PELP1在上皮性卵巢癌血管生成中的作用研究

Studyon theRoleofPELP1in AngiogenesisofEpithelial Ovarian Cancer

XIELelel，WUJiangling2，ZHANGWenwen3，HUANGXiyue]，YANGXiao1，WANGJia1 （DepartmentofObstetricsndGyecology，DepartmentofClincalLaboratory，DepartmentofPathology，theUnversityTown Hospital of ChongqingMedical University，Chongqing ，China）

Astract：Ueeesteeoleprouotegeso MethodsNoalovarianepithelialellISE8OndepithelialovarancancercellsOVCAR-3ndHeyereselectedHeyCtrlgroupassetas blankcontroloioldeaie PELP1wasdetedyeal-teuoresceceuanitativePCR（RTCR）ndWestBlot（WB）TerelativeexpressnevelofPwas detectedbyWB.TheconcentrationofVEGFAinthesupernatant（CM）ofOE-Vector-CMgroupandOE-PELP1-CMgroupwasdeterminedby enzyme-linkedimmunosorbents（ELA）efectsofCMontemigraioandubefoationofuanbilcalveinedothelialels （HUVECs）weredetectedbyTranswellandangiogeesisethodsResultseexpresionlevelofELPinepithelialovariancanceels OVCAR-3 and Heywas higher than that in normal ovarian epithelial cells IOSE80（ Plt;0 . 0 5 ） .The expressionlevel of PELP1 in Hey-OE-PELP1 group was higher than that in Hey-Ctrl group and Hey-OE-Vector group .The concentration of VEGFA，the numberof migrated cellsand the number of tube nodes in OE-PELP1-CM group were higher than those in OE-Vector-CM group（ .Conclusion PELP1 promotes angiogenesis in epithelial ovarian cancer.

Keywords：Epithelial ovarian cancer；PELP1；Angiogenesis

上皮性卵巢癌是卵巢癌發病率最高的病理類型，其生長、侵襲及遷移等高度依賴于血管形成]。當上皮性腫瘤發生時，腫瘤細胞會分泌如血管內皮生長因子（VEGFA）、血小板衍生生長因子（PDGF）等2多種促血管生成因子。這些因子能夠促進血管新生，不僅為腫瘤細胞提供了氧氣及營養供應，還為其發生與遠處轉移創造了條件。脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸富集蛋白1（PELP1）是雌激素受體共激活因子，在上皮性卵巢癌等多種腫瘤中表達失調，被證實在血管生成中發揮重要作用，但對于上皮性卵巢癌而言其在血管生成方面的調控作用尚待研究。研究表明，血管生成越活躍，腫瘤惡性程度往往越高，患者生存率越低。本研究將進一步探索PELP1在上皮性卵巢癌血管生成方面的調控作用，尋找新的治療靶點，以提高卵巢癌患者的治療效果和生存率。

1材料與方法

1.1細胞與試劑本實驗所采用的正常卵巢上皮細胞IOSE80、上皮性卵巢癌細胞OVCAR-3、Hey均購自武漢普諾賽生命科技有限公司。人臍靜脈內皮細胞由貴州醫科大學贈送。RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒及快速封閉液、轉膜液來源于上海碧云天生物技術有限公司。PELP一抗來源于美國Abcam公司，內參一抗GAPDH、山羊抗兔二抗來源于美國博士德公司。TRIzol、反轉錄PCR試劑盒來源于日本Takara公司，引物來源于上海生工生物工程有限公司。過表達PELP1慢病毒及陰性對照來源于上海吉凱公司?；|膠來源于美國康寧公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養選取正常卵巢上皮細胞IOSE80，以及上皮性卵巢癌細胞OVCAR-3、Hey。使用含1 0 . 0 0 % 血清的RPMI1640培養基培養OVCAR-3、Hey細胞，使用含 1 0 . 0 0 % 血清的DMEM培養基培養IOSE80細胞，當細胞密度融合至 9 5 . 0 0 % 后，使用0 . 2 5 % 胰酶消化液進行消化傳代。

1.2.2慢病毒轉染設置Hey-Ctrl組為空白對照，Hey-OE-Vector組為陰性對照，Hey-OE-PELP1組為過表達組。將Hey細胞接種于6孔板中，當細胞密度融合至 3 0 . 0 0 % ，將原有培養基更換為無血清培養基，并加入慢病毒（OE-PELP1）陰性對照慢病毒（OE-Vector）及促轉染試劑。待細胞培養 2 4 h 后，更換為完全培養基繼續培養 4 8 h 后在熒光顯微鏡下觀察轉染效率。使用完全培養基將嘌呤霉素（ 稀釋至濃度為 ；將細胞原有培養基更換為上述培養基，培養 后完成穩轉株篩選，繼續進行傳代、凍存。

1.2.3實時熒光定量PCR（RT-qRCR）選取正常卵巢上皮細胞IOSE80，上皮性卵巢癌細胞OVCAR-3、Hey進行實驗。當細胞密度融合至 9 0 % 左右，使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，并測定RNA濃度。使用反轉錄試劑盒反轉錄RNA合成cDNA，使用SYBERGreenRT-qPCR檢測盒檢測mRNA的相對表達量。使用PCR擴增儀器按預變性 $9 5 ＼mathrm { ～ ＼textcircled { ＼cdot } ～ } 3 0 ＼mathrm { ～ s ～ }$ ，變性 ，退火延伸 ，擴增40個循環的條件進行反應。

1.2.4WesternBlot（WB）RIPA裂解液用于裂解細胞，BCA蛋白濃度測定試劑盒用于測定蛋白濃度。取相應體積LoadingBuff緩沖液于蛋白懸液中， 煮沸 5 m i n 。定上樣量為 3 0 μ g ，取相應體積蛋白樣品進行電泳。電泳結束后，進行轉膜，將蛋白條帶轉移至PVDF膜上。隨后使用快速封閉液在常溫下封閉PVDF膜 3 0 m i n 。使用一抗孵育PVDF膜 后，TBST洗膜6次，每次 5 m i n 。再使用二抗在常溫下孵育 后，TBST洗膜6次，每次 5 m i n 。使用顯影儀進行顯影和采圖。

1.2.5酶聯免疫吸附實驗（ELISA）取標本稀釋液0 . 8 m l 于標準品中，充分溶解后渦旋振蕩混勻（濃度為 ）。稀釋濃度為1000、500、250、125、6 2 . 5 、 3 1 . 2 5 、 1 5 . 6 、 0 （空白孔） ；空白孔加 1 0 0 μ l 稀釋液，其余孔中加入 1 0 0 μ l 上述濃度稀釋液， 避光孵育 9 0 m i n ；清洗5次；空白孔加 1 0 0 μ l 抗體稀釋液，其余孔各加入 1 0 0 μ l 抗體工作液， 避光孵育 ；清洗5次；空白孔加 1 0 0 μ l 酶結合物稀釋液，其余孔各加入 1 0 0 μ l 酶結合物工作液， 避光孵育 3 0 m i n ；清洗5次；各孔加入 1 0 0 μ l 顯色底物， 避光孵育 1 5 m i n ；各孔加入 1 0 0 μ l 反應終止液，混勻后測量 值，制備標準曲線，按上述步驟測定OE-Vector-CM組、OE-PELP1-CM組上清液（CM）中VEGFA濃度。

1.2.6Transwell共培養實驗將HUVECs細胞加入無血清DMEM培養基中，等量加入小室上室，下室中分別加入Hey-OE-Vector組、Hey-OE-PELP1組細胞上清液。在 的敷箱中培養 2 4 h ；棄去培養基，向每孔中加入 6 0 0 μ μ % 多聚甲醛后放置 1 5 m i n ，使用PBS洗3次，每次 5 m i n ；再使用0 . 1 0 % 結晶紫染色 1 0 m i n ；用棉簽去除到達Tran-swell小室下表面的細胞；PBS清洗小室3次，于室溫放至風干；在熒光顯微鏡下觀察3個視野中的細胞并采圖。

1.2.7成管實驗將24孔板置于冰上，取基質膠 8 0 μ l 預涂到24孔板上，均勻涂抹24孔板后在 放置 待其凝固；消化HUVECs細胞，將細胞分為2等份后加入 1 5 m l 離心管離心；棄細胞上清液，于每個離心管中加入相應組的細胞上清液進行重懸，于24孔板各個孔中加入 1 m l 細胞懸液；在 的敷箱中孵育 ；在熒光顯微鏡下觀察3個視野中的細胞并采圖。

1.3觀察指標比較正常卵巢上皮細胞IOSE80、上 皮性卵巢癌細胞OVCAR-3、Hey中PELP1表達水 平；Hey-Ctrl 組、Hey-OE-Vector組及Hey-OE

PELP1組中PELP1表達水平；OE-Vector-CM組及OE-PELP1-CM組細胞上清液中VEGFA濃度；OE-Vector-CM組及OE-PELP1-CM組細胞上清液共培養下臍靜脈內皮細胞遷移細胞數量及成管節點數量。

1.4統計學方法采用GraphPadPrism9.0軟件進行數據分析。在比較數據時，采用獨立樣本 t 檢驗及采用單因素方差分析。以 Plt;0 . 0 5 為差異有統計學意義。

2結果

2.1PELP1相對表達水平RT-qPCR結果顯示，上皮性卵巢癌細胞OVCAR-3、Hey中PELP1表達水平分別為（ 、 ，均高于正常卵巢上皮細胞IOSE80細胞的 ；WB結果顯示，OVCAR-3、Hey細胞中PELP1表達水平分別為中 （ 0 . 9 7 ± 0 . 0 0 ） 、 ，均高于IOSE80細胞的（ 0 . 3 6±0 . 0 0 ） ，差異有統計學意義（ P lt; 0 . 0 5 ） ，見圖1。2.2PELP1過表達水平 WB 結果顯示，Hey-OE-PELP1組PELP1表達水平為（ ，高于Hey-Ctrl組的 及Hey-OE-Vector組的0 ），差異有統計學意義（ Plt;0 . 0 5 ） ，見圖2。2.3OE-Vetor-CM組、OE-PELP1-CM組細胞上清液中VEGFA濃度ELISA結果顯示，OE-PELP1-CM組中VEGFA濃度為（ （ 4 3 5 . 4 6±6 6 6 . 8 3 ） p g / m l ，高于OE-Vector-CM組的 （ 5 1 4 . 0 0±7 7 7 . 8 2 ） p g / m l ，，差異有統計學意義（ Plt;0 . 0 5 ） ，見圖3，證明過表達PELP1促進VEGFA的分泌。

2.4HUVECs細胞在條件培養基共培養下遷移情況共培養結果顯示，OE-PELP1-CM組遷移細胞的數量為（ 個，高于OE-Vector-CM組遷移細胞的 個，差異有統計學意義（ （ P lt; 0 . 0 5 ） ，見圖4。

注： （204

2.5HUVECs細胞在條件培養基共培養下成管情況 成管實驗結果顯示，OE-PELP1-CM組成管節點數 量為（ （ 1 7 8 . 0 0 ± 1 2 7 . 0 0 ） 個，高于OE-Vector-CM組的 （ 個，差異有統計學意義（ . Plt;0 . 0 5 ） 1， 見圖5。

注： 。

注： 。

3討論

上皮性卵巢癌是惡性程度最高的婦科惡性腫瘤，在其發生過程中，多種生物學過程，如增殖轉移、上皮間質轉化、免疫浸潤、鉑類耐藥等均與血管生成密切相關[8-10。腫瘤細胞會分泌多種促血管生成因子，這些因子能夠刺激周圍組織中血管內皮細胞增殖遷移，并最終形成新血管網絡I]。新生血管為上皮性腫瘤提供充足的氧氣和營養物質，使腫瘤快速增殖和轉移。PELP1定位于腫瘤細胞的細胞核[12]，參與細胞增殖、遷移、侵襲、細胞骨架和表觀遺傳重塑等過程[13，14]。同時有研究表明[15]，PELP1在調控血管生成方面具有潛力。上皮性卵巢癌發生發展基于癌細胞快速增殖伴隨血管生成，因此研究上皮性卵巢癌中血管生成機制對于理解該疾病發生發展具有重要意義。

既往研究證實4，在上皮性卵巢癌組織中PELP1表達上調。本研究結果進一步顯示，上皮性卵巢癌細胞中PELP1表達高于正常卵巢上皮細胞，證實其與上皮性卵巢癌發生發展相關。分析認為癌變的生物學基礎是原癌基因激活及抑癌基因失活，原癌基因的作用通常是促進細胞的生長和增殖，抑制凋亡[7]。PELP1作為一種原癌基因[18]，在上皮性卵巢癌中異常激活，表明PELP1與細胞增殖凋亡等密切相關。同時本研究證實過表達PELP1后，PELP1過表達組細胞VEGFA分泌增加，過表達PELP1組條件培養基培養人臍靜脈內皮細胞后其遷移的細胞數量與成管節點數量增加，提示高水平PELP1通過促進VEGFA分泌促進血管內皮細胞遷移及血管生成。分析認為腫瘤細胞過度增殖需要激活血管生成以此保證充足的氧氣及營養供應[19]，PELP1可以促進腫瘤細胞增殖，必然伴隨著血管生成，VEGFA被證實是最強的促血管生成因子[0，高水平PELP1促進VEGFA分泌，高水平VEGFA進一步內皮細胞的遷移及血管生成，證實PELP1在血管生成中具有潛力?；诖?，本研究驗證了PELP1在調控上皮性卵巢癌血管生成方面發揮重要作用。由此可見，PELP1可以作為抑制上皮性卵巢癌發生發展的生物分子靶點。

綜上所述，在上皮性卵巢癌中PELP1表達上調，過表達PELP1后促進腫瘤細胞分泌VEGFA以此促進血管生成?；诖?，可以通過靶向抑制PELP1從而抑制其對血管生成的調控，為上皮性卵巢癌靶向治療提供新思路及理論基礎。

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收稿日期：2025-02-10；修回日期：2025-02-26

編輯/肖婷婷