壬基酚和17β-雌二醇對尾草履蟲種群生長的影響

中圖分類號：S917.1 文獻標志碼：A 文章編號：1674-3075（2025）03-0032-09

環境雌激素（environmental estrogen，Ees）是指一類進入機體后，通過干擾體內正常內分泌物質的合成、釋放、運輸等過程，從而激活或抑制內分泌系統的功能，破壞維持機體穩定性和調控作用的化合物（卓麗等，2020），包括人工合成化合物及植物天然雌激素等。壬基酚（Nonylphenol，NP）和 17β -雌二醇（Estradiol）都屬于典型的環境雌激素（李建平，2018），17β-雌二醇是一種天然雌激素，壬基酚屬于人工合成的環境雌激素。壬基酚和 17β -雌二醇（17β-estradiol，E2）的分子結構相似，可以模擬雌激素作用進而影響生物體的內分泌系統（張良茂，2018）。壬基酚是壬基酚聚氧乙烯醚的主要降解產物，常溫下為無色或淡黃色液體，在環境介質中難以降解，屬有機污染物（楊彥等，2023）；雌二醇有 a，β 兩種類型，17β -雌二醇具有較高的生物活性，普遍存在于各類環境中，特別在水環境中，具有污染范圍廣、危害程度大等特點（李玲玲等，2023）。

壬基酚和 17β -雌二醇及其代謝產物進入水環境，通過食物鏈及生物富集，損傷生物體的生殖系統和免疫系統，對人類身體健康也會造成巨大傷害（Melebaryetal，2022）。目前，國內外關于壬基酚和17β -雌二醇的研究多聚焦于雌激素對水產動物生殖毒性的效應上（戚珍珠等，2016；鄭任馳等，2022）。壬基酚可作用于羅非魚（Oreochromismossambicus）的生長激素、胰島素樣生長因子（Celino-Bradyet al，2019）；高于 322μg/L 的壬基酚對斑馬魚（Daniore-rio）胚胎的孵化率、存活率和畸形率均有顯著的影響（劉芳等，2022）；壬基酚會影響斑馬魚的神經系統，長期暴露于壬基酚下斑馬魚的乙酰膽堿酯酶活性受到顯著抑制（Aliakbarzadehetal，2023）。17β-雌二醇可影響櫛孔扇貝（Chlamysfarreri）（劉穎，2014）、長牡蠣（Crassostreagigas）（劉茜，2022）性腺發育相關基因的表達。評估壬基酚和 17β. -雌二醇的毒性效應成為研究熱點，但環境雌激素對單細胞真核生物的毒理學效應的研究報道較少。

尾草履蟲（Parameciumcaudatum）屬原生動物門纖毛綱（Ciliata）膜口目（Hymenostomatida）草履蟲屬（Paramecium），分布范圍廣，在實驗室條件下易于培養，目前是水生態毒理學常用的模式生物（Kviteketal，2009；Turemis，2018）。尾草履蟲的存活率與 Hg²⁺ 濃度呈負相關關系，Herman等（2021）以尾草履蟲為指示生物，測試了一種新型復合氣凝膠在微宇宙水生條件下吸附 Hg²⁺ 的能力；張辰笈等（2018）以尾草履蟲為指示生物發現四環素類抗生素對低等水生生物存在急慢性毒性效應。目前環境雌激素對尾草履蟲毒性效應的研究尚未見報道。

本研究以尾草履蟲為對象，以天然雌激素17β-雌二醇和人工合成雌激素壬基酚為試驗藥物，采用靜水試驗法（周永欣和章宗涉，1989）探究兩種環境雌激素對尾草履蟲的毒性效應和種群動力學的影響，為今后環境雌激素生態風險性評價提供參考依據。

1材料與方法

1.1試劑與受試生物的培養

研究所用17β-雌二醇和壬基酚分別為分析純和優級純。根據高永剛等人（2006）的方法，分別配置壬基酚和 17β. -雌二醇的母液，配置完成后將母液置于4% 條件下保存，根據試驗所需稀釋母液至使用濃度。

試驗所用的尾草履蟲采自農學院附近自然水體，經染色鑒定為尾草履蟲。將尾草履蟲接入配置好的酵母培養液，室溫條件下，純化3次后鏡檢篩選，在錐形瓶中進行擴種培養，當種群密度達到 4×10⁴ 個/L時開始試驗。

1.2試驗方法

1.2.1測定 LC₅₀ 的急性毒性試驗所有測定均在六孔培養板中進行，根據預試驗結果，壬基酚的濃度分別設為 0.0.030 0.0.050 0.0.070 0.090 0. 00.110 0.0.130 0mg/L：17β -雌二醇的濃度分別設為2.4000，2.6000，2.8000，3.0000，3.2000，3.4000mg/L 每組3個平行，在解剖鏡下每隔 12h 測定死亡率，通過概率單位法（黃惠東，1988）計算確定LC50°

1.2.2確定種群增長動態的慢性毒性試驗 在六孔培養板中研究尾草履蟲的種群生長動態，壬基酚的濃度設為 ：0，0.0077，0.0096，0.0130，0.0190，0.0380mg/L 17β. -雌二醇的濃度設為： 0.0.290 0.0.360 0.0.480 0. 0.730 0.1.450 0mg/L ，每組3個平行，間隔 24h 取0.1ml 樣品，用Lugol's液固定后使用解剖鏡測定尾草履蟲的種群密度（Chapmanetal，2019；Xuetal，2023），每孔重復計數兩次，兩次計數誤差不超過15% 。利用種群密度、種群生長率 r 及世代時間 G 分析尾草履蟲在不同藥物濃度下的種群動態（Wilkenetal，2010），原生動物纖毛蟲種群生長率 r （張紹麗等，2001）計算公式為：

式中： N_t 為時間 t 時的種群密度； N₀ 為初始種群密度； t 為試驗時間。

纖毛蟲通過二分裂的方式進行種群生長（Tayloretal，1976），因此世代時間與種群生長率 （r） 之間的關系為：

式中： r 為原生動物纖毛蟲的種群生長率。

1.3數據分析

使用SPSS26.0對尾草履蟲的最大種群密度、生長率及世代時間進行單因素方差分析（One-wayANOVA），確定尾草履蟲在不同藥物濃度下的種群生長率及世代時間與對照組的差異性， Plt;0.05 認為存在顯著性差異（記為*）， Plt;0.01 認為存在極顯著差異（記為**），數據結果表示為平均值 ±SE 。使用Ex-cel和Origin2021軟件繪圖。

2結果與分析

2.1 壬基酚和 17β^- 雌二醇對尾草履蟲的 LC₅₀

根據概率單位法，壬基酚和 17β. -雌二醇對尾草履蟲的急性毒性試驗結果如表1所示，壬基酚對尾草履蟲的 LC₅₀ 小于 17β -雌二醇對尾草履蟲的 LC₅₀ 。由此可得，尾草履蟲對壬基酚的敏感性大于對 17β 雌二醇的敏感性。

2.2壬基酚和 17β- 雌二醇對尾草履蟲種群生長曲線和最大種群密度的影響

壬基酚對尾草履蟲種群生長影響如圖1所示，對照組中，尾草履蟲的種群生長無明顯的停滯期，指數生長期經過 96h ，尾草履蟲達到種群最大密度，隨后進入衰退期， 0.0077mg/L 組在 120h 種群密度達到最大值。與對照組相比， 0.0190mg/L 組尾草履蟲的停滯期持續了 24h ，隨后進入指數生長期，在 120h 時種群密度達到最大值。單因素方差分析結果表明（圖2），各濃度組 （0.0077～0.0380）mg/L 的最大種群密度與對照組相比均存在極顯著差異 （Plt;0.01） ，壬基酚對尾草履蟲的種群生長起到了明顯的抑制作用，隨著壬基酚濃度的升高對尾草履蟲種群生長的抑制作用越明顯，其中 0.03800mg/L 組的抑制作用最明顯，與對照組相比，最大種群密度降低了 63.21% 0

17β -雌二醇對尾草履蟲種群生長影響如圖3所示，與對照組相比， 0.290 0mg/L?0.360 0mg/L 和0.4800mg/L 組的尾草履蟲指數生長期持續 120h 隨后達到最大種群密度，各組無明顯停滯期。 0.7300mg/L 、1.4500mg/L 組 144h 達到種群最大密度，最大種群密度分別為 ;（1.02±0.0070）×10⁵（1.02±0.0030）×10⁵ind./L ，隨后進入衰退期。隨著17β-雌二醇濃度的升高，各處理組尾草履蟲的最大種群密度呈下降趨勢。單因素方差分析結果表明（圖4），各濃度組的種群最大密度與對照組相比均存在極顯著差異 （Plt;0.01） ，結果表明 17β. -雌二醇對尾草履蟲的種群生長起到了明顯的抑制作用。

2.3壬基酚和 17β- 雌二醇對尾草履蟲種群生長率和世代時間的影響

如圖5（b）所示，尾草履蟲的種群生長率隨著壬基酚濃度的升高呈下降趨勢。單因素方差分析檢驗結果表明，處理組的種群生長率與對照組相比均存在極顯著差異 （Plt;0.01） ，其中抑制作用最明顯的是 0.0380mg/L 組，種群生長率為 （0.12±0.036 0）/d ，比對照組降低了 65.59% 。如圖5（a）所示，不同處理組中尾草履蟲的世代時間隨壬基酚濃度的升高呈上升趨勢， 0.0380mg/L 處理組的世代時間延長最為明顯，世代時間為 （5.84±0.025 0）d ，比對照組延長了187.68% 。單因素方差分析結果表明， 0.0130mg/L 和0.0190mg/L 組的世代時間差異不顯著 （Pgt;0.05） ，其他各組間的世代時間與對照組相比均存在極顯著差異 （Plt;0.01） 。

17β-雌二醇對尾草履蟲種群生長率和世代時間的影響如圖6所示，不同處理組的尾草履蟲的種群生長率隨17β-雌二醇濃度的升高有短暫的升高趨勢，隨后呈下降趨勢。單因素方差分析結果表明， 0.3600mg/L 組的種群生長率與對照組相比差異不顯著，其他處理組的種群生長率與對照組相比均存在極顯著差異 （Plt;0.01） ，抑制作用最明顯的是 1.4500mg/L 組，種群生長率為（0.39±0.0030）/d. 比對照組降低了 24.2342% 。尾草履蟲的世代時間隨著17β-雌二醇濃度的升高呈上升趨勢，與種群生長率的變化趨勢相反。單因素方差分析結果表明，與對照組相比， 0.3600mg/L 濃度組世代時間差異不顯著，其他處理組的世代時間與對照組均存在極顯著差異 （Plt;0.01） ，其中 1.4500mg/L 組尾草履蟲繁殖速度最慢，與對照組相比，其世代時間延長了 32.09%

3討論

3.1 壬基酚和 17β^- 雌二醇對尾草履蟲的 LC₅₀

壬基酚對尾草履蟲 24，48h 的 LC₅₀ 為： 0.0994 、0.0766mg/L，17_I β-雌二醇對尾草履蟲 24.48h 的 LC₅₀ 為： 3.1199.2.9033mg/L ，尾草履蟲對壬基酚的敏感性大于 17β -雌二醇。尾草履蟲對壬基酚敏感性更高的原因可能是壬基酚和天然雌激素 17β/ -雌二醇的分子結構相似，但擴散到細胞內的方式不同（Shenetal，2009），壬基酚能夠更快地引起尾草履蟲對外源化學物質的應激反應，導致尾草履蟲對壬基酚的敏感性高于 17β -雌二醇。研究發現壬基酚對十指平甲輪蟲（Plationuspatulus） ）24hLC₅₀ 為 0.500mg/L （Gonzalez-Pérezetal，2021），對多刺裸腹澤（Moinamacrocopa）的 48h 的 LC₅₀ 為 0.1mg/L （Hong et al，2007），對大型澤（Daphniamagna）的 48h 的 LC₅₀ 為 14.23mg/L （蔡小宇等，2018），以上水生生物對壬基酚敏感性的大小為尾草履蟲 gt; 十指平甲輪蟲 gt; 多刺裸腹澤 gt; 隆線澤。由此可知對壬基酚毒性效應最靈敏的生物為尾草履蟲，由于物種特異性，因此不同物種對同種藥物的敏感性有所差異，且纖毛蟲的體積遠小于枝角類和輪蟲，尾草履蟲的細胞膜直接與水環境接觸，水環境微小的變化便會引起尾草履蟲產生應激反應（尹笑宇，2023），因此尾草履蟲對污染物的敏感性較高，更適合用作水生態毒理學的研究材料以及環境監測的指示生物。

本研究中 17β. -雌二醇對尾草履蟲 48hLC₅₀ 為2.9033mg/L ，Brennan等（2006）研究表明 17β. -雌二醇對大型澤 （D. magna）48 h LC₅₀ 為 2.870mg/L ，雌二醇對卜氏晶囊輪蟲（Asplanchnabrightwelli）的 48h LC₅₀ 為 8.18mg/L （劉露露等，2018），尾草履蟲對 17β. 雌二醇的敏感性明顯高于卜氏晶囊輪蟲與大型搔，進一步證明了原生動物對 17β/. -雌二醇的敏感性也高于枝角類與輪蟲。劉偉杰等（2018）的研究表明，壬基酚對羊角月牙藻（Selenastrumcapricornutum） 96h 半致死濃度為 0.979mg/L ，高于本試驗結果。Kozlo-va等（2022）發現 17β -雌二醇對四尾柵藻（Scenedes-musquadricauda）的生長具有明顯的抑制作用，壬基酚對膠網藻（Dictyosphaeriumsp.）的毒性會隨著膠網藻體積的增大而降低（Chengetal，2022），且微藻對壬基酚具有吸附作用，與藻類相比，尾草履蟲能夠直觀及靈敏地監測壬基酚和17β-雌二醇的毒性，適合作為壬基酚和17β-雌二醇污染的指示生物。

3.2壬基酚和 17β- 雌二醇對尾草履蟲種群動力學的影響

本研究結果顯示，尾草履蟲的最大種群密度隨著壬基酚和17β-雌二醇兩種藥物作用濃度的升高而呈現下降趨勢，濃度越高對尾草履蟲最大種群密度的抑制作用越明顯。對照組的尾草履蟲種群 24h 后進入指數生長期，指數生長期持續 72h，96h 達到最大種群密度，隨后進入衰退期。與對照組相比，在高濃度的壬基酚和 17β -雌二醇處理組 （0.3800mg/L 、1.4500mg/L） 中，尾草履蟲的指數生長期明顯縮短并很快進入衰退期。這與杜明磊（2020）的研究結果一致，尾草履蟲在抗生素的脅迫下，指數增長期和穩定期也會縮短而過早地進入衰退期。推測出現此現象可能是由于壬基酚和 17β -雌二醇對尾草履蟲造成損傷，破壞了蟲體的抗氧化系統，引起了尾草履蟲抗氧化系統的應激反應，對抗氧化酶的活性產生了負面影響（呂湘琳等，2022），且隨著暴露時間的延長對抗氧化酶活性的影響越明顯，使尾草履蟲的生長繁殖速度降低，過早地進入衰退期。

陳興蘭（2018）研究壬基酚對萼花臂尾輪蟲的種群動態時發現，高濃度的壬基酚不僅會影響萼花臂尾輪蟲（Brachionuscalyciflorus）的種群密度，還會影響高峰期到來的時間。高濃度的壬基酚抑制了萼花臂尾輪蟲的生長，這與本研究的結果一致，推測可能是由于水體中的壬基酚濃度嚴重超過了尾草履蟲的耐受限度，對尾草履蟲造成了細胞損傷（李邦平，2018），迫使尾草履蟲將攝取的能量更多地用于修復破損的細胞結構，影響細胞分裂，從而影響其種群密度以及明顯縮短指數生長期的時間。

尾草履蟲在對照組即自然條件下的停滯期為24h ，在高濃度的 17β/ -雌二醇作用下，尾草履蟲的停滯期延長至 48h ，說明高濃度的 17β. -雌二醇能夠抑制尾草履蟲的細胞分裂。Fyda等（1998）研究表明，纖毛蟲在種群密度積累到一定數量的時候才會進入下一生長期，隨著尾草履蟲停滯期的延長，外源物質17β/ -雌二醇對尾草履蟲的毒性逐漸增強，引起種群密度下降，進一步導致尾草履蟲的繁殖速度減慢，這可能是尾草履蟲世代時間延長的原因。Djebbi等（2022）研究表明克氏紡錘水蚤（Acartiaclausi）在不同生命階段對 17β. -雌二醇的敏感度不同，不同生命階段與17β -雌二醇的敏感性關系呈U型曲線。

不同環境下，纖毛蟲的種群生長率及世代時間會存在差異。本研究中尾草履蟲在壬基酚低濃度組0.0077mg/L 和高濃度組 0.0380mg/L 中的生長率與對照組存在極顯著差異，說明尾草履蟲對水體中壬基酚的存在極為敏感。隨著壬基酚濃度的增加，尾草履蟲種群生長率呈現下降的趨勢，而世代時間呈現上升的趨勢，這與付嬈等（2016）研究土霉素對扇形游仆蟲（Euplotesvannus）種群生長的影響基本一致。與李雪菡等（2021）發現低濃度的阿特拉津對扇形游仆蟲的種群生長起促進作用類似，尾草履蟲的種群生長率整體上隨著 17β. -雌二醇濃度的增加而減小，但在較低濃度 17β. 雌二醇 （0.2900mg/L） 的脅迫下，生長率卻高于對照組，表明低濃度的藥物脅迫能夠促進纖毛蟲的繁殖。

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（責任編輯 鄭金秀 崔莎莎）

Effects of Nonylphenol and 17β -estradiol on Population Growth ofParamecium caudatum

LIU Jiale， QI Hongli， LI Anqi， ZHANG Xinyue （Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture， College of Fisheries Science， Tianjin Agricultural University， Tianjin 30o384，P.R. China）

Abstract： In this study，Paramecium caudatum was selected for research，and we explored the toxicities of nonylphenol and 17β -estradiol，and their effects on the population dynamics of P. caudatum using static testing.Nonylphenol is an endocrine disruptor that mimics estrogen，a so-called“environmental estrogen\"，and 17β -estradiol is the primary female hormone. The concentration lethal to 50% of the test organisms （LC₅₀） ， the population growth rate （r） ， and the generation time （ G of P. caudatum were measured under different exposure concentrations. The 24hr-LC₅₀ for P. caudatum was 0.0994mg/L for nonylphenol and 3.119 9mg/L for 17β -estradiol， indicating that the acute toxicity of nonylphenol toward P. caudatum is much higher than that of 17β -estradiol. The maximum population density of P. caudatum in both the nonylphenol and 17β. -estradiol treatment groups was significantly lower than in the control group （Plt;0.01） ！ Both environmental estrogens significantly inhibited the population growth of P. caudatum and the inhibition increased with the concentration of nonylphenol or 17β -estradiol. A nonylphenol concentration of 0.0038mg/L and a 17β -estradiol concentration of 1.450 0mg/L had highly significant （Plt;0.01 ）effects on the P. caudatum population， with respective population growth rates of （0.12±0.036 0）/d ， （0.39± 0.004 0）/d ， and generation times of （5.84±0.036 0） d， ） d.Furthermore， high concentrations of nonylphenol and 17β -estradiol significantly decreased the population growth of P. caudatum. Because P. caudatum is more sensitive to environmental estrogens than Cladocera， it is a more suitable indicator of environmental estrogen pollution in water. Our results provide basic ecotoxicology data and a reference for the ecological risk assessment of nonylphenol and 17β -estradiol.

Key words： Paramecium caudatum; nonylphenol; 17β -estradiol;acute toxicity; chronic toxicity; lethal concentration ; population growth