一株高效去除亞硝酸鹽菌株的篩選鑒定與分子特征

中圖分類號(hào)：S949 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-3075（2025）03-0213-08

亞硝酸鹽存在于天然水體中，正常濃度范圍內(nèi)不會(huì)對(duì)水生動(dòng)物產(chǎn)生毒性，然而，由于工業(yè)污水排放高含氮物質(zhì)，以及集約化養(yǎng)殖過(guò)程中的高密度、高投喂量，引起養(yǎng)殖水體中殘留的高蛋白飼料和糞便蓄積，超過(guò)天然菌群的降解能力后，養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽等有害物質(zhì)大量累積，養(yǎng)殖水域生態(tài)環(huán)境不斷惡化，水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的發(fā)病率升高，進(jìn)而導(dǎo)致養(yǎng)殖成本增加，收益減少（雷霽霖，2010；羅小溪等，2015；王申等，2018）。

芽孢桿菌是一類能形成芽孢（內(nèi)生孢子）的桿菌或球菌，因其具有氨化、硝化、反硝化以及固氮能力，經(jīng)常被用作水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的有益微生物（雷新雨等，2021）。解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliq-uefaciens）DT能將有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為銨（Huietal，2019），蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）PB8能去除廢水中的亞硝酸鹽（Barmanetal，2018）。貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）屬于芽孢桿菌屬，為革蘭氏陽(yáng)性菌，已廣泛應(yīng)用于植物病害的防治、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和誘導(dǎo)植物抗逆，以及家畜疾病的預(yù)防和控制（Limetal，2018；Tanetal，2019），但目前有關(guān)貝萊斯芽孢桿菌去除亞硝酸鹽的研究較少。本研究從凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeusvannamei）養(yǎng)殖水體中篩選得到1株高效去除亞硝酸鹽菌株，并進(jìn)行了該菌株的生理生化指標(biāo)測(cè)定、菌株的亞顯微形態(tài)觀察、16SrDNA基因序列分析和全基因組測(cè)序，同時(shí)對(duì)其去除亞硝酸鹽途徑的基因表達(dá)進(jìn)行了初步探討，為其在亞硝酸鹽代謝研究和水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考信息和科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來(lái)源 菌株來(lái)自天津?qū)幒訁^(qū)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘。

1.1.2培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)基：蛋白膝 10g/L ，酵母浸粉5g/L ， NaCl10g/L g/L，NaNO₂0.3g/L，pH7.0 。LB液體培養(yǎng)基：蛋白陳 10g/L ，酵母浸粉 pH7.0 。LB固體培養(yǎng)基：蛋白豚 10g ，酵母浸粉 5g NaCl10g ，瓊脂 18g，pH7.0 。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)賽默飛公司）、GelDocEZImager凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)伯樂公司）BioPCR儀（美國(guó)伯樂公司）、JSM-IT300掃描電子顯微鏡（日本電子公司）紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、NanoDrop？ND-2000超微紫外分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛公司）和臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hettich科學(xué)儀器公司）。

1.2 方法

1.2.1高效去除亞硝酸鹽菌株的篩選取 1mL 采自濱海新區(qū)寧車沽凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘的水樣加入到 50mL 滅菌后的LB液體培養(yǎng)基中，于 34^°C 、160r/min 富集培養(yǎng) 24h ；取 1mL 富集菌液，稀釋10⁶ 倍，取 100mL 稀釋菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)皿（ 90mm） 上，將其置于 34^°C 恒溫培養(yǎng) 36h （尤田等，2023）。純化后將不同形狀、顏色的菌落接種到LB液體培養(yǎng)基，于 34'C，160r/min 培養(yǎng) 12h ，以 5% 的接種量轉(zhuǎn)移到含 300mg/L 亞硝酸鹽的LB液體培養(yǎng)基，分別于 0.2，4.6h 測(cè)定亞硝酸鹽的濃度，用于篩選高效去除亞硝酸鹽的菌株，命名為AP3。采用鹽酸萘乙二胺分光光度法、納氏試劑分光光度法、鋅鎘還原法（蘇兆軍等，2022），測(cè)定亞硝酸鹽、氨氮、硝酸鹽的濃度（國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》編委會(huì)，2002）。

式中： E_R 為亞硝酸鹽去除率 （%） ： T₁ 和 T₂ 分別為亞硝酸鹽的初始濃度和在時(shí)間 T 時(shí)亞硝酸鹽的濃度（ （mg/L） 。

1.2.2菌株的亞顯微形態(tài)觀察根據(jù)Kumari等（2019）的方法制備樣品：菌株用 2.5% 戊二醛溶液固定， pH7.4 的磷酸鹽緩沖洗去除戊二醛，梯度乙醇對(duì)細(xì)胞進(jìn)行脫水，滴于預(yù)先處理好的潔凈小蓋玻片上，自然干燥，用雙面膠帶粘于試樣臺(tái)上，離子濺射鍍膜，掃描電子顯微鏡觀察。

1.2.3菌株的生理生化指標(biāo)測(cè)定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（Noeletal，2001）和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠和蔡妙英，2001）的方法測(cè)定菌株的生理生化指標(biāo)。

1.2.4菌株的16SrDNA序列分析采用TIANampbacteriaDNAKit試劑盒提取菌株的基因組DNA（Qin etal，2023），利用通用引物27F（5'-AGAGTTT-GATCCTGGCTCAG- _?3? ）和1492R（5'-GGTTACCTT-GTTACGACTT- _?3? ），經(jīng)PCR擴(kuò)增后，送至金唯智生物科技有限公司測(cè)序。用NCBI的BLAST程序?qū)⑺煤塑账嵝蛄信cGenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，最后使用MEGA7.0軟件的Neighbor-Joining法（Saitouamp;Nei，1987）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5菌株的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)處理及功能注釋采用北京百邁客有限公司的ONT測(cè)序平臺(tái)（Deameretal，2016）進(jìn)行測(cè)序。在評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量之后，過(guò)濾接頭、低質(zhì)量及短片段（長(zhǎng)度 lt;2000bp 的原始讀數(shù)，使用Canu軟件對(duì)過(guò)濾后reads進(jìn)行組裝，并通過(guò)Racon和Circlator軟件對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行矯正和起始位點(diǎn)調(diào)整，完成菌株AP3的全基因組序列（侯莎等，2021）。

軟件Prodigal預(yù)測(cè)編碼DNA序列（CDS），tRNAscan-SE鑒定了非編碼RNA和tRNA，用不同的功能數(shù)據(jù)庫(kù)如 NCBI-Nr、GO、KEGG、eggNOG、Pfam、Swiss-Prot對(duì)預(yù)測(cè)基因進(jìn)行BLAST注釋（楊舟，2019）。1.2.6PCR和qPCR檢測(cè)菌株的相關(guān)基因及其表達(dá)基于全基因組測(cè)序結(jié)果，獲得與菌株AP3亞硝酸鹽去除相關(guān)的2個(gè)基因NirD和Nark，分別編碼亞硝酸鹽還原酶亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，利用菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分別于0、2、4、6h提取菌株AP3的RNA，檢測(cè)濃度和純度后將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行qP-CR檢測(cè)。引物由軟件Primer5.0設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

PCR擴(kuò)增條件： 94^°C 預(yù)變性 5min ， 94^9c 變性 退火 30s，72°C 延伸 1min，40 個(gè)循環(huán)， 72‰ 延伸 10min 。反應(yīng)結(jié)束后，用 1.8% 瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

qPCR反應(yīng)程序： 95^°C 預(yù)變性 2min;95°C 下反應(yīng)5" s"， 6 0℃反應(yīng) 30s，72°C 延伸 30s ，該步驟進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；溶解曲線： 95^°C 下反應(yīng) 15s，60° 下反應(yīng)1min ，每個(gè)循環(huán)增加 0.5^°C，95^°C 反應(yīng) 15s 。反應(yīng)結(jié)束后，保存并整理數(shù)據(jù)，利用 2^-ΔΔct 法處理數(shù)據(jù)。1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析測(cè)得的數(shù)據(jù)用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差 表示。利用MEGA7.0、SPSS26.0以及GraphPadPrism8軟件作圖并進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1篩選菌株去除亞硝酸鹽效果

經(jīng)過(guò)篩選，得到高效去除亞硝酸鹽的菌株，命名為AP3。 0～2h ，菌株去除亞硝酸鹽效率較低，去除率僅為 8.20%±1.43% ;2＼～4h亞硝酸鹽去除效率迅速升高， ^4h 時(shí)體系內(nèi)亞硝酸鹽含量已低于檢測(cè)下限（圖1）。

2.2篩選菌株去除亞硝酸鹽的代謝特性

如表2所示，在亞硝酸鹽去除過(guò)程中 NH₄⁺ 含量隨著亞硝酸鹽的去除而逐漸增加，而硝酸鹽含量在此過(guò)程中沒有明顯的變化。

表2菌株AP3去除亞硝酸鹽的代謝特性

2.3 菌株的鑒定

2.3.1菌株的形態(tài)特征菌株AP3菌落呈乳白色，邊緣粗糙且不規(guī)則，中間隆起，呈褶皺不透明狀（圖2a），掃描電鏡下觀察其呈黏連的短桿狀（圖2b）。

2.3.2菌株的生理生化特征菌株AP3生理生化特征如表3，其特征符合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠和蔡妙英，2001）中關(guān)于芽孢桿菌的描述。

2.3.3菌株的16SrRNA序列分析將序列提交上傳至GenBank中，發(fā)現(xiàn)菌株AP3屬于芽孢桿菌屬，且與B.velezensisstrainCBMB205相似度達(dá) 100% （圖3），結(jié)合菌株亞顯微形態(tài)觀察和生理生化特征，確定菌株AP3為貝萊斯芽孢桿菌。

2.4菌株的全基因組測(cè)序及亞硝酸鹽代謝相關(guān)因子

采用全基因組測(cè)序技術(shù)獲取菌株AP3的全基因組信息。AP3全基因組由1條3929786bp的環(huán)狀染色體和1個(gè)88966bp的質(zhì)粒組成，GC含量為46.48% 。AP3菌株的全基因組數(shù)據(jù)已提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為CP094294＼～CP094295。菌株的基因組圈如圖4所示。基因組上共有3866個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。在所有這些編碼基因中，菌株AP3氨基酸代謝和核苷酸代謝相關(guān)基因分別有289個(gè)和78個(gè)。

經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，得到菌株AP3的氮代謝通路圖（圖5），發(fā)現(xiàn)菌株AP3不存在由NirK和NirS基因編碼的細(xì)胞色素 cd₁ 型和Cu型的亞硝酸鹽還原酶，以及NirA基因編碼的鐵氧化還原蛋白-亞硝酸還原酶。而這3類亞硝酸鹽還原酶分別為反硝化過(guò)程、厭氧氨氧化過(guò)程和同化硝酸鹽還原過(guò)程中亞硝酸鹽還原的關(guān)鍵酶，推測(cè)菌株不存在上述3種亞硝酸鹽還原途徑。菌株AP3的異化硝酸鹽還原成銨（dissimilatoryreduc-tiontoammonium，DNRA）途徑是完整的，亞硝酸鹽可在NirBD（E.C.1.7.1.15）作用下轉(zhuǎn)化為 NH₄⁺ 。

2.5菌株去除亞硝酸鹽過(guò)程中相關(guān)因子的表達(dá)

基于基因組注釋，利用PCR技術(shù)成功擴(kuò)增出NirD和Nark基因（圖6）。qPCR技術(shù)檢測(cè)了AP3功能基因的相對(duì)表達(dá)水平（圖7），第0、2、4、6小時(shí)，菌株NirD和Nark基因表達(dá)水平均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中， 2hNirD 和Nark基因表達(dá)水平與 0h 相比差異顯著 （Plt;0.05），4h 體系內(nèi)亞硝酸鹽含量已低于檢測(cè)下限，此時(shí)NirD和Nark的基因表達(dá)水平開始下降，與 0h 相比無(wú)明顯差異。

Different lowercase letters denote significant differences （Plt;0.05） among means Fig.7 Variationof NirD and Nark functional gene expressionovertime

3討論

3.1貝萊斯芽孢桿菌去除亞硝酸鹽的能力

羅彤暉（2016）篩選的芽孢桿菌 LJ01，24h 內(nèi)能夠?qū)?250mg/LNaNO₂ 去除 99.31% ；Gao等（2018）用來(lái)自水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中的BacillusmegateriumS379去除 250mg/LNaNO₂ ，去除率 86.26% ；熊蝶等（2021）篩選的菌株 8h 對(duì)初始添加濃度為 150mg/LNaNO₂ 去除率為 49.46%±3.65% ；楊婷等（2022）用篩選分離的好氧反硝化芽孢桿菌JD-014對(duì)濃度為 200mg/L Na-NO₂ 去除率為 46.62% 。本研究從凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池中篩選到1株高效去除亞硝酸鹽的貝萊斯芽孢桿菌，在有機(jī)氮存在的情況下， 4h 內(nèi)對(duì) 300mg/L 的 NaNO₂ 去除率達(dá) 99% 以上，顯示出非常好的亞硝酸鹽去除效果，非常適宜于水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘使用。

3.2貝萊斯芽孢桿菌去除亞硝酸鹽的途徑

Nark和NirD基因分別參與亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和亞硝酸鹽還原酶的表達(dá)，其中MFS家族蛋白NarK基因，參與去除過(guò)程中亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)（黃麗玲等，2021）；NirD為亞硝酸鹽還原酶小亞基，是參與亞硝酸鹽還原為 NH₄⁺ 的一個(gè)重要因子（Yimazetal，2022）。qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，2hNark和NirD基因表達(dá)水平迅速升高，可能是由于體系內(nèi)亞硝酸鹽的增多促進(jìn)了亞硝酸鹽向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)入胞內(nèi)的亞硝酸鹽在亞硝酸鹽還原酶的催化下被還原成 NH₄⁺ （楊小龍等，2023），4h體系內(nèi)亞硝酸鹽含量已低于檢測(cè)下限，所以此時(shí)NirD和Nark表達(dá)水平開始下降，與 0h 無(wú)明顯差異。

DNRA過(guò)程是由微生物介導(dǎo)，將硝酸鹽和亞硝酸鹽直接還原為 NH₄⁺ 的酶促氧化還原反應(yīng)（張涵瑞等，2022），根據(jù)亞硝酸鹽到 NH₄⁺ 的還原過(guò)程可分為呼吸型和發(fā)酵型（萬(wàn)雨軒和王鑫，2021），大多數(shù)DNRA過(guò)程是發(fā)酵型，細(xì)菌以有機(jī)物作為電子供體，通過(guò)底物水平磷酸化產(chǎn)生能量，用于還原反應(yīng)的發(fā)生（卜翠娜，2018）。NirBD/NrfA基因是DNRA途徑的關(guān)鍵基因，可在DNRA過(guò)程中將亞硝酸鹽直接催化成 NH₄⁺ （Huangetal，2020）。謝柄柯等（2016）發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)體系中添加有機(jī)氮可以促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)和代謝，進(jìn)而促進(jìn)菌株DNRA過(guò)程。王爽（2017）通過(guò)對(duì)B.amyloliq-uefaciensSYBCH47的全基因組分析，發(fā)現(xiàn)菌株SYBCH47存在NirBD基因，但不能在以亞硝酸鹽為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，故推測(cè)其亞硝酸鹽的代謝是通過(guò)硝酸鹽異化還原為銨。這與本研究的結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)了1株在有機(jī)氮存在下高效去除亞硝酸鹽的菌株AP3，通過(guò)全基因組測(cè)序和生理生化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株AP3中存在的NirBD基因能夠在有氧條件下將亞硝酸鹽還原成 NH₄⁺ ，而未檢測(cè)到其他物質(zhì)產(chǎn)生，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋和PCR驗(yàn)證菌株AP3基因組沒有編碼NirK、NirS和NirA的基因，其亞硝酸鹽代謝途徑只有DNRA途徑是完整的。故推測(cè)菌株AP3對(duì)亞硝酸鹽的去除途徑可能為發(fā)酵型DNRA過(guò)程。

4結(jié)論

本研究從養(yǎng)殖池塘中分離得到1株高效去除亞硝酸鹽的菌株AP3，經(jīng)生理生化指標(biāo)測(cè)定、亞顯微形態(tài)觀察以及16SrDNA基因序列分析，確定其為貝萊斯芽孢桿菌。采用全基因組測(cè)序、PCR和qPCR技術(shù)對(duì)菌株亞硝酸鹽去除途徑進(jìn)行分析，確定菌株AP3存在NirD和Nark功能基因與亞硝酸鹽去除相關(guān)，推測(cè)該菌株去除亞硝酸鹽的途徑為DNRA途徑。

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（責(zé)任編輯熊美華）

Screening，Identification and Molecular Characterization of a Highly Efficient Nitrite-Removing Strain of Bacteria

SUN Ruibin， BAI Huiying， YUAN Chunying， CUI Qingman

Collge of Marine amp;Environment，Tianjin UniversityofScience and Technology，Tianjin300450，P.R.China）

Abstract： In this study，an efficient nitrite removal strain，designated AP3， was screened by the dilution plate method from a culture of Litopenaeus vannamei. We then measured the physiological and biochemical indices of the strain， observed the submicroscopic morphology of the strain and analyzed the 16S rDNA gene sequence.The entire genome sequence of AP3 was determined on an Oxford Nanopore platform，and the nitrite removal pathway was explored using PCR and qPCR.While the removal rate of nitrite from the medium （initial nitrite concentration， 300mg/L ）waslow（ 8.20%±1.43% ）bytheAP3 train during the first 2hr of incubation， the nitrite level was below the detection limit after ^4h . The AP3 strain was identified as Bacillus velezensis using a combination of physiological and biochemical characteristics， submicroscopic observation of morphology and the 16S rDNA gene sequence. The entire genome sequence and KEGG functional annotation revealed the presence of NirD and Nark functional genes in the nitrite removal pathway that were efectively amplified during the nitrite removal proces.The relative expression level of the AP3 functional genes was detected by qPCR technology and the results showed that the expression of Nark and NirD genes increased rapidly at 2h . There was a highly significant increase （204號(hào) （Plt;0.01） in NirD gene expression at 2 hour compared with 0h ，but the expression of NirD and Nark at 4 h were not significantly different from those at 0h . The nitrite removal pathway of this strain is presumed to be DNRA.These results provide a theoretical basis for applying Bacillus to nitrite removal in aquaculture water， and are of great practical significance for the biological treatment of culture water.

Key words： Bacillus velezensis; nitrite; whole genome sequencing; removal pathway; gene expression