分不同的熒光物質。

本文使用條紋相機（Hamamatsu，M1955），該相機在同步掃描模式下運行，相機內的電子束與76 MHz 的激發脈沖序列同步掃描探測器屏幕。由于條紋跡線與激光脈沖同步，通過調整條紋相機掃描電壓相對于激發光的延遲（相位），可以使散射的激發光脫離檢測時間窗口，而熒光位于時間窗口內，從而將散射的激發光濾除。在這種模式下運行的頻帶相機提供了極高的散射激發光抑制率，遠高于實際檢測動態范圍，同時保持了極高的熒光檢測靈敏度。

1.2 實驗結果與分析

超連續譜具有典型的光纖源高空間相干性，同時保留激發各種熒光團所需的寬帶。此外，超連續譜在時域上具有超短脈沖的優點，故能夠在時間上實現將激發光與熒光分離，從而不再需要激發濾波器，并實現全光譜的同時激發。為驗證超快脈沖激光器生成的超連續光源強度能夠充分激發熒光，將超連續光譜聚焦到一個玻璃皿中，玻璃皿中含有兩種染料，分別是6?羧基四甲基羅丹明（ 6-TAMRA） 和Deep Red。6-TAMRA是一種廣泛用于自動DNA 測序和毛細管電泳的熒光團。其吸收峰在547 nm 左右，發射峰在573 nm 左右[9]。Deep Red 是一種線粒體染色染料，其最大吸收峰為640 nm，發射峰約為662 nm[10]。二者的時間分辨熒光光譜如圖3 所示，盡管它們的吸收光譜明顯分開，但兩種染料均被超連續光源高效激發。熒光可以通過上文所提及的條紋相機收集并在時間域上進行濾波。由于條紋相機的條紋跡線的時間延遲被調整以屏蔽掉散射的激發光，檢測到的信號僅由兩種染料的熒光組成。時間積分信號如圖4（a）所示，熒光衰減曲線如圖4（b）所示，該應用易于擴充至多種染料。

條紋相機的輸出圖像如圖4 所示，6-TAMRA和Deep Red 兩種染料完整的未經濾波的圖像如圖4（a）所示，兩者的熒光衰減曲線如圖4（b）所示。圖4（a）表明測量出的兩種染料的熒光光譜圖與預期相符合，且兩者的中心波長分離較大，故兩者的熒光衰減曲線可被分離并在其中心波長處使用單一指數擬合。由圖4（ b）可知，Deep Red 的熒光壽命約為0.6 ns，而6-TAMRA的熒光壽命為2.4 ns，二者與其他文獻所測量的數據大致相符[11]。盡管兩種染料的光譜重疊很小，但衰減壽命的差異可以使不同的染料分子在光譜重疊的情況下被區分。結果表明，基于條紋相機超窄時間窗的無濾波顯微鏡可實現對超連續譜激發的多種染料熒光發射的時間分辨測量，并同時提供光譜和壽命數據。但是，該顯微鏡僅能實現熒光信號的檢測，無法實現熒光圖像的生成，與成像系統并不兼容，且光譜區分單獨染料的能力不足。

2 基于光擋阻隔裝置模型分析

2.1 基于光擋阻隔激發光的無濾波熒光顯微鏡

本文展示了一種利用熒光發射的偏振性和相干性開發的顯微鏡，采用450～680 nm波長光源獲取熒光圖像，并同時檢測相同范圍內完整發射光譜，再使用偏振濾波器來區分熒光和背向反射光。熒光發射通常表現出較大程度的偏振各向異性，而反射光保留了照明的偏振狀態[12]。通過使用線偏振照明和交叉分析器，可以提高熒光和散射光之間的對比度，因為分析器削減了相當比例的反射照明。例如，來自顯微鏡載玻片或透鏡表面的鏡面反射具有線偏振特性，大部分被濾除。雖然來自小特征的散射表現出一定的去極化[13]，但大部分背向散射光被移除，兩者之間存在一定的關系，但這種關系牽涉到較多方面，并不存在直觀的比例關系，顯微成像對比度取決于多個因素：樣品的結構特性、偏振濾波器的光學性質、熒光分子的性質、成像系統結構。

照明和熒光的相干性質差異為進一步分離提供了可能性。采用空間相干光源照亮物鏡瞳孔中的一點提供均勻寬視場照明，從平面（如顯微鏡載玻片）反射回來的照明光將沿著物鏡的互逆路徑穿過物鏡，形成瞳孔中的一個點，該點可通過一個小的光束阻擋器來屏蔽。熒光發射主要是非相干和各向同性的。其中只有一小部分會被光束阻擋器屏蔽。因此，這種空間相干性過濾增加了熒光與照明光之間的對比度。該原理已被用于高速狹縫掃描顯微鏡中產生線性照明，但該方案需與激光照明和發射濾光結合使用[14]。

基于光擋阻隔激發光的無濾波熒光顯微鏡結構如圖5 所示，采用Fianium SC450?2 WLS 源提供顯微鏡的寬譜照明（450～2 000 nm），輸出光通過濾光片，濾除所有波長超過680 nm 的光。然后，光束被擴展并通過Glan Taylor 偏振器，由50 mm 焦距的透鏡聚焦。聚焦后的光束被傾斜放置于靠近物鏡后方，孔徑直徑為3 mm 的反射透鏡（ Zeiss PlanNeoFluar，40×，1.3 NA，油浸）反射。該傾斜鏡放置的位置是特定的，以確保照明光束在物鏡的瞳孔平面形成一個聚焦斑點，從而實現樣本寬視場照明。樣本發出的光線由相同的物鏡透鏡收集，通過瞳孔平面的部分光線被光束阻擋器阻擋，其余部分入射至400 mm管狀透鏡并成像到CCD 相機上，也可以通過將光纖替換CCD相機的方式將其連接到OceanOptics USB2000分光計進行樣本的光譜測量。

理想情況下，反射鏡和光束阻擋器應置于物鏡的瞳孔平面。然而，由于大多數物鏡的瞳孔平面位于鏡頭筒內，因此，反光鏡和光束阻擋器應盡量靠近鏡頭的后孔徑。圖6 中標出了兩種可能的反射鏡位置。如圖6（a）所示，反射鏡被置于光軸上，同時充當光束阻擋器（假定鏡子的支撐物不會遮擋瞳孔）。如圖6（b）所示，鏡子被置于瞳孔邊緣，光束阻擋器（直徑3 mm 的塑料圓盤）被置于相對的位置。如圖6（a）所示，配置可使透鏡組件的反向反射減少，這是由于光路入射至透鏡表面角度較大處。照明光和樣品反射由橙色實線表示，透鏡的雜散反射由綠色虛線表示。在圖6（a）中，照明被聚焦至光軸上的一點；在圖6（b）中，照明被聚焦在物鏡瞳孔的邊緣。本研究比較了照明點位于光軸上與照明點位于透鏡外圍的光路示意圖：當照明點位于透鏡外圍時，透鏡表面傾斜導致反射光在高角度偏轉，遠離瞳孔，因此反射光被透鏡外殼阻擋；當光照進入光軸上的透鏡時，反射光穿過瞳孔返回，有助于增強檢測強度。由于遮擋散射光的效果取決于樣品的表面性質和內部結構以及光路上遮擋的尺寸，圖6（a）僅采用單個反射鏡可同時起到將光引入路徑以及充當光擋的作用。圖6（b）使用反射透鏡引入光照，使用光束阻擋器對散射光進行遮擋，可采用的遮擋部分的尺寸更大。故兩種遮擋方式的散射光誤差并不相同。

2.2 實驗結果與分析

為驗證光擋阻隔激發光的無濾波熒光顯微鏡可以與任何探測器或光譜儀通道結合使用，而不受二向色鏡所允許的波段的限制，采用發射濾光片（無激發濾光）驗證圖像的全光譜性質，該方案具有普適性及多功能性。圖7（a）展示了由全光譜偏振濾波熒光顯微鏡采集的牛肺動脈內皮細胞的光強圖像，該樣本由兩種不同波段的染料進行熒光標記，分別為BODIPY FL Phallacidin[15]（其吸收峰值505 nm，發射峰值512 nm）和MitoTrackerRed CMXRos[16]（其吸收峰值579 nm，發射峰值599 nm）。為了驗證該光強圖像是否由兩種染料的發射熒光組成，將兩張對應波長的窄通帶發射濾光片分別放置于檢測光路中，將波段為512 nm 綠色通道與波段為599 nm紅色通道記錄的圖像合并。由圖7（b）可知，合并的熒光圖像與全光譜光強圖像對應良好，清晰地表明全光譜光強圖像中絕大多數是發射熒光，極少部分為散射激發光。

3 結 論

本文展示了兩種全波段無光學濾波熒光顯微鏡，分別是基于條紋相機超窄時間窗的無濾波顯微鏡及基于光擋阻隔激發光的無濾波顯微鏡。針對基于條紋相機超窄時間窗無濾波顯微鏡，采用超快超連續激發光源，結合激光脈沖時間域濾波技術，實現了無光譜過濾的可見光到近紅外全光譜覆蓋。該檢測機制可以顯著改善諸如微孔板閱讀器、內窺鏡和流式細胞儀等多色熒光儀器的性能。然而，這一檢測技術與成像系統并不兼容，無法獲取對應的熒光圖像。針對基于光擋阻隔激發光的無濾波熒光顯微鏡，通過結合相干照明和瞳孔平面空間濾波，能夠實現無光譜濾波器的全光譜熒光顯微成像。采用偏振濾波減弱了熒光強度，但增強了熒光與散射光的對比度。實驗結果表明，本研究展示的顯微鏡在無需濾光器的情況下，仍可實現全波段熒光成像，其適用于成像強熒光信號的低散射樣本，該方案的光學系統配置簡易，能夠與現有顯微鏡系統相結合使用。但由于散射過程中的去極化效應，無法完全濾除散射光，在弱熒光成像實驗中，聚焦平面若有相對較強的散射光，則無法實現熒光圖像的獲取。因此，后續可以結合一些光譜分離算法，將得到的圖像進行光譜分離，進一步提高圖像對比度，以應用于更廣泛的領域。