納米二氧化鈦影響泥蚶受精的作用機理

中圖分類號：Q492.4 文獻標志碼：A 文章編號：1674-3075(2025)03-0050-11

1，1，1，2，3，1

（1.2.3.）

納米二氧化鈦( nTiO₂ 、nano- ?TiO₂ 或 TiO₂ NPs)是一種常用納米金屬氧化物，由于其具有熱穩定、吸收紫外線、光催化活性等特性，被廣泛應用于涂料、個人護理產品、清潔劑、塑料和藥品等多種產品的生產中（Lietal，2016;Jafarietal，2020；Yuetal，2020a）。2016年 nTiO₂ 全球產量約為 68000t ，預計2025年全球年產量達 2.5×10⁶ t(ZhengNowack，2021)，其大量生產使用， nTiO₂ 不可避免地被釋放到環境中，經降雨、地表徑流、污水排放等途徑進入海洋(Bakeretal，2014)。研究表明，水環境中 nTiO₂ 的濃度約為 0～ 103μg/L ，底泥中為 0～432mg/kg (Gottschalk et al，2009；Lietal，2022）。西班牙巴利阿里群島近岸海水中檢測到 nTiO₂ 濃度范圍在 7～40μg/L (Ded-manetal，2021)。由于其具有高表面反應活性，進入

收稿日期：2024-12-30

海洋環境后的 nTiO₂ 會迅速歷經物理轉化（團聚、同質和異質聚集及沉降）、化學轉化（光化學轉化）以及生物轉化（生物改性)等多種轉化過程，并與海洋生物發生相互作用，進而對海洋生物的生長代謝、受精、胚胎發育等多個生命進程產生不利影響，最終威脅生態系統的穩定性(Lietal，2016)。

受精是海洋生物生命周期的關鍵步驟，是維持種群數量的基礎。大多數海洋無脊椎動物，諸如雙殼貝類，采用廣播式繁殖策略，即將配子直接排入海水中以完成受精。因此，這些海洋無脊椎動物的配子極易受到海水中污染物（如 nTiO₂ 的影響。依據海洋無脊椎動物受精動力學的模型研究（Vogeletal，1982)，若精子運動速度減緩，會相應減少與卵細胞在水體中的碰撞幾率，進而導致受精率的降低。近年來，盡管許多污染物對海洋無脊椎動物精子的毒性效應在一些物種中已有不少報道(Gottschalketal，2013；Galloetal，2016)，但 nTiO₂ 對海洋雙殼貝類精子功能的影響及作用機理仍不明晰，亟待進一步深入解析。

眾所周知，精子運動主要依靠線粒體產生的ATP供能，其氧化呼吸鏈中關鍵酶丙酮酸激酶(Pyruvatekinase，PK）、磷酸果糖激酶（6-phosphofructo kinase，PFK)的活性與細胞中ATP含量密切相關，故精子線粒體的狀態能夠顯著影響其運動速度、細胞活力和受精能力（Tsuyoshi etal，2002;Gu etal，2019;Ikena-gaYoshidaetal，2020)。與此同時，鈣離子（ ?Ca²⁺ ）

在精子運動、頂體反應和精卵融合等過程中充當第二信使而發揮著重要作用，其胞內濃度對于精子的質量至關重要（BondarenkoCosson，2019）。精子尾部的豐富 Ca²⁺ -ATP酶（ Ca²⁺ -ATPase)負責調節精子內部的 Ca²⁺ 濃度及其生理功能，當 Ca²⁺ -ATPase缺失或活性減弱時，會造成精子運動能力下降（Oku-nadeetal，2004；Lestarietal，2018）。納米顆粒會影響細胞線粒體功能以及 Ca²⁺ 穩態，納米鎳(nNi)暴露會干擾小鼠細胞線粒體供能（Zhaoetal，2009；Chenetal，2018），納米氧化鋅可抑制人上皮細胞Ca²⁺. -ATPase活性（Wangetal，2013），但 nTiO₂ 對海洋雙殼貝類精子供能及胞內 Ca²⁺ 穩態的影響未見報道。此外，納米顆粒暴露可誘導細胞產生大量活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS），從而引起細胞氧化應激（Kadaretal，2011）。過量的ROS作用于細胞磷酸脂膜，可通過脂質過氧化作用產生丙二醛（malondialdehyde，MDA），進而破壞細胞膜的穩定性和局部流動性（Shuklaetal，2011；Houetal，2018），并干擾細胞的正常生命活動（Yuetal，2020b），而nTiO₂ 暴露的具體影響還有待進一步研究證明。

海洋灘涂雙殼貝類大多行動遲緩甚至缺乏運動能力，主濾食水體中的微藻、有機碎屑、原生動物等，是灘涂生態系統的重要成員之一。由于其生活特性，棲息于潮間帶的雙殼貝類極易受到陸源污染物的影響（Shietal，2017a；Zhaetal，2019)。因此，海洋灘涂雙殼貝類被廣泛用作環境污染指示生物以及生態毒理學研究的模式動物(Galloetal，2020；StrehseMaser，2020；Lietal，2021）。泥蚶（Tegillarca granosaLinnaeus)，俗稱\"血蚶\"，隸屬于軟體動物門(Mollusca)雙殼綱（Bivalvia）蚶目（Arcoida)蚶科（Arcidae)，是我國重要的經濟養殖灘涂雙殼貝類之一（林志華等，2023)。研究 nTiO₂ 對泥蚶受精的影響，不僅有助于提升泥蚶養殖產業的經濟效益，還可為水產養殖業的污染防控、生態安全及政策制定提供科學支撐。因此，本研究以泥蚶為研究對象，聚焦環境濃度水平的 nTiO₂ 對泥蚶精子的毒性作用，從精子運動能力、細胞供能、胞內 Ca²⁺ 穩態、氧化應激水平等多個角度進行研究分析，旨在探究 nTiO₂ 對泥蚶精子的潛在致毒機制。

1材料與方法

1.1實驗材料與試劑

實驗所用 nTiO₂| 平均粒徑( 20.45±3.11) nm， ?99.8%] 和非納米級二氧化鈦 TiO₂ bulk，平均粒徑 (3.58±0.61)μm gtrsim99.8% 購買于上海克拉馬爾試劑有限公司。實驗開始前，用透射電鏡（TEM)和X射線衍射分析對nTiO₂ 的形態、粒徑和晶體結構進行表征測定（附圖1，2)。暴露期間工作液現配現用，使用前，母液超聲振動 30min(1g/L，4% ，避光保存）。通過電感耦合等離子體原子質譜法對各組中鈦的工作濃度進行檢測(表1)。

表1納米二氧化鈦和二氧化鈦在的濃度設置 μg/L

1.2泥蚶的獲取與暫養

本研究中所用泥蚶個體[殼長 (37.17±5.85)mm] 均來自浙江省海洋水產養殖研究所清江基地。實驗開始之前，泥蚶個體經海水小心清洗，清除殼表污物，隨后置于 1000L 的塑料桶（內有過濾海水 800L) 中暫養兩周。暫養期間，海水溫度為 (26.31±0.08) ） C ，pH為 8.05± 0.01，鹽度為 21.8%0±0.1% ，溶氧為 (7.94±0.28)mg/L 此外，需確保桶內海水 24h 不間斷地充氣，每日下午6點投喂一次足量的扁藻(Platymonassubcordiformis)，在投喂 2h 后更換海水（Shietal，2017b）。

1.3泥蚶配子的獲取與納米二氧化鈦處理

根據已有報道的催產方法，通過陰干和溫度刺激法獲取泥蚶的雌雄配子（Shietal，2017a；Hanetal，2016)。在實驗開始前一日，從暫養桶中隨機選取大小均一的泥蚶，用過濾海水小心清洗干凈，后于 20^°C 的恒溫環境中進行一夜的陰干。第2天上午，將每個泥蚶單獨安置在含有 500mL 過濾海水的燒杯內（室溫 25^°C 左右)進行催產，同時持續曝氣。泥蚶開始釋放配子立即中斷充氣，在 30min 后，配子懸液的收集。用顯微鏡(Eclipse-Ci，Nikon)檢查配子的質量并挑選高質量配子「精子應具備快速游動的能力，不動精子的比例少于 5% ；卵細胞應是規則、飽滿的均質球形，直徑約在 (58.00±2.55)μm] 用于后續實驗。同時，取 2μL 泥蚶精子，于顯微鏡下使用血細胞計數板統計精子數量并計算密度。為確保實驗的準確性，每個精子樣品至少進行3次獨立測定（BabcockKeesing，1999），舍去活力不足或濃度過低的樣品。

將每個泥蚶的精子樣品均勻分配成12份（分為4個處理組，每組包含3個重復以避免個體差異帶來的誤差），根據已報道的 nTiO₂ 實際環境濃度水平(Gottschalk et al，2009；Sun et al，2016；Shi et al，2017a)，分別置于以下環境中暴露 2h ：對照組（未處理的過濾海水）、 100μg/L TiO₂ （bulk組或陰性對照組） 10μg/LnTiO₂ 和 100μg/LnTiO₂ ，最后取各組精子樣品用于后續的對比分析。

1.4納米二氧化鈦對泥蚶受精的影響

將同一雌性泥蚶的卵細胞平均分為12份，分別放置在12個裝有 500mL 正常過濾海水的燒杯中。參照之前相關研究的報道，在精子暴露處理 2h 后，按照100:1的精卵比例向含有正常卵細胞的燒杯中分別加入各個處理組的精子（StyanButler，2000；Kadaretal，2013)。受精 30min 后，過濾收集各實驗組的受精卵細胞，并用 4% 多聚甲醛(PFA)固定，以便進行后續受精率的統計分析。

1.5泥蚶精子運動速度的分析

將經過相應處理的 100μL 精子懸液放置于單凹載玻片上，并覆蓋上蓋玻片(Havenhandetal，2008)。將載有樣本的凹面載玻片置于顯微鏡(Eclipse-Ci，Nikon)下，在 200× 的放大條件下觀察精子的活動狀態，同時拍攝至少 30s(30 幀/s)的視頻。隨后，采用Image-J?v1.48u? 中的計算機輔助分析(CASA)工具，對精子運動視頻的數據進行深入分析。參照劉廣緒(2013)的方法，通過量化精子的運動路徑，計算出各個實驗組精子運動的平均曲線運動速度(curvilinearvelocity，VCL）、平均路徑速度(average path velocity，VAP)和平均直線運動速度（straight line velocity，VSL）（Vogel etal，1982；施巍，2019)。為確保數據的準確性，本實驗在不同處理組中，對來自6個雄性泥蚶的精子樣品進行了檢測，每個實驗組至少統計100個精子。

1.6泥蚶精子PK、PFK活性和ATP含量的測定

經暴露處理 2h 后，從精子懸液中取出 10mL 樣品，使用高速冷凍離心機（5417R，Eppendorf)以2 000rpm 離心 15min ，收集不同組別的泥蚶精子樣品，用于測定精子內丙酮酸激酶(PK）、磷酸果糖激酶（PFK）活性以及ATP含量。

采用PK活性檢測試劑盒（BC0545，索萊寶），根據試劑盒的操作要求將樣品混勻后加樣，在 340nm 波長下測量樣品的吸光值 A1(20s) 。孵育 2min 25^°C) 后， 2min20s 后再次在 340nm 波長下測量樣品的吸光值 A2 。通過下列公式計算泥蚶精子的PK活性 (U/mg) ）°

式中： A_PK 為PK活力， U/mg V_s 為取樣體積， mL V_t 為反應總體積， 為樣品蛋白濃度。

類似地，采用PFK活性檢測測試盒（BC0535，索萊寶)，將樣品混勻后加樣后，記錄樣品在 340nm 波長下 20s 時的吸光值 A1 和 10min20s 時的吸光值 _A2 通過下列公式計算泥蚶精子的PFK活性 (U/mg ）。

式中： A_PFK 為PFK活力， U/mg 。

在本實驗中，ε代表NADH消光系數 (6.22×10³ L/mol/cm ），d為96孔板的光徑 (0.6cm) ），總反應體積為 200μL ，每個樣品的體積為 10μL ，并根據BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0010，碧云天）所提供的操作步驟對泥蚶精子的蛋白濃度 (mg/mL )實施定量分析。

使用ATP含量檢測試劑盒（A095-1，南京建成），遵循試劑盒說明書將樣品混勻后加樣，并利用酶標儀（MultiskanFC，Thermo）測量樣品在 636nm 波長下的吸光值。通過下列公式計算泥蚶精子的ATP含量 )。其中，樣品蛋白濃度測定方法如上。

式中： C_ATP 為ATP含量， OD_t 為測定OD值， OD_c 為對照OD值， OD_s 為標準OD值， OD_b 為空白OD值，C_s 為標準溶液濃度。

1.7泥蚶精子 Ca²⁺ 含量和 Ca²⁺. -ATPase活性的測定

經暴露處理 2h 后，從精子懸液中取 1mL 樣品，用于測定精子中的 Ca²⁺ 含量；另從懸液中取 10mL 樣品，使用高速冷凍離心機以 2000rpm 離心 15min ，用于測定精子 Ca²⁺ -ATPase活性。

使用Fluo-4AM Ca²⁺ 特異性熒光探針檢測試劑盒（S1060，碧云天），首先遵循試劑盒說明書從每組中取 1mL 精子樣品放入12孔板，并加入 10μL 的Fluo- .4AM(2mmol/L) ，在 25^°C 下避光染色 30min 。后將其轉移到離心管中，以 2 000rpm 離心 15min ，并用過濾海水漂洗3次（每次 5min) 清除多余的Fluo-4AM。隨后制備精子樣品的臨時玻片，并在熒光顯微鏡(BX53F，Olympus)下使用 488nm 的激發光和 525nm 的發射光進行觀察并拍照，放大倍數為400× 。最后，利用Image-J分析不同實驗組泥蚶精子內 Ca²⁺ 的熒光強度，以平均熒光強度（（MeanFluores-cenceIntensity，MFI)）來表示泥蚶精子內 Ca²⁺ 的平均含量，公式如下：

式中： M_Ca²+ 為 Ca²⁺ 的平均熒光強度， D_ca²⁺ 為 Ca²⁺ 累積光密度值， ?A_Ca²⁺ 為 Ca²⁺ 總熒光面積。

使用超微量 Ca²⁺ -ATPase檢測試劑盒（A070-4，南京建成），按照試劑盒說明書要求將樣品混勻后加樣，后在 636nm 波長下測量樣品的吸光值。樣品的蛋白濃度使用BCA法來測定。根據下列公式計算泥蚶精子的 Ca²⁺. -ATPase活性

1.8泥蚶精子氧化應激程度的測定

經暴露處理 2h 后，從精子懸液中取 1mL 樣品，用于測定精子中的ROS含量；另從懸液中取 10mL 樣品，使用高速冷凍離心機以 2000rpm 離心 15min 用于測定精子內MDA含量。

采用ROS檢測試劑盒（S0033S，碧云天），依據試劑盒說明書進行實驗操作。首先每個實驗組取 1mL 泥蚶精子樣品放入12孔板中，并加入 10μL 稀釋后的DCFH-DA(2，7-二氯熒光素二乙酸酯)染液(1mmol/L），在 25^°C 條件下避光染色 30min 。染色完成后，將精子懸液轉移到離心管中，以 2000rpm 離心 15min ，并用過濾海水漂洗3次（每次 5min) 以清除多余的DCFH-DA。隨后制備精子樣品的臨時玻片，并在熒光顯微鏡下使用 488nm 的激發光和 525nm 的發射光進行觀察并拍照，放大倍數為 400× 。最后，利用Image-J軟件分析不同處理組泥蚶精子內ROS的熒光強度，以平均熒光強度(Mean)作為泥蚶精子內ROS水平的代表，公式如下：

式中： M_ROS 為ROS的平均熒光強度， D_ROS 為ROS累積光密度值， A_ROS 為ROS總熒光面積。

采用脂質過氧化(MDA)檢測試劑盒（A003-4-1，南京建成），依照試劑盒說明書要求將樣品混勻后加樣，后于 532nm 波長下測量樣品吸光值。通過下列公式計算泥蚶精子的MDA含量（nmol/mgprotein）。其中，樣品的蛋白濃度使用BCA法來測定。

式中： C_MDA 為MDA含量。

1.9數據的統計與分析

本研究借助單因素方差分析(One-wayANOVA)對不同實驗組的實驗數據結果進行顯著性差異檢驗，通過Tukey檢驗(Post-hocTukeytests)展開多重比較，確定各組之間是否存在顯著性差異。所有數據均預先利用Levene檢驗和Shapiro-Wilk檢驗，分別對原始數據的方差齊性和正態分布進行驗證，將不滿足條件的原始數據進行arcsin平方根轉換。所有統計分析均使用OriginPro2021軟件完成。統計顯著性差異的判定標準為 P<0.05 ，數據結果以mean 1±SD 的形式呈現。

2結果與分析

2.1納米二氧化鈦對泥蚶受精率的影響

實驗結果顯示，高濃度 nTiO₂(100μg/L) 能夠顯著降低泥蚶的受精率（圖1A），而 TiO₂ 和低濃度nTiO₂ 處理組對泥蚶受精率無顯著影響。與對照組相比，精子在經過 2h 的 nTiO₂(100μg/L) 暴露后，其受精率顯著下降了 20.94%(P<0.05) 。

2.2納米二氧化鈦對泥蚶精子運動速度的影響

單因素方差分析表明，經 nTiO₂ 處理后，泥蚶精子的VCL顯著降低。與對照組相比，經 nTiO₂ 處理的泥蚶精子在10和 濃度下，VCL分別減少了16.03% 和 29.04% （圖 1B，P<0.05) 。類似地，與對照組相比，經 nTiO₂ 處理的泥蚶精子在 和 100μg/L 濃度下，VSL分別減少了 20.21% 和 63.99% （圖1C，P<0.05) 。相比之下， TiO₂ 處理對泥蚶精子的VCL和VSL沒有顯著影響。此外，經 nTiO₂ 處理后，與對照組相比， 100μg/L 高濃度 nTiO₂ 處理導致泥蚶精子的VAP降低了 31.75% （圖1D， P<0.05) 。而低劑量 nTiO₂ C 10μμ) 和 TiO₂ 處理對泥蚶精子的VAP無顯著影響。

2.3納米二氧化鈦對泥蚶精子PK、PFK活性和ATP含量的影響

單因素方差分析結果表明， nTiO₂ 暴露對泥蚶精子PK活性有顯著抑制作用（圖2A)，相較于對照組，nTiO₂ 處理組( ??10μg/L 和 100μg/L) 的泥蚶精子PK活性分別下降 27.30% 和 50.51%(P<0.05) 。 TiO₂ 處理未對泥蚶精子PK活性產生顯著性影響。此外， nTiO₂ 暴露顯著抑制泥蚶精子PFK的活性(圖2B)，與對照組相比，高濃度（ 100μg/L 處理組精子PFK活性顯著降低 51.41%(P<0.05) 。低濃度 (10μg/L) 及 TiO₂ 處理對精子PFK活性無顯著影響。類似地，實驗結果顯示， nTiO₂ 暴露致使泥蚶精子ATP含量明顯降低（圖2C)。與對照組相比， nTiO₂ 處理組 (10μg/L 與100μg/L) 泥蚶精子ATP含量分別降低 13.54% 和24.89%(P<0.05) 。 TiO₂ 處理對泥蚶精子ATP含量未產生顯著影響。

2.4納米二氧化鈦對泥蚶精子 Ca²⁺ 含量和 Ca²⁺- ATPase活性的影響

單因素方差分析表明， nTiO₂ 暴露顯著減少了泥蚶精子內 Ca²⁺ 含量（圖3A），且對泥蚶精子 Ca²⁺. 1

ATPase活性有顯著抑制作用（圖3B)。與對照組相比， nTiO₂ 處理組 (10μg/L 和 $1 0 0 ~ \\mu \\varrho / \\mathrm { L } \\dot$ 的泥蚶精子Ca²⁺ 含量分別降低了 30.66% 和 50.10%(P<0.05) ，泥蚶精子 Ca²⁺. -ATPase活性分別降低了 44.33% 和68.95%(P<0.05) 。 TiO₂ 處理對泥蚶精子 Ca²⁺ 含量和Ca²⁺ -ATPase活性未產生明顯影響。

2.5納米二氧化鈦對泥蚶精子ROS和MDA含量的影響

單因素方差分析表明， nTiO₂ 能夠顯著提高泥蚶精子ROS含量（圖4A）和MDA含量（圖4B）。將泥蚶精子置于 nTiO₂ 環境 ^2h 后， nTiO₂ 處理組（ 和 ）的精子ROS含量分別為對照組的1.14倍和1.55倍 (P<0.05) ，MDA含量分別上升至對照組的1.88倍和2.55倍 (P<0.05) 。 TiO₂ 處理未使泥蚶精子ROS和MDA含量發生明顯變化。

3討論

受精是種群繁衍的基礎。近年來，已有部分研究顯示，納米顆粒會對海洋無脊椎動物精子產生毒性效應，進而影響其受精及后續的胚胎發育過程（Schuhetal，2004;Kadaretal，2013）。然而，不同類型的納米顆粒之間理化性質差異顯著，因此，本實驗分析了環境濃度 nTiO₂ 暴露對泥蚶精子及受精的影響，研究結果表明，環境濃度水平的 nTiO₂ 暴露對泥蚶具有明顯的精子毒性，顯著降低泥蚶的受精率（圖1A)，對泥蚶的種群數量構成了潛在威脅。

眾所周知，精子運動速度是衡量海洋無脊椎動物精子受精能力的關鍵指標之一（Styan，1998；劉廣緒，2013;Campbell etal，2016)。研究表明， nTiO₂ 能夠顯著減弱紫貽貝（Mytilusgalloprovincialis)和金頭鯛（Sparusaurata)等水生生物精子的運動速度（Doseetal，2024;Oliveiraetal，2024)。本實驗發現，環境濃度水平的 nTiO₂ 暴露顯著抑制了泥蚶精子的運動速度（圖1B，1C和1D)。根據受精動力學模型，大多數海洋無脊椎動物精子運動速度和受精成功率之間具有相關性，即運動速度快的精子與卵細胞碰撞的概率更高(Campbell etal，2016;IkenagaYoshi-daetal，2020)。因此，泥蚶精子運動速度的降低可能是 nTiO₂ 導致泥蚶受精率顯著降低的原因之一。此外，本研究結果還顯示， nTiO₂ 可通過干擾精子供能、擾亂精子內 Ca²⁺ 穩態并造成精子氧化應激，顯著抑制泥蚶精子的運動，進而影響精子的受精能力。

胞內線粒體產生的ATP是精子運動的直接能量來源（Abdel-Latifetal，2020)。研究發現，經過 nTiO₂ 及納米聚氯乙烯(nPVC)等納米顆粒暴露后，小鼠的巨噬細胞和腎細胞線粒體呼吸鏈會遭到破壞，從而使胞內ATP含量下降(Kadaretal，2011;MahadevanValiyaveettil，2021）。在葡萄糖降解產生ATP的過程中，PK和PFK起到催化不可逆反應的作用，被認為是糖酵解的關鍵酶（Abdel-Latifetal，2020)。有研究顯示，納米塑料(NPs)暴露可以顯著抑制南美白對蝦（Litopenaeusvannamei)和日本沼蝦（Macrobrachi-umnipponens)等水生甲殼動物PK和PFK基因的表達并降低其酶活性(Lietal，2021；Lietal，2024)。本研究中也發現， nTiO₂ 暴露能夠顯著抑制泥蚶精子內PK和PFK的活性，進而降低精子ATP含量（圖2A，2B和2C)。一旦精子的供能系統受到影響，將無疑會削弱其整體的運動能力，并最終影響泥蚶精子的受精能力。

Ca²⁺ -ATPase廣泛分布于精子尾部，作為調節精子內 Ca²⁺ 水平的主要通道， Ca²⁺ -ATPase可以通過改變 Ca²⁺ 含量調節肌動蛋白的滑動，進而影響精子鞭毛的波形反應（Chiaranteetal，2020）。同時，精子內Ca²⁺ 穩態是維持其正常生命活動的基礎（Torrezan-ni-taoetal，2021)。此前有研究報道發現，納米二氧化硅處理后，大鼠和人心肌細胞的 Ca²⁺. -ATPase的活性及其基因表達會受到顯著抑制，從而導致心功能障礙（Shietal，2017a；Lozanoetal，2020）。類似地，nTiO₂ 暴露可以通過造成小鼠精子胞內 Ca²⁺ 水平的擾動來減少精子尾部線粒體數量，進而明顯削減其精子的游動速度(Okunadeetal，2004)。因此，本實驗nTiO₂ 暴露很可能是通過抑制 Ca²⁺. -ATPase活性，導致泥蚶精子 Ca²⁺ 含量顯著減少，進而削弱其運動能力的。此外，由于頂體反應是配子膜融合發生的必要條件，而精子內 Ca²⁺ 水平波動是頂體反應的基礎（Strünkeretal，2011;Mata-Martinezetal，2021）。因此，當 nTiO₂ 暴露使精子 Ca²⁺ 含量降低時，可能會干擾頂體反應進而遏制精子順利入卵，并削弱泥蚶精子的受精能力。

納米顆粒的暴露可能通過直接的物理損傷或內吞作用內化到細胞中，刺激細胞產生過量的ROS，而細胞脂質受到自由基攻擊過氧化后會產生MDA，ROS和MDA的大量產生會導致精子發生氧化應激而干擾精子的正常功能（Chompoosoretal，2010；Tuncetal，201O；Kadaretal，2011；Huerta-Garcia etal，2014)。例如，Gallo等(2016)發現nNi暴露可以造成玻璃海鞘（Cionaintestinalis）精子內ROS含量激增，導致精子膜脂質過氧化并破壞其膜的完整性，進而通過干擾精子對卵細胞的識別而損害玻璃海鞘精子的受精能力。本研究也發現，經 nTiO₂ 處理后的泥蚶精子內ROS和MDA含量均顯著增加（圖4A，4B）。與此同時，納米顆粒暴露引起的機體氧化應激易使Ca²⁺ -ATPase的構象狀態和功能受損（Bourgeronetal，1995；Srinivasetal，2019)。因此， nTiO₂ 暴露可能通過誘導精子氧化應激，進而損害泥蚶精子的運動和受精能力。

除此之外，由于受精是一個復雜的過程，其可能還受到其他諸多因素的影響。Shi等(2017b)在海洋酸化對泥蚶受精影響的研究結果中表明，中等程度的微弱酸化處理雖然能夠對泥蚶精子的運動速度和細胞內 Ca²⁺ 含量產生抑制作用，但最終與對照組的受精率相比無顯著差異。類似地，在本研究中，對于運動速度、酶活性以及ROS、MDA含量的變化，低濃度nTiO₂(10μg/L) 即可對泥蚶精子產生抑制作用，可是最終受精率沒有受到顯著影響，可能是因為較低濃度的 nTiO₂ 還不足以對受精率有顯著影響。此外，低濃度 nTiO₂(10μg/L) 處理組的受精率雖然沒有顯著降低，但仍有降低的趨勢，表明低濃度 nTiO₂ 對泥蚶受精過程的影響也有潛在的威脅，需引起重視。

綜上所述，本研究表明 nTiO₂ 可能通過限制泥蚶精子供能、干擾精子內 Ca²⁺ 穩態以及誘導精子氧化應激，從而削弱泥蚶精子的運動能力、影響泥蚶的受精過程，并最終對泥蚶種群的繁衍構成潛在威脅。此外，通過陰性對照實驗，本研究還揭示了 nTiO₂ 的毒性效應與其納米尺度特性有關而與本身的化學毒性無關。

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(責任編輯 鄭金秀 崔莎莎)

福 六福120nm

文中所用 nTiO₂ 的X射線衍射圖譜顯示，該晶體的主峰為 25.3^° ，次峰為 37^°～40^° 三峰。因此，通過X射線衍射圖譜的主峰位置及峰型特征，可以確定文中所用 nTiO₂ 為銳鈦礦型二氧化鈦。

Effect of Nano Titanium Dioxide on Fertilization of Tegillarca granosa

YU Xingzhou1， ZHAN Ziyan1， QI Jinxiao1，LIU Guangxu2， ZHAO Xinguo， HAN Yu1 (1.School of Life and Environmental Science，Hangzhou Normal University， Hangzhou 311121，P.R.China; 2. College of Animal Science， Zhejiang University， Hangzhou 310o58， P.R. China; 3.Yellow Sea Fisheries Research Institute，Qingdao 266071， P.R. China)

Abstract: In this study， we investigated the effects of environmental nano titanium dioxide (nTiO₂) exposure on sperm motility and fertilization of the marine bivalve Tegilarca granosa (blood clam) with broadcast fertilization. The mechanism was closely examined in terms of sperm motility， energetics， intracellular Ca²⁺ homeostasis and oxidative stress. The concentration range of existing environmental nTiO₂ was obtained from previous reports and T. granosa sperm was exposed to four TiO₂ treatments for two hours : a control group， a bulk TiO₂ group at1 ， and two nano TiO₂ groups at 10μg/LnTiO₂ and 100μg/L nTiO₂ . The high nTiO₂ exposure significantly (P<0.05) ）reduced the fertilization rate of T. granosa， by 20.94% compared to the control group， but the low nTiO₂ and bulk TiO₂ exposures did not significantly affect the fertilization rate. After exposure to 10μg/L and 100μg/L of nTiO₂ ， the curvilinear velocity (VCL) and the straight line velocity (VSL) of T. Granosa sperm both significantly decreased: the VCL by 16.03% and 29.04% and the VSL by 20.21% and 63.99% ，but the effects were not significant in the bulk TiO₂ treatment group. While the high nTiO₂ exposure significantly (P<0.05) decreased the average path velocity (VAP) of T. Granosa sperms by 31.75% ， and the low nTiO₂ and bulk TiO₂ treatment had no obvious effect on the VAP. Thus， high concentration of nTiO₂ significantly impaired sperm swimming speed. Moreover， nTiO₂ exposure significantly inhibited the activities of pyruvate kinase (PK)， phosphofructokinase (PFK)， and Ca²⁺ -ATPase in the sperm，which decreased levels of ATP and Ca²⁺ . Results also show that nTiO₂ exposure markedly increased the levels of reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA). In conclusion， our results indicate that nTiO₂ can impair the sperm motility and fertilization of T. granosa by limiting energy supply， interfering with intracellular Ca²⁺ regulation， and inducing oxidative stress.

Key words: nano titanium dioxide (nTiO₂) ); Tegillarca granosa; fertilization; sperm motility