混料設計優化羊肚菌固體培養料配方的研究

2025-07-04 00:00:00李淑芳陳曉明高雋丁舒宋洋張志軍

天津農林科技 2025年3期

中圖分類號：S646.7 文獻標識碼：A

羊肚菌，別稱羊肚菜等，為菌物界（Fungi）、子囊菌門（Ascom yco ta）、盤菌亞門（Pezizom y-cotina）、盤菌綱（Pezizomyce tes）、盤菌亞綱（Pezizomycetidae）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（Morchella）的一類食用菌的統稱，常見栽培種為六妹羊肚菌（Morchellasex tela ta）、梯棱羊肚菌（Morchellam portuna） 0-2]。

羊肚菌因子實體內含有豐富的營養物質，尤其是富含多種氨基酸、多糖、礦物質以及微量元素等，加之氣味清香且口感美味，自古作為山珍而備受推崇，是治療失眠、胃腸炎、脾胃虛弱、消化不良等病癥的輔助藥膳食材。現代中醫與營養學認為，羊肚菌還具有化痰理氣、提高免疫力、抗衰老、抗腫瘤、抗誘變、降血脂、預防動脈硬化以及保肝腎功能等多種功效β-4]。近年來，因人工栽培技術的不斷進步，羊肚菌市場火熱β-6，隨之我國羊肚菌栽培規模逐年擴大。在不到10年的時間內，羊肚菌栽培面積增加了近50倍。

固體菌種是我國食用菌產業的傳統菌種形式，應用范圍較廣。在羊肚菌的菌種制種模式中，固體菌種具有制備簡易、設備成本低等優勢，在低溫環境下儲存時間極長且運輸便利，生產過程中易于剔除雜菌污染。我國羊肚菌栽培的主流依然沿用固體培養基擴繁制種，保護地畦土播種，利用外源營養添加技術刺激出菇的基本生產模式[-8]。

目前羊肚菌培養料的基礎配方以小麥粒和雜木屑為主，但小麥粒與雜木屑供應受到糧食與林產業價格波動的影響。本文旨在以大宗農副產品玉米、玉米芯]、麥麩[0-1等作為基礎成分，通過單因子和混料設計優化[2研究，獲得在菌種質量、制種成本等方面均有優勢的羊肚菌固體培養料新配方。

1試驗材料

1.1試驗儀器

85-2數顯恒溫磁力攪拌器，由金壇市瑞華儀器有限公司生產；ZK-26無油真空泵，由杭州米歐儀器有限公司生產；1000Y刀片式粉碎機，由浙江鉑歐電器有限公司生產；微機型pH/mV計，由上海理達儀器廠生產；生化培養箱，由上海一恒科學儀器有限公司生產；T1900紫外一可見分光光度計，由北京普析通用儀器有限責任公司生產；CT62A立式壓力蒸汽滅菌器，由馳通儀器（上海）有限公司（已注銷，2021年）生產；振動式細胞破碎儀，由杰靈儀器（天津）有限公司生產；電熱恒溫鼓風干燥箱，由上海一恒科學儀器有限公司生產。

1.2試驗試劑

生石灰（CaO）、石膏（ CaSO₄?2H₂O ）、（20 MgS0₄?7H₂0 、葡萄糖、三氯乙酸（TCA）、瓊脂粉等，均購自天津市卓新泉化工產品銷售中心。

1.3菌種

試驗菌種為六妹羊肚菌（Morchellasextelata），編號LG-5，來自天津市農業科學院農產品保鮮與加工技術研究所的食用菌菌種室（分離自試驗大田）。該菌種保存于CM培養基的試管斜面中，并在4℃恒溫避光冰箱內保存。使用前在恒溫箱中活化 48h 。

1.4食用菌培養原料

食用菌培養原料為雜木屑、小麥粒、玉米芯、玉米糝、麥麩等，均來自試驗單位倉庫，原料新鮮、干凈、均勻，無霉變及蟲蛀。將食用菌培養原料用刀片式粉碎機粉碎5min，過篩后取 10～20 目篩截留部分，備用。

2試驗方法

2.1 試驗設計

試驗于2019年10月在天津市農業科學院進行。雜木屑麥粒培養料的基礎配方為：雜木屑 40% 、小麥粒 50% 、麥麩 7.5% 、生石灰（CaO）1.5% 、石膏（ CaSO₄?2H₂O"） 1% ]。在此基礎上，設玉米芯替換雜木屑試驗、玉米糝替換小麥試驗、混料設計優化試驗。

2.1.1玉米芯替換雜木屑試驗采用單因素試驗設計，以培養料基礎配方為對照（CK），逐漸增加玉米芯比例以替換雜木屑，其他配料比例保持不變（表1）。各處理重復3次。

2.1.2玉米糝替換小麥粒試驗采用單因素試驗設計，以培養料基礎配方為對照（CK），逐漸增加玉米糝比例以替換小麥粒，其他配料比例保持不變（表2）。各處理重復3次。

2.1.3混料設計優化試驗根據2.1.1、2.1.2單因素試驗結果，選取玉米芯（%）、玉米糝（% ）、麥麩（%）3個因素為自變量，以菌絲平均生長速度（ mm?d^-1"）和培養料中菌絲生物量（ mg?100 ）為響應值，采用Design-Expert10軟件，按單中心點混料設計（S implex-cen tro id M ix ture Design）對固體培養料配方進行優化，共16個處理（表3）。試驗對照（CK）為固體培養料基礎配方。

2.2固體培養料試管制作及菌絲培養條件

2.2.1固體培養料試管制作按2.1.1、2.1.2、2.1.3試驗設計準確稱取培養料，加水，攪拌至水分均勻，填充至 250mm×25mm 的平底大試管中，用搗木壓實，調整培養料表面距試管底部高度 15cm 。用棉塞封口，雙層牛皮紙包扎，在下高壓蒸汽滅菌 120m in，冷卻后稱質量，并在4℃冰箱中保存待接種。

2.2.2母種擴繁及無菌檢查取恒溫活化 48h 后的羊肚菌母種，用接種針挑取少許菌絲，接種于PDA平板上進行擴繁。將接種后的PDA平板置于恒溫培養箱中培養7d，同時對培養基進行無菌檢查。

2.2.3菌絲培養條件當 PDA 平板上的羊肚菌菌落直徑長到 5cm 時，用接種鏟取 5mm² 小塊菌絲，接種于不同試驗組處理的培養料試管中，每管接種1小塊。接種后揭去牛皮紙，在、 90% RH、避光條件下恒溫培養，直至菌絲長至試管底部。根據實際生長情況，當菌絲長滿試管后于15‰ 條件下靜置2d，然后移入4℃冰箱保存。

將羊肚菌菌絲在不同試驗組處理的培養料試管中培養7d，測量并計算羊肚菌菌絲的平均生長速度和生物量。

2.3固體培養料菌絲平均生長速度與生物量的測定2.3.1固體培養料菌絲的平均生長速度培養料接種羊肚菌菌絲后，每隔2d定時用游標卡尺測量各處理菌絲先端距培養料表面的距離，精確到 1mm ，重復測定3次，取平均值。菌絲平均生長速度的計算公式如下：

式中，為菌絲平均生長速度，單位為 mm?d^-1 L₀ 為接種2d（ 48h ）先端菌絲距培養基表面的高度；為每隔2d（ 48h ）先端菌絲距培養基表面的高度。

2.3.2固體培養料菌絲的生物量固體培養料菌絲生物量的測定參考魏培蓮等[3]的研究進行。

（1）標準菌絲制備。用接種針挑取少許經活化后的羊肚菌菌絲，接種于裝有 20mLPDA 培養基的 150mL 三角瓶中，于恒溫搖床中以的轉速培養7d。培養結束后，將內容物傾入墊有200目尼龍濾網的布氏漏斗中抽濾。用蒸餾水沖洗菌絲3次后抽干，置于80℃電熱鼓風干燥箱中烘干至恒質量，干燥后在下保存備用。

（2）標準菌絲液曲線繪制。精確稱取0.02g 標準羊肚菌菌絲，置于 SmL 離心管中，加入 2mL5% 三氯乙酸（TCA）以及少許陶瓷研磨珠，置于細胞破碎儀中處理 5m in，立即投入80℃震蕩水浴中處理 25m in，冰浴冷卻至。在 10 000r?min^-1 轉速、4℃條件下離心15m in，得到標準菌絲上清液，按表4配制標準菌絲液，采用T1900紫外一可見分光光度計在260nm 處測定吸光度值。以不加樣品的三氯乙酸（TCA）作為空白對照（CK）。

（3）固體培養料菌絲生物量的測定。將各組試驗得到的固體培養料菌絲在電熱鼓風干燥箱中烘干至恒質量。混勻培養料菌絲采用四分法取樣，精確稱取 0.1g 固體培養料菌絲于 15mL 離心管中，加入 10mL5% 三氯乙酸（TCA）以及少許陶瓷研磨珠，置于細胞破碎儀中處理 5m in。其他操作同標準菌絲液曲線繪制，取離心后的上清液即可得到固體培養料菌絲液待測。空白對照（CK）為各試驗組的不接種處理。固體培養料菌絲生物量計算公式如下：

式中， X 為羊肚菌菌絲生物量，單位為mg“100g^-1 Y₁ 為固體培養料菌絲液吸光值（AB S）；Y₀ 為空白對照（CK）固體培養料液吸光值（ABS）; C₀ 均為濃度因子1000。

2.3.3菌絲微觀結構的測定取培養容器內菌絲塊約 1cm³ 大小作為檢材，將所取樣品用解剖針在菌絲塊新鮮斷面上挑取菌絲，置于滴棉蘭乳酚油浮載劑中，用光學顯微鏡進行鏡檢。

3結果與分析

3.1不同培養料營養成分比較

比較5種培養料（雜木屑、玉米芯、小麥粒、玉米糝、麥麩）的營養成分[4，可以看出5種培養料的含水量、粗脂肪含量差異較小，粗蛋白、粗纖維和可溶性碳水化合物含量差異較大（圖2）。

由圖2可知，雜木屑和玉米芯兩種培養料在含水量、粗蛋白、粗脂肪含量上幾乎沒有差異，但雜木屑培養料的粗纖維含量高于玉米芯，而可溶性碳水化合物含量低于玉米芯。如按總碳計（即粗纖維與可溶性碳水化合物含量之和），雜木屑和玉米芯兩種培養料幾乎沒有差異，但玉米芯培養料可直接利用的碳水化合物含量較高，因此玉米芯比雜木屑營養更豐富。玉米糝與小麥粒兩種培養料比較，二者的營養成分幾乎沒有差異，但與其他培養料相比，麥麩的粗蛋白含量較高，可溶性碳水化合物含量較低。由此推測麥麩可作為高氮低碳的原料添加到配方培養料中，起到調節培養料碳氮比的作用，同時增加培養料的致密度。

根據培養料碳氮比（圖3）設計原理，培養料組合可能以雜木屑 + 小麥粒 + 麥麩（基礎組合）和玉米芯 + 玉米糝 + 麥麩（新組合）較為合適。

3.2固體培養料單因素替換對菌絲生長速度的影響

在基礎固體培養料配方的基礎上，在玉米芯和雜木屑總量不變的情況下，逐漸增加玉米芯比例以替換雜木屑，保持小麥粒和麥麩比例不變。由表5可知，隨著玉米芯比例的增加，培養料的碳氮比（CN）逐漸減小，羊肚菌菌絲吃料速度均低于對照（CK）。計算函數CORREL相關系數，表明玉米芯添加量與培養料碳氮比值（CN）呈負相關關系（ [1=-0.964] ）， A₁～A₅ 處理相對于對照（CK）為富氮培養料。

同理，在基礎固體培養料配方的基礎上，在玉米芯和雜木屑總量不變的情況下，逐漸增加玉米糝的比例以替換小麥粒，保持雜木屑和麥麩比例不變。由表6可知，隨著玉米糝添加量的逐漸增加，培養料的碳氮比（CN）

逐漸升高，羊肚菌菌絲吃料速度均低于對照（CK）。計算函數CORREL相關系數，表明玉米糝添加量與培養料碳氮比（CN）呈正相關關系（ f=0.967 ），處理相對于對照（CK）為富碳培養料。

3.3固體培養料新配方對羊肚菌菌絲生長的影響

在培養料單因素替換試驗結果的基礎上，考慮富氮培養料不利于羊肚菌菌絲后期發育，故分別選取玉米芯 40%～80% 、玉米糝 10%～50% 、麥麩 10%～50% 為自變量，以菌絲平均生長速度（mm?d^-1），和菌絲生物量（mg?100g^-1）

為響應值，采用軟件，按單中心點混料設計（S imp lex-cen troid Mix tureDesign）優化固體培養料配方，試驗結果見表7。由菌絲平均生長速度！（mm?d^-1））和菌絲生物量（mg?100g^-1 ）2個響應值可知，處理6、16均明顯優于對照CK（表7）。

對培養料優化混料設計的試驗數據進行Scheffe多元回歸擬合，得到羊肚菌菌絲生物量對培養料各成分的二次多項回歸模型方程為公式3。

Y₁=52.95X₁+54.67X₂+51.01X₃-74.99X₁X₂- 34.40X₁X₃-54.71X₂X₃+5372.35X²₁X₂X₃- （204號 1807.73X₁X²₂X₃-527.59X₁X₂X²₃ （3）

羊肚菌菌絲平均生長速度對培養料各成分的實際值回歸模型方程為公式4。

Y₂=15.57X₁+37.04X₂-4.98X₃-73.29X₁X₂+ 21.62X₁X₃-27.17X₂X₃ （4）

由圖4、圖5可以看出，玉米芯對羊肚菌菌絲的生長速度和生物量的貢獻要遠大于玉米糝和麥麩。玉米芯、玉米糝和麥麩三因素交互作用對菌絲生長速度的影響和其對菌絲生物量的影響排序相同，即 X₁X₂ （玉米芯與玉米糝） gt; X₁X₃ （玉米芯與麥麩） gt;X₂X₃ （玉米糝與麥麩）。這說明對于羊肚菌菌絲生長速度和生物量而言，玉米芯的影響作用大于玉米糝和麥麩。這是由于玉米糝雖然含氮量很低，碳水化合物含量很高（玉米淀粉），但在濕潤滅菌過程中，玉米淀粉易糊化，導致培養料通氣不良，從而降低了羊肚菌菌絲的生長速度和生物量。這也解釋了羊肚菌菌絲生物量模型與現實擬合不良的原因。

對兩個回歸模型進行方差分析，并檢驗回歸模型方程系數的顯著性（表8）。結果顯示，玉米芯對羊肚菌菌絲的生長速度和生物量的作用顯著高于玉米糝和麥麩，與圖4、圖5的結論相同。

試驗表明，玉米芯、玉米糝和麥麩三因素混料設計中不同因素不同比例的改變，均會導致培養料碳氮比（CN）的改變。由此可見，玉米芯、玉米糝和麥麩三因素的交互作用對羊肚菌菌絲的生長速度和生物量的影響，即是培養料碳氮比（C/N）對羊肚菌菌絲生長速度和生物量的影響。

使用Design-Expert10軟件的優化功能，設定玉米芯的取值范圍為 60%～80% ，玉米糝與麥麩的取值范圍為 10%～20% 。設響應值生物量取最大值，權重為1；羊肚菌菌絲生長速度取最大值，權重為2，對回歸模型進行優化。

如圖6所示，經模擬，玉米芯培養料最優配方為：玉米芯 80% 、玉米糝 10% 、麥麩 7.5% ！生石灰（Ca0） 1.5% 、石膏（）1% 。在此培養料條件下，羊肚菌菌絲生物量預測值為 52.95mg?100g^-1 ，菌絲生長速度應為11.5mm?d^-1 。經實踐驗證，最優培養料配方得到的羊肚菌菌絲生長速度為 12.0mm?d^-1 菌絲生物量為 48.28mg?100g^-1 ，比基礎配方（羊肚菌菌絲生長速度為 10.8mm?d^-1 、菌絲生物量為 40.40mg?100g^-1）分別提高 11% 和 19% 。

3.4培養料基礎配方與新配方對菌絲萌發的影響

培養料基礎配方為：雜木屑 40% 、小麥粒50% 、麥麩 7.5% 、生石灰（Ca0） 1.5% 、石膏C ） 1% ；培養料新配方為：玉米芯 80% 、玉米糝 10% 、麥麩 7.5% 、生石灰（Ca0）1.5% 、石膏（（as0₄?2H₂0 ） 1% 。培養料新配方與基礎配方的羊肚菌菌絲結構、萌發特性等均相同（圖7）。

4結論

羊肚菌固體培養料的配方設計應綜合考慮菌絲生長曲線和最終菌絲生物量指標、原料營養成分與物性特點、市場價格和運輸費用等，結合碳氮比（CN）在物料組合中所起的交互作用，以優化獲得固體培養料的生產配方。本文為羊肚菌固體培養料的選擇和優化提供了可行方案，并得到一個適用于羊肚菌生長的固體培養料新配方，即玉米芯 80% 、玉米糝 10% 、麥麩 7.5% 、生石灰（Ca0） 1.5% 、石膏（ CaSO₄?2H₂O ） 1% ，含水量 65% ，在121℃下高壓蒸汽滅菌 120m in。在培養溫度為時，采用培養料新配方培養的羊肚菌菌絲平均生長速度為 12.0mm?d^-1 ，菌絲生物量為 48.28mg?100g^-1 。培養料新配方在羊肚菌菌絲生長速度、持水能力與菌絲生物量等方面均優于培養料基礎配方。