乳酸乳球菌NICE表達系統的應用研究進展

中圖分類號：Q93 文獻標識碼：A 文章編號：2096-3998（2025）03-0016-09

摘要：乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）作為一種食品級的安全菌株，是表達外源蛋白的優良宿主?；谌殒溇淖晕艺T導表達機制改造獲得的乳酸乳球菌NICE表達系統具有誘導效率高、自身分泌蛋白少、無胞外蛋白酶等特點，已被廣泛用于表達各類外源蛋白。通過設計不同的表達元件，實現外源蛋白在胞內、胞外或細胞表面錨定表達，從而發揮蛋白質作為抗原、抗菌肽或作為酶制劑的生物學功能。綜述了NICE表達系統的構建和誘導表達機制，總結了重組乳酸乳球菌在食品工業和黏膜疫苗等領域的研究現狀，為乳酸乳球菌NICE表達系統未來的應用方向提供參考。

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L.lactis）是一種公認的安全微生物，廣泛存在于自然界[1]。近年來對 L. lactis 的研究表明其生理、生化和遺傳背景等較為清楚，具有非致病性、易分離培養、分泌蛋白能力強等特性，并且 L ：lactis自身能分泌到細胞外的蛋白主要是Usp45，通過分子生物學工具對其進行特定的改造，使其成為異源蛋白表達和分泌的理想宿主，可以作為基因工程的模式菌[2-3]。研究表明改造后的 L. lactis具有組成型和誘導型兩類不同的表達方式，組成型表達不受外界因素影響可持續表達外源蛋白，誘導型表達系統由于其啟動子更易于控制而備受青睞。目前已開發出糖誘導表達系統[4] pH 誘導表達系統[5] ?Zn²⁺ 控制表達系統[6]等。目前乳鏈菌肽控制的（Nisin Controlled gene Expression，NICE）表達系統的應用較為廣泛，該系統基于天然的乳鏈菌肽（nisin）基因簇中自我誘導表達機制改造得到的，已有研究通過NICE系統表達酶、外源抗原、細胞因子等多種類型的外源蛋白[7-9]。本文主要針對NICE 表達系統在食品冷凍儲藏、食品發酵、生物降解以及粘膜疫苗開發等領域的研究與應用進行綜述，并對NICE表達系統在生產過程的挑戰提出應用展望。

1乳酸乳球菌NICE表達系統概述

乳鏈菌肽（nisin）是L.lactis產生的由34個氨基酸組成的一種短肽，最初發現其具有廣譜抑菌作用，并且對人安全無毒害，作為食品防腐劑在食品保鮮和貯藏領域應用廣泛[10]。nisin 的表達由11個基因調控（圖1），包括編碼nisin前體的nisA基因和調節nisin基因表達的nisK和nisR以及其他控制 nisin修飾、轉位、加工和對 nisin免疫的基因[11]。NisK 是一種存在于細胞膜上的組氨酸蛋白激酶，當成熟的nisin和NisK結合時會將NisK磷酸化并自動將磷酸基團轉移至反應調節因子NisR，激活的NisR可誘導nisin基因簇中3個啟動子中的2個轉錄： P_nisA 和 P_nisF ，而驅動NisK和NisR表達的啟動子不受影響。基于乳鏈菌肽自我誘導機制，通過基因工程手段將NisK和NisR基因插人到乳酸乳球菌亞種MG1363的染色體上，得到NZ9000菌株，將啟動子 P_nisA 克隆在質粒上，獲得pNZ8148質粒，將目的基因克隆在啟動子 P_nisA 下游，通過加入一定濃度的nisin來誘導該基因的表達[12]。而食品級 NZ3900/pNZ8149 表達系統則是以lacF基因為選擇標記，lacF缺陷型L.lactisNZ3900作為宿主，通過乳糖進行篩選。

表達外源蛋白時根據蛋白的不同功能和作用方式可構建不同的表達方式，基于外源蛋白表達位置的不同分為胞內表達、分泌表達和細胞表面錨定表達[13-14]。

（1）胞內表達外源蛋白是最基本的表達方式，研究人員通過重組L.lactis胞內表達幽門螺旋桿菌、3型鴨甲肝病毒、口蹄疫病毒等病原微生物的抗原蛋白開發粘膜疫苗，探究其免疫效果。張丹雨等[15]通過NICE系統表達了乙醛酸脫氫酶，與大腸桿菌表達系統相比，提高了可溶蛋白表達比例，且安全系數更高，但酶活力略低。雖然胞內表達的構建和檢測相較于分泌表達和表面錨定表達更簡單，然而這種表達方式還存在一定的局限性，表達的外源蛋白在細胞內會出現大量積存而增加被降解的概率，作用于機體時，目的蛋白必須等待細胞裂解才能釋放，對外源蛋白的作用效率存在影響。

（2）分泌表達是在胞內表達系統的基礎上對目的蛋白和分泌信號肽進行融合表達， SP_usp45 是 L .lactis的主要分泌蛋白[16]。成熟的目的蛋白和N端信號肽組成的前體蛋白在信號肽（SP）引導下，目的蛋白通過Sec轉運酶作用被跨膜轉運。作用機制如圖2所示。異源蛋白的分泌分為3個階段： ① 細胞質中的早期分泌步驟，包括前體的合成和靶向轉位機制； ② 前體蛋白通過SEC轉運子跨膜轉運以及信號肽切割； ③ 蛋白質質量的控制，包括過量合成或降解。分泌表達可以對宿主菌株進行連續培養，避免了胞內表達時產生的目的蛋白在胞內積存導致細胞代謝壓力過大等問題，提高了蛋白的產量并且簡化了純化步驟。目前已通過分泌表達系統表達出PlnF抗菌肽、細菌素Paracin1.7、雙肽細菌素Plantaricin EF等一些具有抗菌活性的蛋白，同時在醫藥衛生領域利用該系統獲得可用于疫苗佐劑開發的雞白細胞介素，以及食品行業中干酪生產過程所需用到的牛凝乳酶等多種外源蛋白。

（3）細胞表面錨定表達將L.lactis表達系統的應用提升到一個新的領域，外源蛋白通過共價附著在細胞膜或細胞壁上，或者通過非共價連接具有與細胞壁或細胞膜強烈相互作用的蛋白質結構域[17]。其中共價結合方式中所用的錨定結構域主要包括跨膜錨鉤、脂蛋白錨鉤、LPXTG錨鉤等，LysM錨定結構域屬于非共價結合，可以將融合蛋白結合到菌體表面。具有表面展示重組蛋白的L．lactis應用于許多生物技術中，展示蛋白質的 L ：lactis可以作為生物吸附劑、生物傳感器和口服疫苗等（圖3）。Plavec等[18]研究了常用的含有L.lactis賴氨酸基序（LysM）的表面錨定結構域，并篩選了15個L.lactis 或噬菌體起源的錨定結構域，證明了L.Lactis中不同蛋白錨定結構域的有效利用。

2乳酸乳球菌NICE表達系統的研究進展

NICE 表達系統操作簡單、誘導效率高并且嚴格可控，目前已構建重組L.lactis表達酶類、細胞因子、抗原等多種外源蛋白[19-21]。由于該表達系統具有食品級并且宿主菌在腸道具有優良的黏附特性，被廣泛應用于食品、飼料的生產，生物降解以及粘膜疫苗等領域[22]。

2.1在食品工業生產中的研究進展

甜味蛋白作為一種理想的糖類候選替代物，可以通過生物工程技術大量表達應用于酸奶制造替代糖或甜味劑的添加，以降低酸奶制造中原材料的使用。目前已通過大腸桿菌和畢赤酵母表達甜味蛋白Brazzein，但其產物的甜味和表達量不足以滿足生產需求。王長遠等[23]通過NICE表達系統構建了表面展示Brazzein的重組L.lactis，經純化后重組蛋白占總蛋白量的 94% 。蒲元浩等[24]將葡聚糖蔗糖酶DsrB與SP45分泌信號肽融合表達，葡聚糖產量為 10.54g/L 。張振葉[2]成功構建了三株表達纖維素酶的重組L.lactis，結果發現其中兩株的酶活力均高于組成型表達的陽性對照組。張艷麗等[25]利用NICE表達系統表達了具有優良凝乳特性的牛凝乳酶原，為奶酪的加工提供了新的思路。通過重組 L. （204號lactis表達抗凍蛋白在冷凍食品的加工和儲藏、細胞保藏、抗凍農作物的栽培等方面均有應用，已有研究在L.lactis 中表達抗凍蛋白處理冷凍肉[26-27]，發現可以降低冷凍肉中水分的流失和蛋白損失。張莉等[28]利用 L lactis表達抗凍蛋白SF-P進一步對 L ：lactis表達抗凍蛋白的誘導條件進行了探索，發現抗凍蛋白在L.lactis 中的表達有效降低了冷凍脅迫對細胞膜通透性的影響，為凍干粉的開發提供了新的技術方法。細菌素具有高效、無毒、無殘留、無抗藥性、耐酸、耐高溫等特點，作為天然防腐劑在食品工業方面具有很大的開發應用潛力，目前通過L.lactis 表達的細菌素多具有良好抑菌效果。酈萍等[31成功構建表達PlnE和PlnF的重組L.lactis發現該抑菌素不僅能抑制革蘭氏陽性菌，還能抑制革蘭氏陰性菌，同時PInEF具有協同效應。NICE表達系統在食品工業中的研究見表1。

2.2在粘膜疫苗領域的研究進展

近年來粘膜疫苗抗原傳遞系統成為傳染病防御領域的熱點，特別是活菌載體[33]。 L. lactis 因為其突出的安全性和黏附能力，在粘膜疫苗的開發中具有很好的應用前景。L.lactis可以長時間定植在腸道內，能有效將免疫原輸送到粘膜誘導部位，在腸道內長久存在并產生免疫應答[34-5]。此外，與傳統的注射療法相比，這種活菌載體的生產更為便捷并且可以大規模生產[36-37]。幽門螺旋桿菌（Helicobacterpylori，HP）已被列為致癌物，會引起胃炎、消化道潰瘍、淋巴增生性胃淋巴瘤等。趙翠等[38」利用 NICE表達系統融合表達了HP兩個候選抗原基因 lpp20 和cagA，利用動物實驗驗證了口服NZ3900-lpp20-ca- 對 HP攻毒后具有較強的免疫能力。沙門氏菌（Salmonella）是致人類食物中毒的主要病原菌，其中沙門氏菌鞭毛蛋白具有很強的免疫原性。范真瑋等[39將鞭毛蛋白FliC 和截短的錨定蛋白PgsA'利用L.lactisNZ9000融合表達于細胞表面并對小鼠進行口服免疫，錨定表達 PgsA^′ -FliC蛋白的重組L.lactis能顯著激發特異性抗FliC 粘膜 sIgA反應，這說明L.lactis載體疫苗可能成為抵抗沙門氏菌感染的有效方法?？漳c彎曲菌（Campylobacter jejuni）是引起人食源性腹瀉和腸道疾病的主要原因，Gorain等40]將在不同的彎曲菌中高度保守的定植蛋白 JIpA 利用NICE 表達系統進行表達，將表達后的重組菌株進行肉雞體內評價，結果發現灌胃重組L.lactis 顯著降低了C.jejuni在盲腸內的定植并顯著誘導雞粘膜 IgA免疫應答。這說明 L. lactis可作為抗C.jejuni定植的疫苗載體。為了開發一種針對戊型肝炎病毒（Hepati-tis E virus，HEV）特異性免疫反應的有效黏膜疫苗，Gao等[41|用NICE 表達系統對HEVORF2基因成功表達。通過體內試驗證實了使用重組 L. lactis免疫小鼠可以有效刺激腸道、氣管和泌尿生殖道的黏膜免疫應答，產生ORF2特異性IgA抗體，并產生更強的細胞免疫反應和顯著的脾淋巴細胞增殖。劉增琪等[42]構建了表達胸腺肽和雞 γ 干擾素融合蛋白的重組菌用于口服免疫 SPF雞，發現重組菌顯著提高了雞外周血單個核細胞的增殖活性等細胞免疫反應，且提高了雞盲腸中有益菌的豐度。NICE表達系統在粘膜疫苗領域的研究見表2。

2.3在醫療領域的研究進展

目前的研究表明，這些經過改造的重組L.lactis在機體中通常具有兩種作用效果，首先是通過表達外源蛋白發揮特定的功能，其次是這些安全的菌株對機體的健康具有間接的影響。張博等[50]利用NICE 系統構建了表達人癌轉移抑制因子KISS1的分泌表達系統，有效抑制了人結直腸癌細胞HT-29 的遷移，并在 L ，lactis 中表達來源于植物乳桿菌的CwaA，這顯著增加了其黏附特性，提高L.lactis在體內表達蛋白的時間，使功能蛋白的分泌量和投遞效果更具優勢。Lee等[5i利用L.lactis對分離自藥用蘑菇的免疫調節蛋白LZ8進行表達，并評價重組L.lactis在高膽固醇飲食的動脈粥樣硬化模型兔中的抗炎能力，結果表明，表達LZ8蛋白的重組L.lactis對高脂飲食兔非酒精性脂肪肝和動脈粥樣硬化的形成有良好的抗炎作用。張晶等[52」構建了表達苯丙胺酸脫氨酶（PAL）的重組L.lactis，高苯丙氨酸血癥模型大鼠口服后顯著降低了血液中苯丙氨酸濃度，有望成為治療苯丙酮尿癥的一種方法。劉東旭等[53]分別構建了表達豬 β -防御素和PR-39抗菌肽的重組L.lactis，并將其添加至仔豬基礎日糧，結果發現重組菌株對大腸桿菌、沙門菌均具有不同程度的抑制作用，同時顯著改善了仔豬的生長性能。

3 討論和展望

NICE 表達系統作為應用最廣泛的高效誘導型表達系統具有許多優點，nisin介導的誘導型表達系統將細菌的生長和外源基因的高效表達分為兩個階段，相較于組成型表達系統更有利于外源蛋白質的高效表達[54」。誘導型表達系統的核心元件是誘導型啟動子，這些啟動子受到特定條件的刺激啟動功能基因的轉錄表達[5-5]。研究表明加人 nisin 后，可使誘導的效率提高1000 倍以上，作為一種高效的表達系統，可以直接應用于高水平產生穩定的異源蛋白[57-58]。同時，NICE 系統中使用的誘導劑（乳鏈菌肽），宿主細菌和質粒載體均為食品級，充分保證了生物和生態的安全，作為蛋白遞送載體能有效將目的蛋白遞送至作用部位[59]。但L.lactis 表達系統在應用中也遇到一些問題：（1）目的蛋白在菌體中表達了而無法成功分泌到胞外；（2）目的蛋白被細菌自身產生的一些蛋白酶降解[60-62]，Bhrugu Y等[63]構建了表達1型痢疾志賀菌外膜蛋白A（OmpA）的 NICE 系統，在發酵液中檢測到目的蛋白的降解產物，推測目的蛋白是被菌株自身的某種蛋白酶降解，通過加入蛋白酶抑制劑降低了蛋白酶在蛋白表達過程中的影響；（3）不同外源蛋白的表達效率存在差異；（4）構建的表面錨定表達系統中，小分子量蛋白易被L.lactis表面蛋白包裹，影響外源蛋白正常的功能，大分子量蛋白則存在影響表面錨定蛋白的結構的現象，從而影響外源蛋白在 L. lactis表面的展示功能。

對于這些問題可以深人以下研究：（1）對表達系統中啟動子區進一步研究，探究其調控序列的作用機制有助于精準把握對 L ：lactis的定向改造；（2）探尋新型高效可控的啟動子也是很有必要的；（3）有研究表明在L.lactis中 HtrA 蛋白是一種管家蛋白酶，參與細胞表面的蛋白質質量控制，負責清除表面的異常蛋白，可以嘗試突變htrA基因提高蛋白產量;（4）應用基因編輯技術對L.lactis進行改造。

L.lactis作為乳酸菌屬中重要的模式菌株，具有很高的研究價值，并且作為一種有益的腸道微生物，L.lactis兼具食品級表達外源蛋白的功能，對它的特定改造可以滿足人們對于食品制造、醫療健康以及工業生產等領域的需求。隨著基礎學科的研究不斷深人，對L.lactis的探索也會繼續深人下去，對于其食品級表達系統的改造也將更有力地推進工業生產及醫療和健康產業的持續發展。

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［責任編輯：李莉］

Abstract：Lactococcus lactis as a food-grade safe strain， is an excellent host for foreign protein expression.Based on nisin self-inducing expression mechanism，L. lactis NICE expression system is obtained and has been widely used for expression of various foreign proteins with characteristics of high induction effciency， lessself-secreted proteins，and no extracellular protease. By designing different expression elements，the exogenous proteins can be expressed intracelularly，extracellularly or on the cell surface，so as to play its role. This review introduces the construction and inducible expression mechanism of the NICE expression system， and summarizes the research status of recombinant L .lactisin the fields offood industry，medicine and health，and provides a reference for the future application of the L .lactis NICE expression system.

Key words： L. lactis；express foreign protein；nisin controlled gene expression；nisin