槐米制備槲皮素及其與粘桿菌素聯用對沙門氏菌的作用

中圖分類號：S567 文獻標志碼：A 文章編號：1008-0864（2025）06-0136-12

PreparationofQuercetin from Sophora japonica and ItsEffect Together with Colistin on Salmonella spp.

XIONG Xiaoyan，TIAN Dandan，GONG Yuxin， QIAO Yu，XU Xiaoqing， HE Mengxin，SHI Bo，PENG Qing （Feed Reasearch Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 1Ooo81，China）

Abstract：Quercetinisaflavonoid compoundwithvarious biological activities，mostly existing inthe formof glycosides in plants.Sophora japonicais an idealraw material for preparingquercetin，with advantagessuch as wide plantingarea andlow price.Thisstudy investigated the synergistic antibacterial effects ofquercetin against Salmonella spp.thatcombined with colistin.Thequercetin wasprepared fromthe Sophora japonica buds Aspergilus niger fermentation and isolated from thesemi-solid fermentation productsusing ultrasonic extraction methods， purified and structurallyidentified using HPLC，ESI-MSandNMRmethods.Theantibacterialactivitiesofquercetin andcolistin，both individuallyandincombination，against Salmonella were evaluatedusing dilutionand checkerboard methods.The results showed that the highest product of quercetin was 73.7 mg. g^-1 after fermentation for 96h and the purity reached to 98 % afterpurificationand identification.After evaluation of antibacterialactivity，the minimum inhibitoryconcentrations（MICs）of colistin against S.typhimurium，S.pullrum 1789 and 520 were 2，8， and 4μg?mL^-1 ，respectively，while the MICs of quercetin against the mentioned strains were all above 500μg?mL^-1 When quercetin wasused together with colistin，the synergistic antibacterial effects were observed against above

Salmonella strains，particularly against S.pullrum1789and 52O，with fractional inhibitoryconcentration index （FICI）valuesbelow O.5，and the MIC value of colistin were reduced to 1μg?mL^-1 . The study demonstrated the synergisticinhibitoryefectofquercetinpreparedfrom Sophorajaponica throughA.nigerfermentationcombinedwith colistinagainst Salmonella，providing ascientific basis fordeveloping newantibacterialcombination strategies. KeyWords：quercetin； Sophora japonica；Aspergillus niger；Salmonella；colistin；synergistic inhibition

槲皮素（quercetin）是一種多功能的植物黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗病毒和抗菌等功效。槲皮素存在于水果和蔬菜中，如洋蔥、蘋果、葡萄、銀杏、茶葉等，但含量相對較低，從植物中直接提取槲皮素難度較大。目前，槲皮素的獲取方法主要是先從植物中提取槲皮素糖昔類前體物質，如蘆丁（rutin，槲皮素-3-蕓香糖苷），再經過水解轉化為槲皮素[3]。

槐米（Sophorajaponica）為豆科植物槐（FlosSophoraeimmaturusL.）未開放的干燥花蕾4，具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗癌和心臟保護活性5。槐米中含有多種生物活性物質，包括酚酸、多糖、三萜皂苷、甾醇、單寧、精油和脂肪酸。黃酮類化合物是其主要的生物活性物質之一，其中，蘆丁的含量在 5.53%～37.80% ，明顯高于其他植物[，是制備槲皮素的理想原料。傳統制備方法主要使用有機溶劑和無機酸將槐米中的蘆丁轉化為槲皮素，或是通過添加糖苷酶來降解蘆丁9。然而，這些方法存在一些缺陷，如長時間高溫加熱目標化合物會造成熱降解，以及有害有機溶劑的大量使用對人類健康和環境存在潛在影響[10]

利用微生物發酵獲得槲皮素是一種有效而環保的途徑，它主要依靠能夠產生 β -O-糖苷酶的微生物分解蘆丁，包括黑曲霉（Aspergillusniger）{1l-1]、灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus ）3]、泡盛曲霉（A.awamori）[4]、嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）[s]粉狀青霉（Penicillium farinosum）[6]等。其中，黑曲霉被美國食品藥品監督管理局（FoodandDrugAdministration，FDA）認定為“一般認為是安全\"（generally recognized as safe，GRAS）的菌株，允許在食品工業中使用[17]。而且，黑曲霉生長快速、產酶能力高，不僅能高效分解蘆丁中的糖苷鍵，還能分解植物原料中的纖維素、果膠和木質素等，從而提高槲皮素的釋放效率，降低能耗并提升產量。這些優勢使得黑曲霉成為具有重要工業潛力的槲皮素生產菌株。

雞白痢沙門氏菌（Salmonellapullorum）是一種對幼雞致病率和致死率極高的病原菌，嚴重影響養禽業，并對人類食品供應鏈的安全造成直接威脅[18]。長期和不合理使用抗生素已導致原本有效的藥物出現敏感性降低和多重耐藥現象，使得治療選項變得有限[19]。粘桿菌素是治療革蘭氏陰性細菌感染的關鍵藥物，被視為“最后一道防線\"[20]。盡管雞白痢沙門氏菌目前對粘桿菌素仍保持敏感性，但已出現對該藥物敏感性下降和耐藥性趨勢的跡象[21]。

為有效解決抗生素耐藥性問題，抗生素與植物源天然產物聯用對于抑制細菌生長和繁殖具有非常明顯的效果[22；與抗生素相互聯合相比，植物源天然產物作為抗生物佐劑能更有效地減少抗生素的使用量和副作用，延緩耐藥性的發展23]，新型抗菌劑[24]、制備疫苗[25]、改善養殖條件2降低感染風險，特別是減少對粘桿菌素的依賴。粘桿菌素與槲皮素的聯合抑菌作用已在大腸桿菌、肺炎克雷伯菌27和鮑曼不動桿菌2中得以證實。粘桿菌素和槲皮素都對沙門氏菌有一定的抑制作用，但由于槲皮素價格貴，粘桿菌素易產生耐藥性，降低兩種物質使用是非常有必要的，但其對沙門氏菌的作用尚待明確。因此，本研究擬通過黑曲霉半固體發酵技術將槐米中的蘆丁轉化為槲皮素，進而探討其與粘桿菌素聯用對沙門氏菌的聯合抑菌效果，旨在開辟槐米資源高值化利用的新途徑，深化槲皮素抗菌功效研究，并為應對食品安全領域抗生素耐藥性問題提供理論支持。

1材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

黑曲霉（CGMCC3.4309）菌株來自中國通用微生物菌種保藏管理中心（ChinaGeneralMicrobiologicalCulture Collection Center，CGMCC）。鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium，CICC22956來自中國工業微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）。雞白痢沙門氏菌（Salmonellapullorum）菌株1789（CVCC1789））和520（CVCC520）均來自國家獸醫微生物菌（毒）種保藏中心（ChinaVeterinaryCulture CollectionCenter，CVCC）。

槐米購自安國市御顏坊中藥材有限公司，蘆丁標準品（ 98% 購自上海麥克林生化科技有限公司，槲皮素標準品（ 98% ）購自美國Sigma-Aldrich公司，硫酸粘桿菌素 ?≥19000U?mg^-1 購自綠康生化股份有限公司。無水乙醇（分析純，Analyticalreagent，AR）和無水 MgSO₄ （AR）購自福晨（天津）化學試劑有限公司；乙腈和甲醇均為色譜純，購自美國FisherScientific公司；二甲亞砜DMSO（AR;純度 ?99.9% ）、葡萄糖（生物試劑，biological reagent，BR） ，K₂HPO₄ （AR）和瓊脂粉購自北京市索萊寶科技有限公司；磷酸（AR）購自天津市大茂化學試劑廠。Mueller-HintonBroth（MHB）培養基和馬鈴薯浸出粉（BR）購自北京奧博星生物科技有限責任公司。 MgSO₄?7H₂O（A R）購自北京雙環化學試劑廠， KH₂PO₄ （AR）購自西隴科學股份有限公司，NaNO₃ （AR）和KCI（AR）購自國藥集團化學試劑有限公司， FeSO₄ （AR）購自天津市北辰驊躍化學試劑廠。96孔細胞培養板3599購自康寧生命科學（吳江）有限公司。 0.22μm 尼龍濾膜購自天津市津騰實驗設備有限公司。

1.2主要設備與儀器

ZXSD-B1160恒溫培養箱，上海智城分析儀器制造有限公司；MQD-S2R恒溫振蕩培養箱，上海旻泉儀器有限公司；Waters2695高相液相色譜系統及Waters2996紫外檢測器，美國Waters公司；SYNERGYH1酶標儀，美國BiOTeK公司；KQ520DE超聲波處理器，昆山市超聲儀器有限公司；ER-3000A旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；ThermoQExactivePlusMHF組合型四極桿Orbitrap高分辨質譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；Avance-500核磁共振波譜儀，德國Bruker公司；PF4250高壓制備色譜儀，法國Interchim公司。

1.3 培養基

PDA培養基 （1L） ：馬鈴薯浸粉 3g，KH₂PO₄ 3g 、葡萄糖 20g，MgSO₄?7H₂O1.5g 瓊脂粉 20g 115^°C 高壓滅菌 30min 。

種子液培養基（1L）：葡萄糖 60g 蛋白脈20g?NaNO₃10g?MgSO₄?7H₂O5g?KH₂PO₄1.0g 115^°C 高壓滅菌 30min 。

半固體發酵培養基（1L）：槐米 100g NaNO₃ 3g_?K₂HPO₄ 1g_?MgSO₄ 0.5g_?KCl 0.5g_? 號 FeSO₄1g，115^°C 高壓滅菌 30min 。

1.4 方法

1.4.1黑曲霉種子液的制備參照孫紅2的方法制備黑曲霉種子液：將黑曲霉從凍干管中取出，接種至PDA斜面培養基，于 30°C 培養7d直至菌苔覆蓋斜面;加入 5mL 無菌水并用無菌刮鏟輕刮菌體，吸出菌體混懸液，再次加入 5mL 無菌水確保徹底刮取菌體；將2次得到的懸濁液合并，制得 10mL 菌種懸濁液；將此懸濁液接種至含 100mL 種子液培養基的 500mL 三角瓶中， 振蕩培養 48h ，最終獲得種子液。

1.4.2黑曲霉半固體發酵槐米槐米使用超高速粉碎機粉碎，并用40目篩過篩，用作黑曲霉半固體發酵的唯一碳源。將 5mL 黑曲霉種子液接種至含有 100mL 半固體發酵培養基的 500mL 三角瓶中，30^°C，180r?min^-1 的條件下進行發酵。為確定蘆丁轉化為槲皮素的最佳時間，每 12h 取樣并檢測樣品中的槲皮素含量。

1.4.3蘆丁和槲皮素的定量測定及標準曲線的建立使用Waters2695高效液相色譜儀和Waters2996紫外檢測器，搭配AmethystC18-H色譜柱進行檢測。流動相由乙腈和 0.02% （體積分數）磷酸水溶液以 20：80 比例混合，流速設為 1.0mL?min^-1 柱溫維持在 35^°C ，檢測波長為 360nm 。每次進樣量為 10.0μL ，檢測 60min 。

精確稱取蘆丁和槲皮素標準品，用二甲基亞砜（dimethylsurfoxide，DMSO）溶解。將蘆丁和槲皮素稀釋12個梯度，按照上述色譜條件進行定量分析。

1.4.4槲皮素發酵的最佳收獲時間及含量測定采集的發酵樣品經冷凍干燥后，用DMSO配置成20mg^*mL^-1 溶液，超聲萃取 30min 。然后，按照1.4.3的色譜條件，通過HPLC分析確定發酵過程中槲皮素的最佳收獲時間及含量。

1.4.5槲皮素的提取與純化將發酵96h后的產物以5倍重量的去離子水進行清洗，混合均勻后以4000r?min^-1 的速度離心 40min 棄上清，重復5次，以徹底去除水溶性成分。加入沉淀5倍重量的無水乙醇對沉淀超聲提取 30min，4000r?min^-1 離心40min ，重復3次并合并提取液。提取液在 50°C 、90r?min^-1 條件下經旋轉蒸發儀進行濃縮，再利用冷凍干燥機將濃縮的提取液凍干，得到粗提物。

上述粗提物用甲醇制成 5mg?mL^-1 溶液，通過PuriFlash4250色譜系統和YMCODS-AQ色譜柱純化。流動相A為 0.1% 甲酸水溶液，B為甲醇，A從 100% 至 20% ，B從0至 80% 梯度洗脫， 180min 內，流速 5mL?min^-1 ，室溫，檢測波長 360nm ，進樣量 1mL 。收集保留時間為 內的組分，經減壓濃縮和冷凍干燥后得槲皮素純化樣品。

按照1.4.3節方法計算槲皮素樣品的含量，并確定槲皮素的含量、回收率和純度。

1.4.6槲皮素的ESI-MS鑒定精確稱取 10.0mg 純化后的槲皮素樣品，溶于無水乙醇制備成100.0μg?mL^-1 溶液，經 0.22μm 有機相濾膜過濾，使用電噴霧質譜（electrosprayionization-massspectrometry，ESI-MS）進行分析。質譜參數為：正離子模式，噴霧電壓 3.0kV ，毛細管溫度 320^°C ，噴霧器溫度 350°C ，鞘氣和輔助氣壓力分別為40和10unit 使用氮氣作為噴霧氣和碰撞氣，掃描質荷比 （m/z） 范圍100＼～1500，全掃描分辨率為 120000 門1.4.7槲皮素的NMR鑒定精確稱取 10.0mg 純化后的槲皮素樣品，用 0.5mL 氘代二甲基亞砜（DMSO-d6）進行3次溶解處理，使用BrukerAvance-500核磁共振波譜儀對其進行氫譜（ ¹H NMR）和碳譜（ ¹³C NMR）分析，采用四甲基硅烷（tetramethylsilane，TMS）作為內部標準。氫譜和碳譜的工作頻率分別為500和 125MHz 。化學位移以ppm（partspermillion）為單位表示，反映了信號相對于參考信號的偏移程度。

1.4.8最小抑菌濃度的測定將雞白痢沙門氏菌1789、雞白痢沙門氏菌520以及鼠傷寒沙門氏菌分別進行平板劃線培養。分別挑取單菌落接種至MHB培養基中，在 37‰ 條件下震蕩培養，直至 0D₆₀₀ 達到0.5，相當于菌落數約 1×10⁶ CFU·mL^-1 ，備用。

用DMSO溶解純化后的槲皮素樣品制成50mg?mL^-1 的母液，用超純水溶解粘桿菌素制成1 024μg?mL^-1 的母液。

最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）測定過程中，槲皮素和粘桿菌素的母液分別使用MHB培養基稀釋12個梯度，使其在每孔的終質量濃度范圍分別為 0.244～500 和0.125＼～256μg?mL^-1 。在添加了槲皮素的孔中，需確保每孔中的DMSO不高于 1% （體積分數）。以 1% （體積分數）接種量接種上述3種沙門氏菌菌懸液，在 37^°C 下將96孔板振蕩孵育 18h 后，使用酶標儀在600nm 波長處測定吸光度（ Δ0D₆₀₀ ）。記錄吸光度變化小于0.05的最低濃度為MIC。

1.4.9槲皮素和粘桿菌素聯合抑菌效果評價通過棋盤格法評估槲皮素與粘桿菌素聯合對沙門氏菌抑制效果。對槲皮素和粘桿菌素母液分別進行梯度倍比稀釋，使其在每孔的終濃度范圍分別為1.9＼～250.0和 0.1～16.0μg^?mL^-1 。在添加了槲皮素的孔中，需確保每孔中的DMSO不高于 1% 。將3種沙門氏菌菌懸液以 1% 接種量接種到相應孔中評價抑菌效果，設定不含菌的MHB培養基孔為陰性對照，含MHB培養基和菌懸液的孔為陽性對照。在 37^°C 下將96孔板孵育 18h ，每 30min 使用酶標儀在 600nm 波長下測定吸光度以繪制生長曲線。以吸光度變化小于0.05的最低濃度確定為MIC，通過分數抑菌濃度指數（fractional inhibitoryconcentrationindex，FICI評估聯合抑菌效果。

當FICI 時，表明存在協同作用，且FICI值越小，表示協同作用越顯著；若 0.52 時，表明2種藥物之間產生了拮抗作用。

2 結果與分析

2.1蘆丁和槲皮素標準曲線分析

通過分析蘆丁和槲皮素的標準品確定了保留時間，分別為7.399和 47.883min （圖1A）。利用蘆丁和槲皮素的系列濃度標準溶液分別建立了標準曲線。如圖1B所示，蘆丁在 1.6～ 3200.0μg?mL^-1 內展現出了良好的線性響應，線性回歸系數 （R²） 為0.9964。如圖1C所示，槲皮素在 1.0～2000.0μg^?mL^-1 內同樣展現出了良好的線性關系， R² 為 0.9999 。

A：蘆丁和槲皮素混合標準品的HPLC譜圖;B：蘆丁的標準曲線;C：槲皮素的標準曲線

A：HPLCcromatogamofthiedstandardsofrutinndquercetin；BQuantiativestandardurveofruti；C：Quantitativestandadcure of quercetin

2.2 槐米發酵過程中蘆丁和槲皮素含量分析

HPLC分析表明，蘆丁和槲皮素標準品的保留時間分別為7.399和 47.883min （圖2A）。未發酵的槐米樣品中天然含有蘆丁和槲皮素，其含量分別為121.6和 12.0mg^.g^-1 。如圖2B所示，在發酵過程中，蘆丁含量持續下降，而槲皮素含量先增加后減少，尤其在發酵 96h 時，槲皮素含量達到最高73.7mg?g^-1 ，此時幾乎檢測不出蘆丁。延長發酵至144h ，槲皮素含量降至 2.3mg^.g^-1 。槲皮素的積累隨時間變化呈現先增加后減少的趨勢，發酵 96h 達到峰值。在 0～96h 的發酵過程中，蘆丁從199.83降至 0μmol?g^-1 ，槲皮素則從39.70增至242.52μmol?g^-1 ，增幅為 202.82μmol?g^-1 ，表明黑曲霉發酵過程可使蘆丁完全轉化為槲皮素。

2.3發酵槐米提取物中槲皮素結構分析

2.3.1槲皮素分離純化分析發酵槐米提取物中槲皮素分離純化結果如表1所示，每 100mL 的半固體發酵培養基添加 10g 槐米粉， 96h 的發酵使槐米粉中槲皮素含量升至 73.7mg^?g^-1 。從 30g 槐米粉發酵獲得的 300mL 發酵產物經水洗后，得到 31.3g 沉淀，沉淀經乙醇萃取和冷凍干燥處理后獲得5.5g 粗提物，即每 10g 槐米粉中可提取得 1.83g 粗提物。HPLC分析顯示，粗提物槲皮素含量為321.5mg^?g^-1 ，粗提步驟的槲皮素回收率達 80.0% 。將粗提物配制為 5mg?mL^-1 溶液，經色譜純化最終得到 3.05mg^*g^-1 槲皮素樣品。該槲皮素樣品的純度通過HPLC檢測為 98% （圖3）。

2.3.2槲皮素ESI-MS分析利用ESI-MS對純化后的槲皮素樣品進行檢測，質譜分析在正離子模式下揭示了2個顯著的分子離子峰， m/z 分別位于325.02和303.04（圖4）。這2個峰分別代表槲皮素分子 （MW=302 結合1個鈉離子（ ΔNa⁺ MW=23 ）和1個氫離子 ），證實了從槐米發酵物中純化的槲皮素樣品與槲皮素標準品的相對分子量一致。

2.3.3槲皮素NMR結構分析除了確認相對分子量，利用NMR對純化產物進行了進一步的結構鑒定。NMR譜圖（圖5）顯示， ¹H NMR中的化學位移 （812.52、810.81、89.58 和 89.36ppm 揭示了槲皮素芳香族氫原子的存在，而 87.68、87.55、86.90、 86.41和 的位移對應其酚羥基氫原子。¹³C NMR中， 8176.62ppm 的位移確認了羰基碳，893.92至 164.53ppm 的位移指向芳香族碳。該化合物的"¹H NMR和"¹³C NMR信息和槲皮素標準品的NMR相吻合。由此表明，本實驗分離純化所得產物為槲皮素。

A：槲皮素標準品；B：分離純化后的槲皮素樣品

A：Standard quercetin；B：Purified quercetin

2.4槲皮素與粘桿菌素單獨使用對沙門氏菌的抑制作用

單獨使用粘桿菌素抑制沙門氏菌結果（表2）MIC降低由 2μg?mL-1"降低顯示，粘桿菌素對3種沙門氏菌（鼠傷寒沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌1789和雞白痢沙門氏菌520）的最小抑菌濃度（MIC）分別為2、8和 4μg?mL^-1 號依據臨床和實驗室標準化協會（CLSI）的標準，MIC≥4μg?mL^-1 表示耐藥性，這意味著雞白痢沙門氏菌1789和雞白痢沙門氏菌520已經對粘桿菌素產生了耐藥性。另一方面，槲皮素在高達500μg?mL^-1 時對上述3種沙門氏菌均未表現出抑制效果，推斷其MIC值應大于 500μg?mL^-1 ，說明單獨使用槲皮素對上述沙門氏菌無抑制效果。

2.5 槲皮素與粘桿菌素聯合使用對沙門氏菌的抑制作用

本研究評估了槲皮素與粘桿菌素聯合使用對沙門氏菌的抑制效果，如圖6和表3所示。250μg?mL^-1 槲皮素與 1μg?mL^-1 粘桿菌素組合完全抑制了鼠傷寒沙門氏菌的生長，將粘桿菌素的MIC降低由 2μg?mL^-1 降低為 1μg?mL^-1 （圖6A）。125μg?mL^-1 槲皮素配合 1μg?mL^-1 粘桿菌素完全抑制了雞白痢沙門氏菌1789的生長，將粘桿菌素的MIC由 8μg?mL^-1 降至 1μg?mL^-1 （圖6B）。62.5μg?mL^-1 槲皮素與 1μg?mL^-1 粘桿菌素組合則完全抑制了雞白痢沙門氏菌520的生長，將粘桿菌素的MIC由 4μg?mL^-1 降至 1μg?mL^-1 （圖6C）。

槲皮素與粘桿菌素聯合使用的分數抑制濃度指數（FICI）如表3所示，槲皮素與粘桿菌素聯合使用對鼠傷寒沙門氏菌的FICI值為1，顯示出相加效果；同樣，對于雞白痢沙門氏菌1789和雞白痢沙門氏菌520的FICI值均為0.375，表明協同效應顯著。上述結果顯示，槲皮素與粘桿菌素的聯合使用不僅顯示出協同抑制效果，還顯著降低了粘桿菌素的用量，證明該組合有助于減緩沙門氏菌對于粘桿菌素耐藥性的發展。

3討論

近年來，槲皮素作為一種具備多種生理活性的天然化合物受到廣泛關注，已有眾多研究探討通過微生物將蘆丁轉化為槲皮素的過程。徐萌萌等[30按菌絲體接種量 20% ，最優發酵條件進行槐米固態發酵，經HPLC檢測槐米中的蘆丁在發酵38.5h 能轉化 98.3% 。孫紅使用黑曲霉固態發酵槐米后，7d為最佳發酵時間，槲皮素產量為40mg?g^-1 。本研究采用半固體發酵槐米， 96h（4d） （204號獲得的槲皮素含量高達 73.7mg?g^-1 。造成發酵時間和槲皮素產量不同的原因可能是黑曲霉菌株的差異和槐米來源不同以及不同發酵方式。相較于固態發酵，半固體發酵可以避免固態發酵所帶來的微生物種類選擇少、發酵效率較低、周期長等缺點。本研究中黑曲霉發酵能夠實現槐米中的蘆丁完全轉化為槲皮素，意味著通過增加底物中的槐米/蘆丁含量，有可能進一步提升槲皮素的產出。上述研究揭示了微生物真菌種類、槐米來源、發酵條件以及時間對于蘆丁向槲皮素轉化效率和產量的顯著影響，本研究還能為槐米資源的高值化利用開辟新途徑。此外，本研究還發現，槲皮素含量在 96h 后達到峰值，隨著發酵時間延長槲皮素含量逐漸下降，推測可能是過長的發酵時間導致發酵體系中的營養消耗殆盡，黑曲霉可能分泌出一些降解酶類利用槲皮素進行生長繁殖，有關這方面的具體原因還需要進一步的研究。

抗生素濫用導致了多重耐藥菌株的產生，粘桿菌素成為對抗多重耐藥革蘭氏陰性菌感染的最終治療選擇之一[20]。然而，粘桿菌素的使用受其潛在腎毒性和神經毒性限制[31]，高劑量還可能誘導其耐藥基因MCR-1的表達3，削弱治療效果。特別是在家禽養殖中，粘桿菌素的耐藥性問題尤為嚴重2。在本研究中，2株雞白痢沙門氏菌對粘桿菌素的 MIC≥4μg?mL^-1 ，證明了導致家禽染病的部分沙門氏菌已產生耐藥性。因此，開發新策略以降低粘桿菌素用量、減輕毒性、延緩耐藥性發展并增強其抑菌效果變得尤為迫切。現有研究顯示，槲皮素對家禽安全，具有低或無細胞毒性的特性[33]。在本研究中，即使槲皮素的劑量高達 500μg?mL^-1 ，也未能抑制3種沙門氏菌的生長，進一步證明了槲皮素的低毒性。

盡管槲皮素單獨使用對于細胞的毒性較低，已有眾多研究證明槲皮素與其他抗生素組合可增強對化膿性鏈球菌[34]、大腸桿菌[27]、銅綠假單胞菌[5和肺炎克雷伯菌2的治療效果。本研究首次將槲皮素與粘桿菌素聯用并對沙門氏菌的抑制效果進行評估。結果顯示，槲皮素與粘桿菌素的組合對3種沙門氏菌均表現出聯合抗菌效果，尤其對耐藥雞白痢沙門氏菌1789和520表現出顯著的協同作用，其分數抑制濃度指數（FICI）均低于0.5，并且粘桿菌素的MIC值在聯用后對這兩種菌株分別降低了8倍和4倍，使其降為 1μg?mL^-1 。粘桿菌素對腸桿菌目、銅綠假單胞菌以及鮑曼不動桿菌的藥敏臨床折點參考EUCAST和USCAST的現行折點 （S?2mg?L^-1 3，本研究中的 MIC=1μg?mL^-1 ，使這2株耐藥雞白痢沙門氏菌對粘桿菌素恢復敏感，從而推測能夠恢復臨床治療的效果。本研究有力證明了槲皮素與粘桿菌素協同作用能有效抑制耐藥雞白痢沙門氏菌的增殖，該治療策略有望延緩家禽養殖業中雞白痢沙門氏菌對粘桿菌素耐藥性的發展，為未來食品安全的保障提供了新思路。

盡管本研究中槲皮素與粘桿菌素聯用對雞白痢沙門氏菌展現出良好的抑菌效果，但其確切的協同機制仍不明確。Langeveld等[強調了一些植物提取物與抗生素之間可能產生協同抑菌效果，并指出這種協同作用會使病原菌細胞結構發生變化。此外，Vipin等35研究表明，當2種藥物分子具有不同的作用機制時，它們可能會產生協同作用。例如，槲皮素與阿米卡星、妥布霉素等抗生素聯合使用時，槲皮素作為群體感應抑制劑控制細菌密度，而阿米卡星和妥布霉素等抗生素則發揮細胞殺傷作用。在本研究中，槲皮素可能同樣起到上述效果，作為群體感應抑制劑控制細菌密度，而粘桿菌素的作用機制則是與革蘭氏陰性菌細胞膜上的脂多糖脂質A相互作用，從而破壞革蘭氏陰性菌外膜的完整性來殺死細菌38，兩者的不同作用機制可能協同增強了抑菌效果。槲皮素與粘桿菌素的具體協同作用機制，特別是在對抗耐藥雞白痢沙門氏菌方面的機制，還有待在今后的工作中進一步深入挖掘和探討。

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