一株半滑舌鰨源鰻弧菌的分離鑒定及藥敏試驗

中圖分類號：S941.41 文獻標志碼：A 文章編號：1004—6755（2025）06—0037—0

Isolation，identification，and antibiotic susceptibility testing of Vibrio anguillarum from Cynoglossus semilaevis

GUYing1，LIANGChen2，LIChangjian1，FUGuanghui1，LULu1， WANGChao1，YERenzhi1，SUNMiaomiao1

（1.Marine and Fisheries Development Promotion Center of Lianyungang City，Lianyungang 22ooo，China; 2.School of Marine Science and Fisheries，Jiangsu Ocean University，Lianyungang 222ooo，China）

Abstract：A dominant strain， ST7， was isolated from diseased Cynoglossus semilaeuis and identified as Vibrio anguillarum through morphological characteristics， physiological and biochemical tests，and 16S rRNA molecular analysis. Additionally，the isolated strain was subjected to antibiotic susceptibility testing with 3O antimicrobial agents. The results demonstrated that ST7 exhibited high sensitivity to the following antibiotics： piperacilin， midecamycin，polymyxin B，trimethoprim/sulfamethoxazole （TMP/SMZ），ciprofloxacin，norfloxacin，ofloxacin，doxycycline，minocycline，tetracycline，cefuroxime，cefoperazone，ceftriaxone，ceftazidime，chloramphenicol，and furazolidone.

Key Words：Cynoglossus semilaeuis ； Vibrio anguillarum ； isolation and identification; antibiotic sus-ceptibility testing

半滑舌鰨（Cynoglossussemilaevis）俗稱牛舌頭、鰨目、龍胴等，在分類學上屬鰈形目（Pleu-ronectiformes），舌鰨科（Cynoglossidae），舌鰨屬，廣泛分布于中國、日本、朝鮮近海以及俄羅斯遠東海域[]。半滑舌鰨具有環境適應性強、養殖周期短、肉質鮮美、出肉率高、營養豐富、經濟價值高等優點，已成為我國重要的商業養殖魚類品種之一[2-3]。然而隨著半滑舌鰨養殖規模的不斷擴大，細菌性疾病頻發給舌鰨養殖業造成了巨大的經濟損失，相關研究表明，創傷弧菌（Vibriovulnificus）[3]、維羅納假單胞菌（Pseudomonasveronii）[4]、溶藻弧菌（V.alginolyticus）[5]、美人魚發光桿菌（Photobacteriumdamselae）[6]、殺鮭氣單胞菌（Aeromonassalmonicida）[7]、海藻希瓦氏菌（Shewanellaalgae）[8]、熒光假單胞菌（ P fluorescens）[9]、魚腸道弧菌（V.ichthyoen-teri）[10]、哈維氏弧菌（V.harueyi）[10]、海豚鏈球菌（Streptococcusiniae）[ii]以及副溶血弧菌（ V parahemolyticus）[12]等均可導致半滑舌鰨患病甚至死亡，嚴重制約了半滑舌鰨養殖業的綠色健康發展。

本研究從患病半滑舌鰨病灶處分離出一株優勢菌，并對其進行形態觀察、生理生化鑒定、分子鑒定和藥敏試驗，以期為半滑舌鰨細菌病的研究和防控提供參考。

1材料與方法

1.1 試驗材料

TCBS瓊脂培養基、2216E瓊脂培養基、細菌生化鑒定管（青島海博生物技術有限公司）；革蘭氏染色液試劑盒（常德比克曼生物科技有限公司）；細菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；藥敏紙片（杭州濱河微生物試劑有限公司）。

1.2 患病半滑舌鰨

患病半滑舌鰨來自連云港贛榆區某養殖場，體質量 306g/ 尾。患病魚癥狀表現為鰓蓋出血、皮膚、肝臟充血發紅等。

1.3 病原菌的分離鑒定

1.3.1病原菌的分離及純化

取患病半滑舌鰨，用 75% 酒精進行體外消毒后解剖，挑取患病魚體表發紅肌肉、肝、鰓絲、腸道等組織，劃線接種于2216E平板和TCBS平板上， 28^°C 培養 24h 后挑取形態一致的單個菌落進行純化培養，直至得到單一優勢菌株，暫命名為ST7，添加甘油后于 -80°C 保存。

1.3.2生理生化鑒定

將菌株ST7接種于216E平板和TCBS平板上， 28^°C 培養 24h 后，觀察其菌落形態，同時挑取單菌落接種于細菌生化反應管中，參照《常見細菌系統鑒定手冊》[13]對菌株進行生理生化鑒定。

1.3.3 分子鑒定

利用細菌基因組提取試劑盒提取菌株ST7的基因組DNA，并對其16SrRNA進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增。PCR的擴增條件為 94^°C 72°C10min ，共35個循環。PCR產物由上海邁浦生物科技有限公司測序。利用NCBI的BLAST對16SrRNA基因序列進行同源性比較，使用MEGA5.O軟件采用鄰接法（Neighbor一joining，重復度F1000）構建系統發育樹。

1.4 藥敏試驗

采用紙片擴散法檢測菌株ST7對30種抗生素的敏感性，每個藥物設3個重復， 28^°C 培養24h 后測量抑菌圈直徑，并根據《細菌真菌藥敏試驗標準查詢手冊》[14]判斷菌株的藥物敏感性。

2 結果與分析

2.1 菌株形態特征

28°C 培養 24h 后，菌株在TCBS培養基上的菌落為圓形、略微凸起、光滑、濕潤、邊緣整齊的黃色菌落；在2216E培養基上的菌落為圓形、略微凸起、光滑、濕潤、邊緣整齊的乳白色菌落。

2.2菌株生理生化鑒定

生理生化結果（表1，見下頁）顯示，菌株ST7吲哚試驗、 V-P 試驗、過氧化氫酶、氧化酶、精氨酸雙水解酶、檸檬酸鹽、硝酸鹽還原、淀粉酶、脲酶等均呈陽性；脂酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、丙二酸鹽、苯丙氨酸、硫化氫產生、DNA酶等均呈陰性；能發酵蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、甘露糖、海藻糖、果糖；不能發酵阿拉伯糖、肌醇、乳糖、水楊苷、棉子糖、鼠李糖。上述菌株ST7的生理生化特性與鰻弧菌的生理生化特性基本一致。

2.4 藥敏試驗

菌株ST7的抗生素敏感性如表2所示（見下頁）。菌株ST7對3O種抗生素中的哌拉西林（piperacillin）、麥迪霉素（midecamycin）、多黏菌素B（polymyxinB）、復方新諾明（trimethoprim/sulfamethoxazole，TMP/SMZ）、環丙沙星（ciprofloxacin）、諾氟沙星（norfloxacin）、氧氟沙星（ofloxacin）、多西環素（doxycycline）、米諾環素（minocycline）、四環素（tetracycline）、頭孢呋辛（cefuroxime）、頭孢哌酮（cefoperazone）、頭孢曲松（ceftriaxone）、頭孢他啶（ceftazidime）、氯霉素（chloramphenicol）和呋喃唑酮（furazolidone）16種藥物高度敏感，對阿米卡星（amikacin）、卡那霉素（kanamycin）、慶大霉素（gentamicin）、新霉素（neomycin）、羧芐西林（carbenicillin）、紅霉素（e-rythromycin）、頭孢唑林（cefazolin）7種藥物中度敏感，對氨芐西林（ampicillin）、苯唑西林（oxacil-lin）、青霉素（penicillin）、萬古霉素（vancomycin）、克林霉素（clindamycin）、頭孢氨芐（cefalexin）和頭孢拉定（cefradine）7種藥物具有耐藥性。

2.3分子生物學鑒定

菌株ST7的16SrRNA基因序列與GenBank數據庫中鰻弧菌的同源相似性最高，達到99.79% ，系統發育樹（圖1）顯示菌株ST7與鰻弧菌聚為一支。

綜合菌株ST7的形態、生理生化特征及分子鑒定結果，判定菌株ST7為鰻弧菌。

3討論

鰻弧菌（Vibrioanguillarum）隸屬于弧菌科（Vibrionaceae），弧菌屬（Vibrio），是水產養殖中常見的致病性較強的機會致病菌，在水質惡劣、魚體受傷等不利情況下會誘發養殖動物患病[15-16]。鰻弧菌可通過皮膚、鰓以及腸道組織等侵入養殖動物，主要通過外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外酶、鐵吸收系統、溶血素等毒力因子對養殖動物產生致病性[16-17]。據報道，鰻弧菌能夠引起松江鱸（Tra-chidermusfasciatusHeckel）[16]、多紋錢蝶魚（Selenotocamultifasciata）[i7]、大口黑鱸（Mi-cropterus salmoides）[18]、凡納濱對蝦（Litopenae-us uannamei）[19]、半滑舌鰨[20]、大菱鲆（Scoph-thalmus maximus ）[21]、虹 鱒（Oncorhynchusmykiss）[22]、歐洲鰻（Anguilla anguilla）[23]斜帶石斑魚（Epinepheluscoioides）[24]、方斑東風螺（Babylonia areolata）[25]、花鱸（Lateolabraxmaculatus）[26]、丁（Tinca tinca）[27]等多種水生生物感染發病，對水產養殖業具有較大危害性。大口黑鱸感染鰻弧菌的主要癥狀是體表及肝臟出血[18]，大菱鲆感染鰻弧菌的主要癥狀為鰓蓋、體表有出血點，腹腔膨脹有積液，肝臟、脾臟充血或出血，腸道內有淡黃色黏液[21]，本研究中發病半滑舌鰨的癥狀與大口黑鱸、大菱鲆感染鰻弧菌后相似。

目前，控制水產養殖動物疾病的主要手段仍是使用抗菌藥物[24]，夏蘇東等[16]研究發現，松江鱸源鰻弧菌SJL一1對慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素（tobramycin）、新霉素、新生霉素（novobiocin）5種抗生素高度敏感，饒穎竹等24研究發現，斜帶石斑魚源鰻弧菌M1對慶大霉素、新生霉素、阿奇霉素（azithromycin）、氟苯尼考（florfenicol）、利福平（rifampicin）、諾氟沙星和左氧氟沙星（levofloxacin）等7種抗生素高度敏感，本試驗中菌株ST7對哌拉西林、麥迪霉素、多黏菌素B、復方新諾明（TMP/SMZ）、環丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、多西環素、米諾環素、四環素、頭孢呋辛、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢他啶、氯霉素和呋喃唑酮16種抗生素高度敏感。我國農業農村部批準使用的水產養殖用抗菌藥物有13種，包括本研究中菌株ST7高度敏感的復方磺胺甲噁唑片（復方新諾明，TMP/SMZ）、環丙沙星預混劑、鹽酸多西環素粉等，因此，在生產中可適度選用復方新諾明（TMP/SMZ）、環丙沙星和多西環素等抗菌藥物來控制半滑舌鰨的鰻弧菌病。

參考文獻：

[1]武尊，吳雅婷，高浩峰，等.1例半滑舌鰨出血病病原的分離鑒定及藥敏試驗分析[J].經濟動物學報，2022，26（4）：310-318.

[2]李萌，孫紹永，孫福先，等.凡納濱對蝦池塘套養不同規格半滑舌鰨對比試驗[J].河北漁業，2024（10）：35—37，46.

[3]劉勃興，崔舒暢，任海，等.致半滑舌鰨爛尾病的創傷弧菌的分離鑒定及中草藥對其抑菌效果研究［J].中國預防獸醫學報，2021，43（5）：489-494.

[4]葡寶珠，趙露，王浩伊，等.半滑舌鰨源維羅納假單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].大連海洋大學學報，2023，38（6）：987-993.

[5]李彬，彭樹德，白和平，等.半滑舌鰨源溶藻弧菌的分離鑒定[J].特種經濟動植物，2023，26（8）：8-10.

[6」何曉旭，劉克明，汪笑宇，等.半滑舌鰨套腸癥病原的分離鑒定和組織病理觀察［J].大連海洋大學學報，2022，37（1）：19—25.

[7]周紅霞，姚俊杰，房文紅，等.半滑舌鰨潰瘍病原殺鮭氣單胞菌的分離鑒定與藥敏試驗[J].海洋漁業，2017，39（3）：322-330.

[8]HAN ZR，GELH，WENSY，et al.Dysfunction of the in-testinalphysical barrier inthe intestinal inflammationoftongue sole，Cynoglossussemilaeuis，inducedbyShewanellaalgaeinfection.[J].Fishamp;ShellfishImmunology，2023，139（8） ：108900.

[9]高桂生，張艷英，吉志新，等.半滑舌鰨致病性熒光假單胞菌的分離鑒定及其感染的病理損傷J].中國獸醫學報，2016，36（7）：1145—1150.

[10]徐曉麗，邵蓬，李賀密，等.半滑舌鰨體表潰瘍病病原的分離鑒定[J].中國海洋大學學報（自然科學版），2015，45（11）：29-35.

[11]徐曉麗，尤宏爭，宋昀鵬，等.半滑舌鰨腹水癥病原的分離鑒

定[J」.東北農業大學學報， 2015，46（3）：74-80

[12]胡璇，孫敬鋒，陳成勛，等.養殖半滑舌鰨腹水病的病原分離鑒定及藥物敏感性分析[J].天津農學院學報，2014，21（3）：12-16.

[13]東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[14]胡付品，吳文娟，郭燕.細菌真菌藥敏試驗標準查詢手冊[M].上海：上海科學技術出版社，2020.

[15］韓森.半滑舌鰨響應鰻弧菌感染的基因可變剪接分析與結合珠蛋白不同亞型功能研究[D].青島：青島大學，2024.

[16］夏蘇東，尤宏爭，李楠，等.養殖松江鱸鰻弧菌的分離鑒定及藥敏試驗［J].浙江海洋大學學報（自然科學版），2020，39（3）：264-269.

[17]闕莉文，楊林狄，涂祖豪，等.多紋錢蝶魚潰瘍病病原的分離鑒定及藥敏試驗［J].大連海洋大學學報，2024，39（3）：392-401.

[18]李媛媛，蔡琰，張連英，等.大口黑鱸源鰻弧菌的分離鑒定[J].淡水漁業，2023，53（3）：46-53.

[19］沈會俞.鰻弧菌侵染過程中凡納濱對蝦腸道菌群的響應及拮抗菌的篩選[D].寧波：寧波大學，2022.

[20］徐倩.鰻弧菌感染半滑舌鰨炎癥模型中組織病理損傷及炎癥因子表達分析[D].青島：青島大學，2022.

[21］欒林林，張永剛，王鳳軍，等.大菱鲆源鰻弧菌的分離鑒定及藥敏分析[J].飼料工業，2018，39（22）：60-64.

[22] CEYLAN M，DUMAN M，INAN S，et al. The study ofhistopathologic changes of experimental infection with Lis-tonella （Vibrio） anguillarum in rainbow trout[J]. Journalof Research in Veterinary Medicine，2019，38（1）：59-66.

[23]CONFORTOE，VILCHEZ GOMEZ L，PARRINELLO D，et al.Role of mucosal immune response and histopathologi-cal study in European eel （Anguilla anguilla L.） intraper-itoneal challenged by Vibrio anguillarum or Tenacibaculumsoleae[J].Fish amp; Shelfish Immunology，2021（114）：330-339.

[24］饒穎竹，梁靜真，陳蓉，等.海水養殖斜帶石斑魚致病性鰻弧菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].南方農業學報，2016，47（8）：1416—1422.

[25]張新中，文萬僥，馮永勤，等.方斑東風螺腫吻癥病原菌的分離鑒定及藥敏分析[J].海洋科學，2010，34（5）：7-12.

[26]姜維.溶血因子缺失對鰻弧菌感染花鱸致病性及免疫響應的影響[D].上海：上海海洋大學，2023.

[27]李雪峰，王利，王海娟，等.丁鮭魚鰻弧菌16SrDNA基因及耐藥性分析[J].中國畜牧獸醫，2014，41（9）：235－239.

（收稿日期：2024-03-06）