金果欖UPLC指紋圖譜及多指標含量測定研究

中圖分類號：TB9；O657.72；R284.1 文獻標志碼：A文章編號：1674-5124（2025）06-0106-08

Study on UPLC fingerprint and multi-index content determination of Tinosporae Radix

YANG Ruil，HU Yingying2， ZHANG Chi2，WU Jianguo2， ZHU Yaning1，2 （1. College of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China; 2.Yaan Sanjiu Pharmaceutical Co.，Ltd.， Yaan 625ooo， China）

Abstract： The ultra-high performance liquid chromatography （UPLC） fingerprint of Tinosporae Radix was established， and the contents and extractsof columbin， palmatine， jatrorrhizine， columbamine， hydroxyecdysone and magnoflorine were determined at the same time， and analyzed by chemical pattern recognition. A Prodgy3M ODS-3 column 2.0m×150mm ， 3μm） ）wasused with acetonitrile （A）- .0.2% （204 phosphoric acid （B） as mobile phase，gradient elution， flow rate 0.4mL/min ， column temperature 30°C 0 injection volume 1μL ，detection wavelength 237nm and 344nm .The results showed that the fingerprint similarity of 18 batches of Tinosporae Radix from diferent sources was greater than or equal to 0.928 except that of J15 batch was O.739.A total of 21 common peaks were calibrated，and six peaks of columbin， palmatine，jatrorrhizine，columbamine，hydroxyecdysone and magnoflorine were identified.The determination results were between 10.746-23.113mg/g 0.067-0.794mg/g 。 0.042?0.391mg/g 0.008-0.207mg/g 1.129-

3.586mg/g and 0.172-0.801mg/g . The samples were roughly divided into three groups based on the extract contents.The method is simple，stable and reliable，and can provide reference for the comprehensive evaluation of the quality of Tinosporae Radix.

Keywords： Tinosporae Radix; fingerprint; multi-index components; content determination; chemometrics

0 引言

中藥金果欖為防己科植物青牛膽Tinosporasagittata（Oliv.）Gagnep或金果欖TinosporacapillipesGagnep的干燥塊根，性寒味苦，有清熱解毒，利咽止痛之功效；可用于咽喉腫痛、癰疽療毒、泄瀉、痢疾以及皖腹疼痛的治療[1]。金果欖中含有生物堿、萜類和甾體類等多種成分，有鎮痛2、抗炎、抑菌[3]、降血糖[4-7]、抗腫瘤[8-9]、抗氧化[10]等功效，具有開發新型藥物的潛質。2020版《中國藥典》金果欖項下以古倫賓為含量測定項，較為單一。隨著中藥質量控制要求的提高以及通過臨床實踐表明，單一成分的含量測定并不能全面科學地評價藥材質量。建立多指標含量測定方法，并結合指紋圖譜和化學計量學進行系統分析，可以更系統地評價中藥藥材品質，更客觀全面地評價藥材質量[11]。現有的金果欖含量測定方法多集中在古倫賓、藥根堿、巴馬汀等單一或兩個成分的測定上[12-13]，關于金果欖指紋圖譜及多指標含量測定方法還較少，或是使用質譜，成本較高[14-15]，或是色譜信息不夠豐富[16]，因此建立一個操作簡便、色譜信息豐富的檢測方法對金果欖藥材的質量控制有一定的意義。

有研究表明，古倫賓、巴馬汀、藥根堿、非洲防己堿、木蘭花堿、 β -蛻皮甾酮是金果欖內含量較高且活性成分較好的成分[17-18]，可在一定程度上代表金果欖的質量。本實驗建立了同時測定這6種成分的UPLC方法，同時結合化學計量學進行了綜合分析，以期為其質量控制及建立質量標準提供實驗依據。

1材料

1.1儀器

Agilent1290InfinityII高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配備四元泵、柱溫箱、自動進樣器、DAD檢測器；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；XFB-500小型粉碎機（吉首市中湘制藥機械廠）；HH-S6電熱恒溫水浴鍋（北京科偉水興儀器有限公司）；MettlerToledoXA-205電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；MettlerToledoAL204S型十萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；純水機（四川優譜超純科技有限公司）。

1.2 藥材與試劑

金果欖樣品來自四川、云南2個產地，其中J1-J14為栽培基地采挖的新鮮塊根，J15-J18為購買的藥材或飲片，具體信息見表1，經華潤三九（雅安）藥業有限公司胡瑩瑩工程師鑒定為防己科植物青牛膽Tinospora sagittata（Oliv.） Gagnep的新鮮或干燥塊根。

對照品古倫賓（111837-201703， ?99.8% ）、鹽酸巴馬汀（110732-201913， ?85.7% ）、鹽酸藥根堿（110733-202110， ?90.3% ）、 β- 蛻皮甾酮（11638-201907， ?98.3% ）均購自中國食品藥品檢定研究院；非洲防已堿（21101107， ≥99.35% ）和木蘭花堿（21041602， ?99.09% 購自成都普菲德生物技術有限公司。甲醇（色譜純，德國默克公司）乙腈（色譜純，德國默克公司）、甲醇（分析純，成都科隆化學試劑有限公司）以及磷酸（色譜純，諾爾施科技有限責任公司）。

2 方法與結果

2.1樣品水分及浸出物測定

2.1.1 樣品準備

將新鮮藥材（J1-J14）清洗、晾干并去除須根，于 60^°C 烘干。其中J5、J11批次在烘干后表面呈現平整與皺縮兩種形態，編號分別為J5-1（皺縮）、J5-2（平整）、J11-1（皺縮）及J11-2（平整）。各批次用四分法取適量樣品，粉碎成能過3號篩粉末備用。

2.1.2水分及浸出物測定

稱取各批次金果欖粉末 2～3g. ，照水分測定法（2020版《中國藥典》通則0832）項下烘干法測定；精密稱取各批次樣品粉末約 2g. ，照醇溶性浸出物測定法（2020版《中國藥典》通則2201）項下熱浸法測定，測定值見表2。所有批次水分均符合藥典不得超過 13.0% 的規定；浸出物符合不得少于 7.0% 的規定，其中J6及J17浸出物超過 30% ，J5批次表面平整的明顯低于皺縮的。

2.2 色譜條件

采用Prodgy3M ODS-3色譜柱（ 2.0m×150mm ，3μm ），流動相為乙晴（A） .0.2% 磷酸（B），梯度洗脫（ 0～8min 10% （20 8～11min ， 18% （2號

A; 11～15min ， 20% （2 A21.5% A; 15～23min 21.5% A; ， 32%90% A）；流量0.4mL/min ；柱溫 30^c ;進樣量 1μL ；含量測定檢測波長為 237nm 及 344nm ，特征圖譜為 237nm ， UPLC圖見圖1。

A-藥材， 344nm ;B-混合對照品， 344nm ;C-藥材， 237nm ;D-混合對照品； 237nm 。

3.木蘭花堿；8.β-蛻皮甾酮；13.非洲防己堿；14.鹽酸藥根堿；16.鹽酸巴馬汀；21.古倫賓。

2.3 對照品溶液配制

分別精密稱取6種對照品適量，加甲醇配制成每 1mL 含古倫賓 0.5493mg ，鹽酸巴馬汀 0.0432mg 、鹽酸藥根堿 0.0515mg 、非洲防己堿 0.0301mg?β. 蛻皮甾酮 0.0534mg 、木蘭花堿 0.0526mg 的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液配制

取金果欖藥材粉末（過3號篩）約 0.5g ，精密稱定，精密加入 70% 甲醇 10mL ，稱定質量，超聲 30min 冷卻，補重，取續濾液即得。

2.5 指紋圖譜

2.5.1 精密度試驗

取同一批藥材粉末（J2），照\"2.4\"項下制備供試品溶液，按 項下色譜條件測定，連續進樣6次，記錄指紋圖譜。以21號峰（古倫賓）的保留時間和峰面積為參照，計算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，RSD值均小于 3% 。

2.5.2 穩定性試驗

取同一批藥材粉末（J2），照\"2.4\"項下制備供試品溶液，按 ^lt;lt;2.2^′ 項下色譜條件測定，分別在0、2、4、8、12、18、24、36h進樣，記錄指紋圖譜。以21號峰（古倫賓）的保留時間和峰面積為參照，計算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，RSD值均小于 3% 。

2.5.3 重復性試驗

取同一批次藥材（J2）粉末6份，按照 ^lt;2.4^gt; 項下方法制備供試品溶液，按照 項下色譜條件測定，記錄指紋圖譜，以21號峰（古倫賓）的保留時間和峰面積為參照，計算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，RSD值均小于 3% 。

2.5.4指紋圖譜建立及相似度評價

將金果欖樣品分別按照‘2.4\"項下方法制備供試品溶液，并按照 項下色譜條件進行分析。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》軟件分析。以J1為參照圖譜，采用中位數法，通過多點校正和全譜峰匹配，生成對照指紋圖譜，共標定21個共有峰，結合對照品的吸收曲線及保留時間對色譜峰進行指認，見圖1、圖2。將供試品色譜圖與對照指紋圖譜匹配，進行相似度評價，結果見表3。除J15批次相似度為0.739外，其余批次相似度均 ?0.928 ，說明建立的指紋圖譜能在一定程度上反映四川及云南兩地金果欖的化學成分特征，也表明來自不同來源的藥材化學成分類別具有一致性。J15的峰2、18面積較小，峰9、13（非洲防己堿）14（藥根堿）、16（巴馬汀）峰面積較大，可能是導致其相似度差異較大的原因。

2.6 多指標含量測定

2.6.1 線性關系考察

取 ^lt;2.3^： 項下混合對照品溶液進行梯度稀釋，每次精密移取 3mL 于 10mL 容量瓶中，甲醇稀釋至刻度直至得到6個濃度的混合對照品溶液，按照 項下色譜條件進行測定，進樣量 3μL 。以色譜峰峰面積為縱坐標 （Y） ，對照品進樣質量為橫坐標（X） ，繪制標準曲線，如表4所示。

2.6.2 精密度試驗

取 ^lt;lt;2.3^： 項下的混合對照品溶液，照2.2\"項下色譜條件測定，連續進樣6次，記錄峰面積值。計算古倫賓、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、非洲防己堿、 β 蛻皮甾酮及木蘭花堿峰面積RSD分別為 0.87% ）0.61%0.75%0.63%0.94% 以及 1.48% 。這表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩定性試驗

取同一批次金果欖藥材粉末，照 ^cc2.4^′ 項下制備供試品溶液，照 項下的色譜條件，分別在0、2、4、8、12、18、24、36h 測定，記錄峰面積。計算古倫賓、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、非洲防己堿、 β -蛻皮甾酮及木蘭花堿峰面積RSD分別為 0.85%，0.86% 0.88%，1.52%，0.97% 以及 0.79% 。這表明供試品溶液在室溫放置 36h 內穩定性良好。

2.6.4 重復性試驗

取同一批金果欖藥材粉末6份，按\"2.4\"項下方法制備供試品溶液，照 ^lt;2.2^gt; 項下色譜條件測定，記錄峰面積。計算古倫賓、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、非洲防己堿、 β -蛻皮甾酮及木蘭花堿峰面積RSD分別為 0.75% 0.58% 、 0.94% ： 0.86% ！ 0.80% 以及0.89% 。這表明本法穩定性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗

取已知含量的金果欖藥材粉末6份，分別加入古倫賓、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、非洲防己堿、 β 蛻皮甾酮及木蘭花堿對照品適量，照 ^cc2.4⁷ 項下方法制備供試品溶液，照 項下色譜條件測定，記錄峰面積。計算古倫賓、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、非洲防己堿、 β -蛻皮甾酮及木蘭花堿平均加樣回收率分別為 101.05% 、 97.22% 、 95.03% 、 96.57% 101.72% 、 95.65% ，RSD分別為 0.60% 、 1.64% 、0.93% 、 1.99% 、 1.79% 和 1.26% 。這表明本法的準確度良好。

2.6.6 含量測定

18批金果欖藥材（20個編號）按 ∴2.4^? 項下方法制備供試品溶液，按 ^lt;2.2^′ 項下色譜條件進行測定，平行3次，按干燥品計算各成分的質量分數，結果見表5。各批次藥材古倫賓含量最高， β -蛻皮甾酮次之，非洲防己堿含量最低。J5-1的含量明顯高于J5-2，J11-1略高于J11-2。

2.7 化學計量學分析

2.7.1 主成分分析

采用SPSS26.0對樣品的浸出物及含量測定結果進行主成分分析，KMO檢驗值為0.612，Bartlett's球形檢驗值為0.00，表明適合進行主成分分析。以λgt;1 為標準，提取出3個主成分，方差貢獻率分別為 41.315% 、 32.089% 和 15.835% ，積累方差貢獻率為 89.239% 。這說明這3個主成分可以代表浸出物及6個成分含量的絕大部分信息。因子載荷矩陣顯示（表6）藥根堿、巴馬汀在主成分1上載荷較高，古倫賓、浸出物在主成分2上載荷較高， β -蛻皮甾酮在主成分3上載荷較高，分別是主成分1、主成分2以及主成分3得分的重要影響因素。以提取的主成分的因子得分乘以相應主成分特征值的算術平方根，計算得到各樣品的主成分得分，見表5。

2.7.2 聚類分析

為了更準確地反映不同產地、生長年限、種植方式的金果欖的差異，以各樣品的主成分1、主成分2、主成分3的得分為指標（表5），在SPSS26.0軟件中以平方歐氏距離為測量區間，用瓦爾德法進行聚類分析，結果見圖3。結果顯示，當距離為21時，樣品可聚為3類，J1-J3、J5-2、J10、J11-2、J12、J14聚為一類，多為2＼～3年生藥材，有 β? -蛻皮甾酮含量稍高，其余成分及浸出物含量較低的特點；J4、J5-1、J6-J9、J11-1、J13、J16-J18聚為一類，多為4＼～5年生藥材，其古倫賓、巴馬汀、藥根堿、木蘭花堿及浸出物含量較高;J15單獨為一類，生長年限未知，其巴馬汀、藥根堿、非洲防己堿以及木蘭花堿含量較高，這與指紋圖譜相似度評價結果相同。其產地、種植方式則未出現明顯聚類趨勢，在生長年限上聚類也存在交叉，可能是受到氣候以及土壤等因素的影響。

3討論

3.1 色譜條件選擇

本實驗采用UPLC在 28min 內完成了金果欖主要色譜峰的良好分離以及6個成分的含量測定。在流動相的篩選過程中，考察了乙腈-磷酸水、甲醇-磷酸水、甲醇乙腈混合溶液-磷酸二氫鉀等不同流動相體系對金果欖藥材中成分的洗脫和分離效果。結果顯示，以乙腈 -0.2% 磷酸水溶液為流動相時各色譜峰出峰時間合適，且分離度較好。

采用DAD檢測器對6個成分進行全波長掃描波長為 237nm 時，古倫賓、 β -蛻皮甾酮以及木蘭花堿有較大吸收，且色譜信息豐富，分離度較好；波長為 344nm 時，鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿及非洲防己堿有最大吸收，分離度良好且無雜質峰干擾。

3.2供試品制備方法選擇

供試品溶液制備考察了提取方法（超聲、回流）提取溶劑（甲醇、 50% 甲醇、 70% 甲醇、乙醇、 50% 乙醇、甲醇-鹽酸 100：1， 甲醇-氨水 20：1 ）、料液比0 1：20，1：40，1：60，1：80，1：100） 、提取時間（30、60、90、 120min ）四個因素，根據含量結果及分離度等選擇提取時間 （20，30，40min ）、料液比（1：20、1：40、1：60） 、提取溶劑（ 50% 甲醇、 70% 甲醇、 50% 乙醇）進行正交實驗，最終確定供試品溶液的制備方法為料液比為 1：20，70% 甲醇為提取溶劑，超聲提取時間 30min 。

3.3指紋圖譜、含量測定結合化學模式識別分析

化學模式識別能夠有效地從實驗結果中提取數據信息，分析數據的差異性，從而解決復雜的化學問題。近年來，指紋圖譜、含量測定結合化學模式識別分析已廣泛應用在中藥及制劑質量控制上[19-21]。

本研究主要采集四川、云南種植規模較大或有野生資源分布區域的金果欖樣品，其指紋圖譜及含量結果顯示，除四川宜賓的樣品（J15）外相似度均大于0.92，說明這18批樣品的整體質量相對穩定;而J15的巴馬汀、藥根堿及非洲防己堿的含量遠高于其他批次，這可能是生長方式或生長年限引起的。不同形態的樣品部分表現出明顯的含量差異，含量較高的顏色相對較深，這可能與品種、氣候等因素有關，還需進一步的研究。模式識別分析顯示，18批樣品在產地、種植方式上無明顯的聚類趨勢，在生長年限上聚類較為明顯，其中4＼～5年的樣品含量普遍更高。這表明四川、云南兩產地無優劣之分，種植方式可根據成本等需求選擇，生長年限對質量的影響較大，栽培及采收過程中需注意控制。

4結束語

本研究建立了金果欖藥材指紋圖譜及多指標含量測定的UPLC方法，并結合化學模式識別法進行分析。結果表明四川及云南不同來源的金果欖樣品在化學成分類別上具有一致性，但生長年限、氣候及土壤等因素會引起藥材間的質量差異，藥材質量還需嚴格把控。建立的方法分析時間短、專屬性強、靈敏度高，重復性、穩定性及準確度良好；與藥典方法相比，古倫賓測定值一致；與單一或兩個含量測定方法相比[12-13，22-23]，測定指標更多，代表更全面;與現有多指標含量方法相比，本法不使用緩沖鹽[15，18]，對色譜柱損耗更小，采用UPLC進行測定，相比質譜更簡捷[14-15]，成本更低。與現有指紋圖譜方法相比，本法采集的色譜信息更為豐富[16，24]，可為金果欖藥材的質量差異性評價及質量控制提供方法基礎，也可為后續金果欖單味制劑或含金果欖制劑的開發及質量控制提供參考。

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（編輯：莫婕）